Name: post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Bu çalışma, ulusal kooperatif yeniden programlanmış hücre araştırma gruplarının (NCRCRG) akıl hastalığını incelemek için bir bileşenidir ve NIH grant U19MH1 2015-0644 tarafından desteklenmiştir. İlk çalışmalar da NIH hibe NS070297 tarafından desteklendi. Biz Dr Carol Marchetto ve Fred Gage, Salk Enstitüsü, nöral ata hücrelerinin WT 126 hattı sağlamak için teşekkür ederim, ve Dr Eugene Yeo ve Lawrence Goldstein, UC San Diego nöral ata hücrelerinin CVB WT24 hattı sağlamak için. Biz Yararlı tartışmalar için Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Tıp Discovery Enstitüsü, laboratuvarda Deborah Pre teşekkür ederiz.

1. Replating Öncesi Farklılaşma Dönemi
<ol><li>10 cm yemekleri üzerinde nöronlar ayırt, seçim bir protokol kullanarak7,8 nöronlar süreçleri ile kalın bir ağ oluşturmuş ve MAP2 veya TuJ1 gibi sadece erken nöronal belirteçleri ifade kadar, ama aynı zamanda NeuN gibi geç belirteçleri.</li>
	<li>
Nöronal farklılaşma işlemi sırasında her 4 günde bir tercih edilen ortamın yarısını değiştirin. NOT: Daha kapsamlı ve...

<ol>
	<li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation:+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research.">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li><li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).</li><li>Amin, N. D., Pa&#351;ca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids.">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li><li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Cell Culture. , (2010).</li><li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).</li><li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li><li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology.">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li><li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuN,+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates.">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li><li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms.">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li><li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+induction+of+dorsal,+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors.">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li><li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols.">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells.">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li><li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling.">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays.">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).</li><li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).</li><li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+of+primary+neurons:+ready+for+prime+time.">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li></ol>

Yüksek içerik tarama platformları ile uyumlu bir şekilde canlılık, farklılaşma başarısı ve hücre altı görüntülemeyi optimize eden insan nöronal kültürlerinin yeniden süspansiyonu ve yeniden kaplaması için doğrudan ileri ye doğru bir prosedür gösterdik. ve uyuşturucu keşfi ile ilgili diğer tahliller. Şekil 6 genel iş akışını ve bu tür uygulamaların örneklerini göstermektedir.
Burada kortikal nöron kaderine yönelik hiPSC kayn...

İnsan pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp alanlarında ilgili. İş akışları ve prosedürleri kendi kültür ve bakım optimize etmek ve belirli nöronal alt tiplerefarklılaşma verimliliğini artırmak için, hızla 1,2gelişmektedir. İnsan kök hücre kaynaklı nöronların, ilaç keşfi ve hedef doğrulamada yüksek içerikli analizlere uygun model sistemleri olarak yarar ve maliyet etkinliğini artırmak için, olgun, fonksiyonel oluşturmak için gereken kültürlenme süresini azaltmak yararlıdır nöronlar, maksimum sağlamlık korurken, tekrarlanabilirlik, ve fenotip alaka. 3 boyutlu organoid kültürler nörogelişim araştırmasında atılımlar itici olmasına rağmen3, 2 boyutlu monolayer kültürler ilerler en az doku kalınlığı nedeniyle otomatik görüntüleme tabanlı uygulamalar ile özellikle uyumludur.
Ancak görüntüleme tabanlı tarama yöntemlerinin insan nörolojik ve nörogelişimsel hastalık modellerine uyarlaması büyük bir sorunla karşı karşıyadır. İnsan sinir sisteminin in vivo olarak olgunlaştığı uzun zaman dilimi, doğal gen ekspresyonu programlarını barındırmak ve nöronal olgunlaşmayı sağlamak için kültürde uzun süre yitirir.
Uzun nöronal farklılaşma programının pratik bir sonucu, hiPSC türetilmiş monolayer kültürlerin bakımı yeterli sinaps olgunluğu elde etmek için haftalarca sürdürülmelidir. Bu süre zarfında, farklılaşmamış kalan nöral atalar bölünmeye devam eder. Bu hızlı bir şekilde kültür büyümek ve canlı postmitotik nöronlar korumak için gerekli besin içeriği gasp edebilirsiniz. Şiddetle nöral progenitor hücreleri bölen (NPCs) da büyüme substrat için nöronlar ile rekabet edebilir. Bu, bu tür kültürleri, görüntüleme tabanlı tahliller için uygun olmayan bir durum olan kötü yapışma sorunlarına maruz kılabilir. Ayrıca, birçok araştırmacı küçük kültür hacmi, nöronal farklılaşma geç aşamalarında gözlemlemek için yeterince uzun farklılaşmış nöronların sağlıklı popülasyonları korumak daha büyük zorluk bulabilirsiniz. Başka bir deyişle, yüksek içerik tarama (HCS) yaklaşımları kullanarak sinaps olgunlaşma tahlilleri insan kaynaklı nöronlar için çok zor olabilir.
Bu sorunların bazılarını atlatmak için, daha önce farklılaştırılmış hiPSC türetilmiş nöronların yeniden sulandırılması ve rekaplama bir prosedür kullanılmıştır. İlk olarak, tam kararlı nöronların bir popülasyonda neurite büyüme (ya da daha doğrusu, nöral rejenerasyon) çalışma sağlar. İkinci olarak, daha önce farklılaşmış nöronların büyük hacimli formattan (10 cm veya daha büyük) küçük hacimli biçimlere (HCS uyumlu 96 veya 384 kuyulu mikrotiter plakalar gibi) yeniden kaplaması, toplam kültürlendirme süresinde önemli bir azalma sağlar. küçük hacimli durum. Bu in vitro sonraki haftalarda sinaps montaj ve olgunlaşma çalışmasını kolaylaştırır.
Ancak, zaten uzun nöritler ve karmaşık bir bağlantı ağı kurmuş olgun nöronların rekaplama çeşitli zorluklar sunar, biri hücre ölümü bazen yüksek ve değişken oranıdır. Burada, mükemmel hücre sağkalım ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanan bir rekaplama prosedürü açıklar. Genellikle nöronlar, triturasyon öncesinde hücreleri substrattan ayırmak için kısa kuluçka dönemleri için (genellikle ~3-10 dk) proteolitik enzimlere maruz kalırlar. Bu kısa proteoziz süresi alışılmış olarak, nöronal olmayan hücreler ve farklılaşmamış atalar4,5,6dahil olmak üzere birçok bölen hücre türünü yeniden sulandırmak ve geçirmek için kullanılır. Ancak, uzun, birbirine bağlı nöronlar taşıyan farklı nöronlar için, sadece substrat hücreleri ayırmak için değil, aynı zamanda hasarı en aza indirirken bireysel hücreleri izole etmek için dendritik ve aksonal ağ bozmak için gereklidir. Nitekim, nöronların kalın bir örgü genellikle tek bir levha olarak substrat ayırmak eğilimindedir, yerine bireysel hücreler olarak. Bakım nöritlerin kalın ağ gevşetmek için alınmazsa, nöronlar sadece geri dönüşümsüz hasar lı hale gelir, ama bunların çoğu kümeleri kaldırmak için kullanılan filtre geçmek için başarısız, zayıf hücre verimi ile sonuçlanan. Aşağıda bu zorluklara karşı yaygın olarak kullanılan proteaz kuluçka prosedürü basit bir değişiklik açıklar.
Aşağıda açıklanan protokolde nöronlar 40-45 dakika boyunca proteolitik enzim (örn. Accutase) gibi hafif bir proteaz ile kuluçkaya yatırılır. Enzim ikiekledikten sonra ilk 5-10 dakika boyunca, nöronal ağ bir levha olarak substrat kapalı kaldırır. Proteaz ile kuluçka nazik triturasyon ve filtreleme ile devam etmeden önce ek bir 30-40 dakika için ilerler. Bu ekstra kuluçka süresi, malzemenin sindiriminin hücreler arası ağı rahatlatmasını sağlamaya yardımcı olur ve böylece sonraki triturasyonun tek tek hücrelerin askıya alınmasını sağlar. Bu işlem hücre ölümünü en aza indirirken rekaplama üzerine hücre dağılımının tekdüzeliğini en üst düzeye çıkarır. Bu rekaplama yöntemini çeşitli farklılaşma protokolleri7,8 ve hiPSC'lerin çeşitli hatlarından oluşturulan hiPSC kaynaklı nöronal kültürlere başarıyla uyguladık. Prosedür, kök hücre kaynaklı nöronların çoğu veya tüm hatları ile kullanım için nominal uygundur. Biz uzun bir proteaz kuluçka süresi kesinlikle küçük biçimli plakalar (örneğin, 35 mm çapında) kültürlerin replating için gerekli olmadığını gözlemledik; ancak, burada da gösterdiğimiz gibi, büyük çaplı plakalardan (örn. 10 cm çapında veya daha büyük) rekaplama yaparken, muhtemelen bu plakalarda bulunan nöritler çok uzun süreçleri uzatabildikleri ve yoğun bir şekilde birbirine bağlı bir dizi oluşturabildikleri için önemli bir fayda sağlar.
Burada bu yöntemi göstermek ve kısaca erken neuritogenez ve dendritler ve aksonlar boyunca pre-ve postsinaptik proteinlerin kümelenmesi içeren sinaps olgunlaşma sı için tahlillerde uygulama göstermek, daha sonra takip sinaptik sitelerde kolokalizasyon. Örnekler, bu protokolün hücre canlılığını ve tekrarlanabilirliğini korumada sunduğu avantajları vurgular. İlk olarak, araştırmacılar insan neuritogenesis erken adımları çalışma için izin verir. Deneysel ayarı kemirgen kortikal veya hipokampal nöronların yaygın olarak kullanılan birincil kültürlere benzer, burada hücreler geç fetal veya erken postnatal beyinden çıkarılır, nazik proteaz tedavisi sonrası triturasyon tarafından ayrıştırılır, ve izin nöritler başlatmak veya yordam9,10kesildi nöritler yeniden. Bu tür kemirgen primer nöronlar benzer, hiPSC kaynaklı nöronlar oluşturmak veya replating sonra birkaç saat içinde kendi nöritler yeniden başlar, daha az yüksek spatiotemporal görüntüleme için optimal bir ortamda büyüme konileri ve nörit morfolojisi görüntüleme sağlayan farklılaşmamış hücreleri çevreleyen. Nöronların ilk olarak bir ata popülasyonundan ayırt etmeye başladıklarında görülen değişken gecikmeler ve farklı büyüme oranlarına göre nötrit büyümenin daha senkronize olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, replating genellikle daha sonra nöral gelişim de görünen nöronal alt tip belirteçleri ifade nöronların tahlilleri sağlar, kortikal tabaka gibi 5/6 transkripsiyon faktörü CTIP2 (Tavuk ovalbumin upstream organizatörü transkripsiyon faktör-etkileşen protein 2), veya pan-nöronal marker NeuN11. Replating yaklaşımının özellikle yararlı bir özelliği sinaptogenezin HCS ile uyumlu bir zaman dilimi içinde ilerler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1076px;" width="1076">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Post Replating Media</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:377px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dibutyryl-cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Add 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human BDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">450-02</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">B27 (50X)</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Add 20 ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DMEM/F12 with Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>31331093</td>
			<td>Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Human GDNF</td>
			<td style="width:276px;">Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Glutamax</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 100 &#181;l to 50 mL N2B27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td>Add 5ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">N2 (100X) Supplement</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Add 5ml to 500mL media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal A Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Neurobasal Media</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>for WT126 cells; neural basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SM1 Supplement</td>
			<td style="width:276px;">StemCell Technologies</td>
			<td>5711</td>
			<td>Add 1:50 to media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:276px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>25080-094</td>
			<td>Add 10ml to 1L N2B27 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Plate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08772-E</td>
			<td>Plastic TC-treated dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">6-well Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:276px;">Thomas Scientific</td>
			<td>1194Y80</td>
			<td>NEST plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Add 1:400 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-Ornithine</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P3655-10mg</td>
			<td>Add 1:1000 on plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">UltraPure Distilled Water</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10977-015</td>
			<td>To dilute Poly-L-Ornithine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Replating Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100mM Cell Strainer</td>
			<td style="width:276px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431752</td>
			<td>Sterile, individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">384-well plate, uncoated</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6007550</td>
			<td>Coat with PLO and Laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DPBS</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td>
			<td style="width:276px;">PerkinElmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Rinse before coating with laminin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:276px;">Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fixation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F79-1</td>
			<td>Dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sucrose</td>
			<td style="width:276px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S5-12</td>
			<td>0.8 g per 10 ml of fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Immunostaining Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11041</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21449</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td>
			<td style="width:276px;">Invitrogen</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DAPI</td>
			<td style="width:276px;">Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>visualizes DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)</td>
			<td style="width:276px;">Neuromics</td>
			<td>MO15013</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rat antibody against CTIP2</td>
			<td style="width:276px;">Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>layer 5/6 cortical neurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B290</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">chicken antibody against NeuN</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>late stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against MAP2</td>
			<td style="width:276px;">Shelley Halpain</td>
			<td>N/A</td>
			<td>early stage neuronal marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">mouse antibody against PSD-95</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td>P-246</td>
			<td>post-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit antibody against Synapsin 1</td>
			<td style="width:276px;">Millipore</td>
			<td>AB1543</td>
			<td>pre-synaptic marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:276px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30574.02</td>
			<td>10% in PBS for blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Titon X-100</td>
			<td style="width:276px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002931</td>
			<td>Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Viability Markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Vivafix 649/660</td>
			<td style="width:276px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">135-1118</td>
			<td>cell death marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:276px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td>
			<td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>calcium reporter in a viral delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hiPSC-derived NPCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">WT 126 (Y2610)</td>
			<td style="width:276px;">Gage lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Marchetto et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">CVB WT24</td>
			<td style="width:276px;">Yeo and Goldstein labs</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>unpublished</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post-differentiation replating of human pluripotent stem cell-derived neurons for high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation

İnsan pluripotent kök hücre türetilmiş nöral progenitor hücrelerinden (NCD) iki boyutlu kültürde ayırt edilen nöronlar, hastalık mekanizmalarını keşfetmek ve bileşimi sorgulamak için yüksek içerikli tarama (HCS) yapmak için güçlü bir model sistemi temsil eder. veya gen mutasyonu fenotiplerini tanımlar. Ancak, insan hücreleri ile fonksiyonel NPC geçiş, olgun nöron birkaç hafta gerektirir. Sinapslar genellikle monolayer kültürde 3 haftalık farklılaşmadan sonra oluşmaya başlar ve birkaç nörona özgü proteinler, örneğin daha sonra ifade eden pan-nöronal belirteç NeuN veya 5/6 serebral kortikal nöron belirteci CTIP2, yaklaşık 4-5 hafta sonrası farklılaşma. Bu uzun farklılaşma süresi, küçük hacimli, çok kuyulu HCS platformlar için kullanılan en uygun kültür koşullarıyla uyumsuz olabilir. Pek çok zorluk arasında, en az hücre kümeleme ile iyi yapışılmış, düzgün dağılmış hücrelere duyulan ihtiyaç ve uzun vadeli canlılık ve fonksiyonel sinaps olgunlaşmasını teşvik eden kültür prosedürleri yer almaktadır. Bir yaklaşım büyük hacimli biçimde nöronlar ayırt etmek, daha sonra HCS uyumlu multi-wells daha sonraki bir zaman noktasında onları replate etmektir. Bu replating yaklaşımı kullanırken bazı temel zorluklar, dendritik ve aksonal ağın stresli bozulması nedeniyle, tekrarlanabilirlik ve hücre canlılığı ile ilgilidir. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronların büyük hacimli formatta 4-8 hafta farklılaşmasından sonra, 384-iyi mikrotiter'e aktarılması için ayrıntılı ve güvenilir bir prosedür gösteriyoruz. plakaları ve mükemmel hücre hayatta kalma ile daha 1-3 hafta için onları kültür. İnsan nöronların bu rekaplama sadece replating iki hafta içinde sinaps montaj ve olgunlaşma çalışma sağlar, ama aynı zamanda neurite rejenerasyon ve büyüme konisi özellikleri çalışmaları sağlar. 384 kuyulu bir platform kullanarak neuritogenez ve sinaptogenez için ölçeklenebilir tahlil örnekleri salıyoruz.

Birden fazla hafta için farklılaşmış olan hiPSCs türetilmiş nöronların rekaplama çeşitli avantajlar sunuyor. Ancak, uzun, birbirine bağlı dendritler ve aksonlara sahip farklılaştırılmış nöronların ayrılması ve dizginlettürülmeleri (Şekil1A)geri dönüşümsüz olarak hasar görmüş nöronların yüksek bir fraksiyonuna neden olabilir.
Protokol bölümünde açıklandığı gibi, nöronları substrattan ayırmak için pro...

Watch this Scientific Journal Video about Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation at JoVE.com

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Bu protokol, yüksek içerik tarama uygulamaları için insan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronların kullanımını kolaylaştırır. Özellikle iyi sinaps lar, insan nöronlar uzun kültür dönemleri gerektiren atama kiçin uygundur. Büyük formatlı yemeklerden HCS uyumlu çoklu kuyulara kadar nöronların canlılığını koruyacak şekilde yeniden kaplamasını gösteriyoruz.Sezgilere karşı, proteaz kuluçkasını yeniden sulandırma ve rekaplamadan önce uzatmanın nöronal sağkalımı artırdığını gösteriyoruz. İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve dejeneratif tıp alanlarında ilgili. Bu nazik titrasyon yöntemi, kalın bir işlem ağına sahip büyük tek hücre tabakasını yeniden askıya almak için kullanılabilir.İnsan iPSC'lerine ek olarak, birincil nöronların kültürünü yeniden kaplamak veya onları sıralama veya tek hücre dizilimi için yeniden askıya almak için kullanılabilir. Protokol adımlarını dikkatle takip etmek ve nöronların plakadan ayrılmasını sık sık izlemek önemlidir. En uygun kuluçka süresi kültüre bağlı olarak değişebilir.Görsel gösteri bile deneyimsiz araştırmacılar bu prosedürü çoğaltmak için sağlar. PBS ile farklılaştırılmış nöronların plakasını hafifçe durulayarak başlayın. PBS'yi plakanın duvarından aşağı yayılTın ve bozulmaması için doğrudan hücrelere dağıtmayın.PBS'yi çanak kenarından aspire ederken, hücrelere dokunmamaya özen gösterilsin. 10 santimetrelik plaka başına en az bir mililitre proteolitik enzim uygulayın. Ve hücreleri 40-45 dakika boyunca kuvöze geri verin.Kuluçka sırasında, fazlı kontrast mikroskop üzerinde nöronlar kontrol edin ve nöral ağ tamamen plaka ayırır ve parçalanmaya başlayana kadar proteaz tedaviye devam edin. Nöronlar ayrıldığında, proteaz her bir mililitre için taze DEMEM medya beş mililitre ekleyerek sindirim durdurmak. Hücreleri plakaya karşı beş ila sekiz kez hafifçe titreetmek için serolojik pipet kullanın ve çok fazla basınç uygulamadığından emin olun.Hücreleri 100 mikrometrelik bir kafesten 50 mililitrelik konik bir tüpe doğru süzün. Ve taze DMEM medya ek beş mililitre ile süzgeç durula. Hücreleri 1000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı döndürmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanın.Santrifüjden sonra konik tüpü biyogüvenlik kabinine geri döndürün ve ortamların çoğunu aspire edin, hücreleri nemli tutmak için 250 mikrolitre bırakın. İki mililitre taze DMEM medyasındaki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve beş mililitrelik serolojik pipetin ucundan geçirin. Son olarak, tüpü 2-3 kez ters çevirin.Canlı hücreleri saymak için hemositometre ve tripan mavikullanın. Ve sonra DMEM istenilen konsantrasyona. Belirli hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak, tüp için uygun takviyeleri ekleyin ve yavaşça konik tüp 2-3 kez yatırarak hücreleri karıştırın.24 kuyulu bir plakadan aspire laminin kaplama ve pbs ile bir kez durulayın. PBS'yi aspire edin. Ve kümelenmeyi önlemek için sekiz şeklindeki her kuyuya hücre çözeltisi uygulayın.Hücreleri kaplama bittiğinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak belirlenen kuvöz plaka dönmek. Kısaca erken hücre ölümü muhabiri stok çözüm girdap ve el yazması talimatlarına göre kuyulara ekleyin. 20 dakika bekleyin.Ve sonra cam alt çok kuyularda canlı ve ölü hücreleri görüntü. Proteaz kuluçka uzatılması hücrelerin kaldırılan levha içinde nöronal ağ gevşeme sağlar. Bu da dissosiyasyon sırasında hücre ölümünün azalmasına ve sonraki günlerde daha verimli bir iyileşmeyle sonuçlanır.Genişletilmiş enzim kuluçka prosedürü kullanarak, kültürler replating ve ölü veya ölmekte olan hücrelerin daha düşük yoğunluğu sonra gün boyunca hücre canlılığı yaklaşık iki katına sergiler. Nöronal farklılaşmageçiş aşaması birkaç gün içinde gerçekleşir, sırasında hücreler yavaş yavaş geç evre nöronal belirteçleri ifade. Bu belirteçler, dört haftalık ön farklılaşmadan sonra yeniden doldurulan kültürlerde hemen tespit edilir.Genişletilmiş proteaz protokolü de orta neuride büyüme artırır. Hem total neurit uzunluğu hem de dendrit büyümesi iyileşir. Replating de sinapslar çalışma için yararlıdır.Rekaplamadan sadece bir hafta sonra sinaptik öncesi ve sonrası proteinler için belirteçler gözlendi. Ayrıca, spontan depolarizasyon ve sinaptically tahrikli akımlar elektriksel aktivite kalsiyum görüntüleme veya multielektrot dizileri kullanılarak tespit edilebilir. Bu kaplama yordamı birçok uygulama türüne uyarlanabilir.Potansiyel terapötik bileşikleri belirlemek için yüksek içerik tarama ek olarak, görüntüleme büyüme konileri veya multielektrot dizi kayıtları için kullanılabilir. Zaten uzun süreçler oluşturmuş nöronların mekanik dissosiyasyonu stresli. Uzatılmış enzimatik kuluçka ve hücrelerin nazik titrasyonu bu işlemin başarısı için gerekli adımlardır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...