Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Detta arbete är en del av de nationella kooperativa omprogrammerade cell forskargrupper (NCRCRG) för att studera psykisk sjukdom och stöddes av NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det inledande arbetet stöddes också av NIH Grant NS070297. Vi tackar DRS. Carol Marchetto och fred Gage, den Salk Institute, för att tillhandahålla WT 126 linje av neurala stamceller, och DRS. Eugene Yeo och Lawrence Goldstein, UC San Diego för att tillhandahålla CVB WT24 linje av neurala stamceller. Vi tackar Deborah pre i laboratoriet för Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, för användbara diskussioner.

1. differentierings period före
<ol><li>Differentiera nervceller på 10 cm rätter, med hjälp av ett protokoll av val7,8 tills neuroner har bildat ett tjockt nätverk med sina processer och uttrycker inte bara tidiga neuronala markörer som MAP2 eller TuJ1, men också sena markörer som Neun.</li>
	<li>
Ändra halva mediet val var 4 dagar under neuronala differentierings processen. Obs: mer omfattande eller frekventa medium förändringar ...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Vi har visat en rättfram förfarande för resuspension och återskapande av mänskliga neuronala kulturer som optimerar lönsamheten, differentiering framgång, och subcellulär avbildning på ett sätt som är förenligt med hög innehåll screening plattformar, och andra analyser som är relevanta för läkemedels upptäckt. Figur 6 illustrerar det övergripande arbetsflödet och exempel på sådana program.
Även här fokuserade vi på hiPSC-härledda nervcell...

Human pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda nervceller är alltmer relevanta inom områdena grundforskning, läkemedelsutveckling, och regenerativ medicin. Arbetsflöden och förfaranden för att optimera sin kultur och underhåll, och förbättra effektiviteten av differentiering i specifika neuronala subtyper, utvecklas snabbt1,2. För att förbättra nyttan och kostnadseffektiviteten av mänskliga stamceller-härledda neuroner som modellsystem mottagliga för hög innehållsanalyser i Drug discovery och Target validering, är det lämpligt att minska den odlings tid som krävs för att generera mogna, funktionella nervceller, samtidigt bibehålla maximal robusthet, reproducerbarhet, och fenotyp relevans. Även om 3-dimensionell Organoid kulturer driver genombrott i neuroutveckling forskning3, 2-dimensionella enskiktslager kulturer är särskilt förenliga med automatiserade Imaging-baserade applikationer på grund av deras minimala vävnad tjocklek.
Anpassningen av avbildningsbaserade screeningmetoder till modeller av mänskliga neurologiska och neuroutvecklingsrelaterade sjukdomar står dock inför en stor utmaning. Den långvariga tidsram över vilken människans nervsystem mognar in vivo kräver förlängd tid i kulturen för att rymma naturliga program av genuttryck och uppnå neuronala mognad.
En praktisk konsekvens av den långa neuronala differentierings program är att upprätthållandet av hipsc-härledda enskiktslager kulturer måste upprätthållas i många veckor för att uppnå adekvat synaps mognad. Under denna tid, neurala progenitorer som förblir odifferentierade fortsätta att dela. Dessa kan snabbt överodla kulturen och tillskriva näringsinnehållet som krävs för att upprätthålla livskraftiga postmitotiska neuroner. Kraftigt dividera neurala stamceller (NPCs) kan också konkurrera med nervceller för tillväxt substrat. Detta kan göra sådana kulturer föremål för problem med dålig vidhäftning, ett tillstånd olämpligt för Imaging-baserade analyser. Dessutom, många utredare tycker att ju mindre kulturen volymen, desto större är svårigheten att upprätthålla friska populationer av differentierade neuroner tillräckligt länge för att Observera de sena stadierna av neuronala differentiering. Med andra ord, analyser av synapsen mognad med hög innehåll screening (HCS) metoder kan vara mycket utmanande för människa-härledda nervceller.
För att kringgå några av dessa problem, ett förfarande för resuspenering och återför ande tidigare differentierade hiPSC-härledda nervceller har använts. För det första, det tillåter studiet av neurit utväxt (eller, mer exakt, neurit förnyelse) i en population av fullt engagerade nervceller. För det andra, återplantering av tidigare differentierade neuroner från en stor volym format (som 10 cm plattor eller större), ner till små volym format (som HCS-kompatibla 96-eller 384-väl mikrotiter plattor) möjliggör en signifikant minskning av den totala odlings tiden i det lilla volym tillståndet. Detta underlättar studiet av synapsen församling och mognad under efterföljande veckor in vitro-.
Emellertid, den återplaning av mogna nervceller som redan har etablerat långa neuriter och en komplex anslutning nätverk presenterar flera utmaningar, varav en är den ibland höga och rörliga frekvensen av celldöd. Här beskriver vi ett replating förfarande som resulterar i utmärkt cellöverlevnad och reproducerbarhet. Vanligtvis, neuroner utsätts för proteolytiska enzymer för korta inkubationstider (typiskt ~ 3-10 min) för att lossa celler från underlaget före triturering. Denna korta proteolys tid används vanligtvis för att omlägga och passaging många typer av skiljande celler, inklusive icke-neuronala celler och odifferentierade stamceller4,5,6. Emellertid, för differentierade nervceller som bär långa, sammankopplade neuriter, det är viktigt att inte bara lossa celler från underlaget utan också att störa dendritiska och axonala nätverk för att isolera enskilda celler samtidigt minimera skador. Faktum är att en tjock meshwork av nervceller tenderar oftast att lossa från underlaget som ett enda ark, snarare än som enskilda celler. Om försiktighet inte vidtas för att lossa det tjocka nätet av neuriter, nervceller inte bara bli oåterkalleligt skadas under trituration, men många av dem misslyckas med att passera genom filtret används för att ta bort klumpar, vilket resulterar i dålig cell avkastning. Nedan beskriver vi en enkel modifiering av en allmänt använd proteasinkubations procedur för att motverka dessa svårigheter.
I protokollet som beskrivs nedan, neuroner inkuberas för 40-45 min med en mild proteas, såsom proteolytiska enzymet (t. ex., Accutase). Under de första 5-10 min efter tillsats av enzymet, lyfter neuronala nätverk bort från underlaget som ett ark. Inkubering med proteasen fortsätter för ytterligare 30-40 min innan du fortsätter med mild sönderdelning och filtrering. Denna extra inkubationstid hjälper till att säkerställa att nedbrytning av materialet slappnar av det intercellulära nätverket, vilket säkerställer att efterföljande sönderdelning ger en suspension av enskilda celler. Denna procedur maximerar likformigheten i cell fördelningen vid återplaning och minimerar celldöd. Vi har framgångsrikt tillämpat denna replating metod för att hipsc-härledda neuronala kulturer som genereras av olika differentiering protokoll7,8 och från olika rader av hipscs. Förfarandet är nominellt lämplig för användning med de flesta eller alla rader av stamceller härledda nervceller. Vi har konstaterat att en förlängd inkubationstid för proteas inte är absolut nödvändig för att återplantera kulturer från små format plåtar (t. ex. 35 mm diameter). men, som vi visar här, det ger en betydande fördel när återplaning från stora diameter plattor (t. ex., 10 cm diameter eller större), förmodligen för att neuriter i sådana plåtar kan förlänga mycket långa processer och bildar en tätt sammankopplade array.
Här visar vi denna metod och kortfattat illustrera dess tillämpning i analyser för tidig neuritogenes och för synapsen mognad, vilket innebär klustring av pre-och postsynaptiska proteiner längs dendriter och axoner, följt av deras senare colocalization på synaptiska platser. Exemplen belyser de fördelar som detta protokoll erbjuder för att bevara cellernas lönsamhet och reproducerbarhet. Först, det tillåter utredare att studera tidiga steg i mänskliga neuritogenes. Den experimentella inställningen liknar de vanligaste primära kulturerna av gnagare kortikala eller Hippocampus nervceller, där celler extraheras från sena foster eller tidig postnatal hjärna, dissocierade av sönderdelning efter mild proteasbehandling, och får initiera neuriter eller att återskapa neuriter som avskiljdes i förfarandet9,10. Liknar sådana gnagare primära nervceller, hipsc-härledda nervceller börjar bilda eller regenerera sina neuriter inom några timmar efter att ha återfått, vilket möjliggör avbildning av tillväxt koner och påverkar morfologi i en miljö som är optimal för hög spatiotemporal avbildning med färre omgivande odifferentierade celler. Vi har observerat att påverkar utväxt är mer synkroniserad jämfört med de rörliga förseningar och olika utväxt priser sett när neuroner först börja skilja från en stamfader population. Dessutom, replating möjliggör analyser av nervceller uttrycker neuronala subtyp markörer som typiskt visas senare i neurala utveckling, såsom kortikala lagret 5/6 transkription Factor CTIP2 (kyckling äggalbumin uppströms promotor transkription faktor-interagerande protein 2), eller den pan-neuronala markören NeuN11. En särskilt användbar funktion i den replating tillvägagångssätt är att synaptogenes vinning inom en tidsram kompatibel med HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

Neuroner åtskilda i tvådimensionell kultur från mänskliga pluripotenta stamceller-härledda neurala stamceller (NPCs) utgör ett kraftfullt modellsystem för att utforska sjukdomsmekanismer och utföra hög innehåll screening (HCS) att förhöra sammansatta identifiera gen Mutations fenotyper. Men med mänskliga celler övergången från NPC till funktionella, mogna neuron kräver flera veckor. Synapser börjar vanligen bildas efter 3 veckors differentiering i enskiktslager kultur, och flera neuron-specifika proteiner, till exempel den senare uttrycker Pan-neuronala markör Neun, eller lagret 5/6 cerebral kortikala neuron markör CTIP2, börja uttrycka cirka 4-5 veckor efter differentiering. Denna långa differentierings tid kan vara oförenlig med optimala odlingsförhållanden som används för små volymer, multi-well HCS-plattformar. Bland de många utmaningar är behovet av väl följs, jämnt distribuerade celler med minimal cell kluster, och kultur förfaranden som främjar långsiktig lönsamhet och funktionell synaps mognad. En metod är att skilja nervceller i en stor volym format, sedan replate dem vid en senare tidpunkt i HCS-kompatibla multi-brunnar. Vissa stora utmaningar när man använder denna replating tillvägagångssätt gäller reproducerbarhet och cellernas lönsamhet, på grund av stressande störningar i dendritiska och axonala nätverk. Här visar vi en detaljerad och tillförlitlig förfarande för enzymatiskt resuutgifterna Human inducerad pluripotenta stamceller (hipsc)-härledda nervceller efter deras differentiering för 4-8 veckor i en stor volym format, överföra dem till 384-väl i mikrotiterbrunnarna och odlade dem i ytterligare 1-3 veckor med utmärkt cellöverlevnad. Detta återskapande av mänskliga nervceller inte bara tillåter studiet av synapsen församling och mognad inom två veckor från att replating, men också möjliggör studier av neurit förnyelse och tillväxt kon egenskaper. Vi ger exempel på skalbara analyser för neuritogenesis och synaptogenes med en 384-well plattform.

Den replating av hiPSCs-härledda nervceller som har differentierats för flera veckor erbjuder flera fördelar. Men, koppla loss och replating differentierade nervceller som har långa, sammankopplade dendriter och axoner (figur 1A) kan resultera i en hög fraktion av oåterkalleligt skadade nervceller.
Som beskrivs i avsnittet protokoll, vi använde inkubering med ett proteolytiskt enzym för att lossa nervceller från underlaget. Typiskt, på g...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Detta protokoll beskriver ett detaljerat förfarande för ombildning och odling av mänskliga stamceller härledda nervceller som tidigare var differentierade från neurala progenitorer in vitro för flera veckor. Förfarandet underlättar Imaging-baserade analyser av neuriter, synapser, och sena uttrycker neuronala markörer i ett format som är förenligt med ljusmikroskop och hög innehåll screening.

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Detta protokoll underlättar användningen av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening applikationer. Det är särskilt väl lämpad för assaying synapser, som i mänskliga nervceller kräver långa kulturperioder. Vi visar omplating av nervceller från stora format rätter i HCS-kompatibla multi wells på ett sätt som bevarar deras livskraft.Kontraintuitivt visar vi att utvidga proteas inkubation före resuspending och replating avkastning förbättrad neuronal överlevnad. Mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller är allt mer relevanta inom områdena grundforskning, läkemedelsutveckling, och degenerativ medicin. Denna milda titreringsmetod kan användas för att återanvända alla stora mono-lager av celler som har ett tjockt nätverk av processer.Förutom mänskliga iPSCs, det kan användas för att replate kultur av primära nervceller eller att återanvända dem för fakta sortering eller encellssekvensering. Det är viktigt att följa protokollen steg noggrant och ofta övervaka proteas medierad lossnar av nervceller från plattan. Den optimala inkubationstiden kan variera, beroende på kulturen.Visuell demonstration gör det möjligt för även oerfarna utredare att återskapa detta förfarande. Börja med att försiktigt skölja plattan av differentierade nervceller med PBS. Skingra PBS ner väggen av plattan och inte direkt på cellerna för att undvika att störa dem.Aspirera PBS från kanten av skålen medan tippa den, var noga med att inte röra cellerna. Applicera minst en milliliter proteolytisk enzym per 10-centimeters platta. Och återför cellerna till inkubatorn i 40 till 45 minuter.Under inkubationen, kontrollera nervceller på en fasad kontrast mikroskop och fortsätta proteas behandlingen tills det neurala nätverket helt lossnar från plattan och börjar bryta isär. När nervcellerna har lossnat, stoppa matsmältningen genom att lägga till fem milliliter färska DEMEM media för varje milliliter proteas. Använd en serologisk pipet för att försiktigt titrera cellerna mot plattan fem till åtta gånger, se till att inte tillämpa för mycket tryck.Sila cellerna genom ett 100 mikrometernät i ett 50 milliliter koniskt rör, dropp för droppe. Och skölj silen med ytterligare fem milliliter färska DMEM-medier. Använd en bänk-top centrifugera för att snurra cellerna ner på 1000 gånger G i fem minuter.Efter centrifugeringen, returnera det koniska röret till biosäkerhetsskåpet och aspirera de flesta av medierna, vilket lämnar 250 mikroliter för att hålla cellerna fuktiga. Försiktigt återanvända cellerna i två milliliter av färska DMEM media sedan passera dem genom slutet av en fem milliliter serologiska pipett. Slutligen invertera röret två till tre gånger.Använd en hemocytometer och tripan blå för att räkna de livskraftiga cellerna. Och sedan DMEM till önskad koncentration. Lägg lämpliga kosttillskott till röret, beroende på kraven i den specifika cellinjen och blanda försiktigt cellerna genom att luta koniska röret två till tre gånger.Aspirera lamininbeläggning från en 24-brunnsplatta och skölj den en gång med PBS. Aspirera PBS. Och tillämpa celllösning på varje brunn i en figur åtta rörelse för att undvika klumpar.När du är klar med att plätera cellerna, returnera plattan till inkubatorn inställd på 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Kort virvel stamlösningen av den tidiga celldödsreportern och lägg den till brunnarna enligt manuskriptriktningarna. Vänta i 20 minuter.Och sedan bild levande och döda celler på glas botten multi brunnar. Förlänga proteas inkubation tillåter uppluckring av neuronala nätverket inom den lyftna ark av celler. Detta resulterar i minskad celldöd vid tidpunkten för dissociation samt resulterar i effektivare återhämtning under de följande dagarna.Med hjälp av det utökade inkubationsförfarandet för enzymer uppvisar kulturerna en ungefärlig fördubbling av cellens livskraft under dagarna efter omplatning och en lägre densitet av döda eller döende celler. Övergångsfasen av neuronal differentiering sker under flera dagar, under vilken cellerna gradvis uttrycka sent stadium neuronala markörer. Dessa markörer omedelbart upptäcks i kulturer som var replated efter fyra veckor av pre-differentiering.Det utökade proteasprotokollet förstärker också måttligt neuride utväxt. Både totala neuride längd och dendrit tillväxt förbättras. Omplätning är också användbart för att studera synapser.Bara en vecka efter omplatning observerades markörer för pre- och post-synaptiska proteiner. Dessutom är elektrisk aktivitet från spontan depolarisering och synaptically-driven strömmar detekterbara med kalcium imaging eller multielektrod arrayer. Detta omplatningsförfarande kan anpassas till många typer av applikationer.Förutom hög innehåll screening för att identifiera potentiella terapeutiska föreningar, det kan användas för imaging tillväxt kottar eller multielektrod array inspelningar. Mekanisk dissociation av nervceller som redan har bildat långa processer är stressande. Avlånga enzymatisk inkubation och skonsam titrering av celler är väsentliga steg för att lyckas med detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga neurala stamceller och nervceller från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metod för hög hastighet Stretch skada av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller i en 96-väl Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Uppdelning av mänskliga stamceller-härledda neuroner inom förmonterade plast Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humana neuroner och oligodendrocyter från pluripotenta stamceller för modellering av neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...