Name: study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves
Uploaded: 2019-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den nationale Nøgleforskning & Development program (2016YFD0200900) i Kina, den nationale naturvidenskabelige fundament i Kina (no. 31772076 og No. 31270728), Kina postdoc Science Foundation (2018M630700), og åbne fond af State Key laboratorium for Tea Plant biologi og udnyttelse (SKLTOF20180111).

1. te hård hud kultur
Bemærk: sterile blade stammer fra in vitro-dyrkede plantlet linjer, der først blev udviklet i Forskergruppen17. Alle procedurer op til punkt 5 blev udført i en steril laminar flow hætte, bortset fra kulturtid i en inkubator.
<ol><li>Juster pH-værdien for de to medier (Murashige og Skoog [MS] basal medium og Gamborgs B5-væske medium) til 5,8 før autoklavering (121 °C, 20 min).</li>
	<li>Skær langs den midterste vene af et sterilt blad ve...

<ol>
	<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+identification,+quantitation,+and+principal+component+analysis+of+green+pu-erh,+green,+and+white+teas+using+UPLC/DAD/MS.">Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS.</a> Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).</li><li>Alcazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+green,+white,+black,+Oolong,+and+Pu-erh+teas+according+to+their+free+amino+acids+content.">Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).</li><li>Kopjar, M., Tadic&#180;, M., Piliz&#711;ota, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+content+and+antioxidant+activity+of+green,+yellow+and+black+tea+leaves.">Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves.</a> Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).</li><li>Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+QuEChERS+sample+preparation+method+for+the+analysis+of+70+pesticide+residues+in+tea+using+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).</li><li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+Nonsystemic+Behavior+of+the+Pesticide+Ferbam+on+Tea+Leaves+by+Engineered+Gold+Nanoparticles.">Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles.</a> Environmental Science &amp; Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).</li><li>Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+C-14-Ethion+insecticide+in+the+presence+of+deltamethrin+and+dimilin+pesticides+in+cotton+seeds+and+oils,+removal+of+ethion+residues+in+oils,+and+bioavailability+of+its+bound+residues+to+experimental+animals.">Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).</li><li>Fang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+Dynamics+and+Dietary+Risk+Assessments+of+Two+Neonicotinoid+Insecticides+during+Lonicerajaponica+Planting,+Drying,+and+Tea+Brewing+Processes.">Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes.</a> Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissipation+pattern,+processing+factors,+and+safety+evaluation+for+dimethoate+and+its+metabolite+(omethoate)+in+tea+(Camellia+sinensis).">Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis).</a> PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).</li><li>Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+intoxication+with+omethoate.">Fatal intoxication with omethoate.</a> International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).</li><li>Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residues+of+acephate+and+its+metabolite+methamidophos+in/on+mango+fruit+(Mangifera+indica+L.).">Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.).</a> Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).</li><li>Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+acephate+using+a+developed+bacterial+consortium+and+toxicological+analysis+using+earthworms+(Lumbricus+terrestris)+as+a+model+animal.">Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal.</a> International Biodeterioration &amp; Biodegradation. 69, 1-9 (2012).</li><li>Ford, K. A., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metabolism+and+pharmacokinetics+of+seven+neonicotinoid+insecticides+in+spinach.">Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).</li><li>Frear, D. S., Swanson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+cisanilide+(cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide)+by+Excised+Leaves+and+Cell+Suspension+Cultures+of+Carrot+and+Cotton.">Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).</li><li>Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+plant+cell+cultures+to+study+the+metabolism+of+environmental+chemicals.">Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).</li><li>Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metabolite+profiling+of+the+insecticide+thiamethoxam+in+plant+and+cell+suspension+culture+of+tomato.">Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).</li><li>Lichtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+mobility+of+crop+protection+products.">Phloem mobility of crop protection products.</a> Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shoot+basal+ends+as+novel+explants+for+in+vitro+plantlet+regeneration+in+an+elite+clone+of+tea.">Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea.</a> Journal of Horticultural Science &amp; Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).</li><li>Meng, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+Translocation,+Metabolism,+and+Distribution+of+Glyphosate+in+Nontarget+Tea+Plant+(Camellia+sinensis+L).">Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).</li><li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Extraction+Method+for+Determination+of+Neonicotinoid+Residues+in+Tea.">Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).</li><li>Karmakar, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence,+metabolism+and+safety+evaluation+of+thiamethoxam+in+tomato+crop.">Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop.</a> Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).</li><li>Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Dimethoate+and+Metabolites+Following+Foliar+Application+to+Plants.">Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).</li><li>Lucier, G. W., Menzer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+oxidative+metabolites+of+dimethoate+formed+in+rats,+liver+microsomes,+and+bean+plants.">Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).</li><li>Yang, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).</li><li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Metabolic+Behaviors+of+Six+Systemic+Insecticides+in+a+Newly+Established+Cell+Suspension+Culture+Derived+from+Tea+(L.)+Leaves.">Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).</li><li>Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures.">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).</li><li>Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+plant+growth+regulators+on+cell+growth+and+ginsenoside+saponin+production+by+suspension+cultures+of+Panax+quinquefolium.">Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium.</a> Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoterpenoids+and+aroma+compounds+from+cell+suspension+cultures+of+Camellia+sinensis.">Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).</li><li>Lei, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevent+Browning+of+Axillary+Buds+in+vitro+Culture+of+Camellia+sinensis.">Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis.</a> Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).</li><li>Hou, X., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+various+nitrogen+sources+on+the+growth+and+nitrate+assimilation+indicator+of+suspension+roselle+cell.">The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell.</a> Guihaia. 18, 169-172 (1998).</li><li>Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotic+Metabolism+in+Plants:+In+vitro+Tissue,+Organ,+and+Isolated+Cell+Techniques.">Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques.</a> ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).</li></ol>

Denne artikel præsenterer den detaljerede proces med at etablere en model af pesticid metabolisme i teplantevæv, herunder udvælgelsen af explants, bestemmelse af cellernes levedygtighed, og etablering af en tecelle suspension kultur med høj metaboliske Aktivitet. Alle dele af et plantevæv kan anvendes til at initiere hård hud i et steriliseret miljø25. Tea blade blev valgt til hård hud indledning i denne undersøgelse, ikke kun fordi bladene har tendens til at være mindre forurenet end de...

Te er en af de mest udbredte ikke-alkoholholdige drikkevarer i verden1,2. Te er fremstillet af bladene og knopper af woody flerårig Camellia sinensis L. Tea planter dyrkes i store plantager og er modtagelige for talrige insekt skadedyr3,4. Insekticider til organophosphorus og neonicotinoid anvendes ofte som systemiske insekticider5 for at beskytte teplanter mod skadedyr såsom hvid fluer, blad tragte og nogle lepidopteran-arter6,7. Efter påføring absorberes disse insekticider eller omplaceres i planten. Inden for anlægget kan disse systemiske insekticider omdannes gennem hydrolyse, oxidation eller reduktions reaktioner med plante enzymer. Disse transformation produkter kan være mere polære og mindre giftige end de overordnede forbindelser. For nogle organophosphater er bioaktiviteterne for visse produkter imidlertid højere. F. eks. metaboliseres acephat til den mere giftige methamidophos8,9og dimethoat til omethoat10,11. Plante Stofskifteundersøgelser er således vigtige for fastlæggelsen af et pesticidstofs skæbne i en plante12.
Plantevævs kulturer har vist sig at være en nyttig platform for undersøgelse af pesticid metabolismen, idet de identificerede metabolitter svarer til dem, der findes i intakte planter13,14,15. Brugen af vævskulturer, især celle ophængs kulturer, har flere fordele. For det første kan eksperimenter udføres fri for mikroorganismer og dermed undgå interferens fra pesticid omdannelse eller nedbrydning ved mikrober. For det andet, vævskultur giver konsekvent materialer til brug til enhver tid. For det tredje er metabolitterne lettere at udtrække fra vævskulturer end fra intakte planter, og vævskulturer har ofte færre begravelsen forbindelser og lavere kompleksitet af forbindelser. Endelig kan vævskulturer lettere bruges til at sammenligne en række pesticider metabolisme i et enkelt eksperiment16.
I denne undersøgelse, en cellesuspension afledt af bladene af sterilt-dyrket Tea plantlet blev etableret med succes. Den te cellesuspension kultur blev derefter brugt til at sammenligne afledning adfærd af seks systemiske insekticider.
Denne detaljerede protokol har til formål at give nogle retningslinjer, således at forskerne kan etablere en plante vævskultur platform nyttigt for at studere den metaboliske skæbne af xenobiotika i te.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:674px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Acetamiprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">46717</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 135410-20-7</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Acetonitrile (CAN, 99.9%)</td>
			<td style="width:188px;">Tedia</td>
			<td style="width:175px;">AS1122-801</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 75-05-8</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Agar</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">A8190</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 9002-18-0</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Clothianidin (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">525</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 210880-92-5</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Dimethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">109217</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 60-51-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidacloprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">91029</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 138261-41-3</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidaclothiz (99.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Toronto Research Chemical</td>
			<td style="width:175px;">I275000</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 105843-36-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Kinetin (KT, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">K8010</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 525-79-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Omethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">105491</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 1113-02-6</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">P8070</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 25249-54-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Sucrose</td>
			<td style="width:188px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:175px;">5511</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 57-50-1</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Thiamethoxam (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">20625</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 153719-23-4</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">T8170</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 298-96-4</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:188px;">2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Guangzhou Saiguo Biotech</td>
			<td style="width:175px;">D8100</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 94-75-7</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:188px;">chiral column</td>
			<td style="width:188px;">Agilent CYCLOSIL-B</td>
			<td>112-6632</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Gas chromatography (GC)</td>
			<td style="width:188px;">Shimadu</td>
			<td>2010-Plus</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Flame Photometric Detector (FPD)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">High-performance liquid chromatography (HPLC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Ultraviolet detector (UV)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">HSS T3 C18 column</td>
			<td style="width:188px;">Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (100 mm &#215; 2.1 mm &#215; 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Agilent</td>
			<td>1290-6545</td>
			<td style="width:123px;">Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Thermo Scientific</td>
			<td>Ultimate 3000-Q Exactive Focus</td>
			<td style="width:123px;">Connected to a Orbitrap mass spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves

Der blev udviklet en platform for undersøgelse af insekternes metabolisme ved hjælp af in vitro-væv af te-planten. Blade fra sterile Tea plantlets blev induceret til at danne løse hård hud på murashige og Skoog (MS) basal Media med planten hormoner 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre (2,4-D, 1,0 mg l-1) og kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus dannet efter 3 eller 4 runder af subculturing, hver varede 28 dage. Løs hård hud (ca. 3 g) blev derefter inokuleret i B5 flydende medier indeholdende de samme plante hormoner og blev dyrket i en ryste inkubator (120 rpm) i mørke ved 25 ± 1 °c. Efter 3 − 4 subkulturer blev en cellesuspension afledt af teblad etableret ved et subkulturforhold på mellem 1:1 og 1:2 (suspension moder væske: frisk medium). Ved hjælp af denne platform, seks insekticider (5 μg mL-1 hver thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoat, og omethoat) blev føjet til Tea Leaf-afledte cellesuspension kultur. Metabolismen af insekticiderne blev sporet ved hjælp af væskekromatografi og gaskromatografi. For at validere nytten af tecelle affjedrings kulturen blev metabolitterne af thiamethoxan og dimethoat til stede i behandlede cellekulturer og intakte planter sammenlignet ved hjælp af massespektrometri. I behandlede tecellekulturer blev der fundet syv metabolitter af thiamethoxan og to metabolitter af dimethoat, mens der i behandlede intakte planter kun blev fundet to metabolitter af thiamethoxam og en af dimethoat. Brugen af en cellesuspension forenklet den metaboliske analyse i forhold til brugen af intakte teplanter, især for en vanskelig matrix som te.

Induktion af hård hud fra blade høstet fra felt dyrkede tetræer og fra blade, der er fjernet fra teplanter dyrket in vitro i et sterilt miljø, blev sammenlignet ved at måle kontaminering, bruning og induktion efter 28 dages dyrkning på MS-medier ( Figur 1a). Væksten i callus blev registreret ved 20, 37, 62 og 90 dages kultur (figur 1b). Den hård hud, der stammer fra de in vitro-dyrkede blade, viste en kraftigere vækst en...

Watch this Scientific Journal Video about Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves at JoVE.com

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Dette arbejde præsenterer en protokol for etablering af en cellesuspension kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) blade, der kan bruges til at studere metabolismen af eksterne forbindelser, der kan tages op af hele planten, såsom insekticider.

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Te er en af de mest populære drikkevarer i hele verden. Pesticider bruges undertiden til at beskytte teplanter mod skadedyr. Nogle systemiske pesticider kan gøres for dette ved enzymer i tea tree.Og derefter integreret gennem oxidation, hydrolyse, eller reduktion reaktioner. Plantecelle suspension kulturer kan bruges som en, let at studere plantemetabolisme adfærd pesticider. Denne metode har flere fordele.For det første kan den opereres på betingelser af frie mikroorganismer, således at man undgår interferens af pesticidforringelse forårsaget af mikrober. For det andet kan det give konstant materiale til os til enhver tid. Endelig kan det også bruges let at sammenligne teorier om pesticid adfærd på et enkelt eksperiment.I denne undersøgelse etablerer vi te celle suspension kulturer fra variable farver teblade. Den optimale kulturstatus for cellesuspensioner blev derefter brugt til at sammenligne seks pesticiders spredningsadfærd. Dette eksperiment vil blive udført af Jiao Weiting og Ge Guoqin.Dette er vores te sterile plantlets, der fungerer som kilde til explant. Skær langs den midterste fløj af et sterilt blad ved hjælp af en saks. Og derefter underinddele hver halvdel i små stykker på omkring 0,3 gange 0,3 centimeter i en petriskål.Placer de sterile explants på MS visuelle medium, der indeholder 2, 4-D og KT. Seks explants kan placeres i en 300 milliliter kolbe. Kultur bladet explants ved en konstant temperatur på 25 grader Celsius i mørke. Efter 28 dage vælges den første generation af induceret callus og derefter overføres til frisk kolbe.Erhverve den løse og variable callus efter tre til fire subkulturer. Skær de store, variable og løse hård hud fra det faste medium i små stykker ved hjælp af en steril kirurgisk klinge under sterile forhold. Vi er omkring tre gram af de små stykker af en callus.Anbring callus'en i B5 indeholdende 2, 4D og KT. Væskecellesuspensionen ved konstant temperatur i rystekubvøsen i mørke. Efter syv til ti dages dyrkning, fjerne kulturkolben, og lad dem stå i et par minutter. Tag supernatant som sediment her vil tvinge kulturen til frisk medium.Fjern de udfældede store hård hud. Få den endelige velplejede celle suspension kultur efter fire til tre subkultur cyklusser på 28 dage hver. Hold en prøve af levende celler på hundrede grader celsius i ti minutter som kontrolcelle før levedygtighed farvning.Centrifuge alle celle suspension kultur i otte minutter ved 6, 000 G.Fjern supernatant før suspension cellerne i 5 milliliter PBS buffer og ryste det i et minut i hånden. Der tilsættes 2,5 milliliter TTC-opløsningen, og ryst med hånden igen. Inkuber blandingen i en time i en stående inkubator ved 13 grader Celsius.Tilføj en aliquot af fire hundrede mikroliter på henblik på at sterilisere bestanden opløsning af alle neonicotinoider Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid, og Imideproxase. Alt sammen til økologisk første fase. Dimethoate og omethoate i cellen suspension kulturer hhv.Kulturprøver af cellesuspensioner med insekticider ved konstant temperatur og rystende inkubatorhastighed. Tag prøverne på forskellige dage. Prøven, der indeholder et neonicotinoid, udtages en 1 milliliterprøve af den homogene cellekultur.Placer den i et 1,5 milliliter plastcentrifugerør, og centrifuge det ved 4.000 G i to minutter. Supernatanten gennem en 0,22 mikrometerfiltermembran før analyse af HPLC-UV og UPLC QTOF. For at teste prøven fortsættes i den organiske første fase.Fjern en 500 mikroliter aliquot af cellekulturen og anbringes i et 35 milliliter centrifugerør eller 1,5 milliliter plastcentrifugerør. Der tilsættes 0,1 g natriumchlorid og 5 milliliterekstraktopløsningsmiddel i 35 millilitercentrifugerøret i de 500 mikroliterprøver. Vortex blandingen i et minut.Og så lade dem hvile i 10 minutter. Tag 2,5 milliliter supernatant i et 10 milliliterglas og fordampe til næsten tørhed ved hjælp af en nitrogenfordampator ved 14 grader Celsius. Restproduktet opløses med en milliliter acetone.Vortex i et minut, passere det gennem en 0,22 mikrometer filtermembran før analyse af GC-FPD. Put fem planter i fire liters plastik potter i femten dage. Der tilsættes nul mikrogram pr. milliliter eller 100 mikrogram pr. milliliter thiamethoxam eller dimethoaxe i plastpotter.Forbered den intakte planteprøve i henhold til den tidligere metode, bortset fra forblødning og derefter analysere ved Orbitrap massespektrometri. Brug en HPLCUV til at detektere indholdet og metaboliske produkter af Thiamethoxam og Acetimoprid ved bølgelængder på 254 nanometer, og af imidacloprid og Imideproxase på 270 nanometer. Detekter indholdet af dimethoate og omethoate ved hjælp af GC-FPD ved hjælp af en rørformet kolonne.Påekter metabolitterne af insekticider i cellekulturen ved hjælp af UPRC QTOF med en Carbon-18 kolonne. Detekter metabolitterne af insekticider i testplanteekstrakt ved hjælp af UPLC Orbitrap-massespektrometri. Den callus af en steril plantlet har lavere forurening bruning, men højere inuktivitet, at af callus fra plukket teblade.Den callus stammer fra sterile blade var altid lyse gullig, mens callus stammer fra plukkede blade var hvid med brune pletter. Når KT koncentration var 0,1 milligram per liter, den callus var gullig i farve og løs i tekstur. Væksten i callus var den højeste, op til 61.5%, når koncentrationen af 2, 4-D var en milligram per liter med koncentrationen af KT var 0.5 milligram per liter.Væksten data af callus var den bedste og vækstraten for callus var den højeste nåede 46.9%Derfor, den bedste kombination af plante homent var en milligram per liter af 2, 4-D og 0,1 milligram per liter KT for te callus vækst. Den callus helt dækket bladene af den fjerde subkultur, og når subkultur cyklus var 28 dage. Den callus var vokset kraftigt med gullig farve og løs tekstur og ingen bruning.Efter at have sammenlignet bruttodataene for callus og farven på cellesuspension var B5-væskemediet mere egnet til cellesuspensionskultur. OD-værdien af cellesuspensionskulturen blev brugt til at repræsentere mængden af cellevækst. I de 75 dyrkningsdage havde forholdet 15 g pr. 40 milliliter en OD-værdi, der var betydeligt højere end for de to andre forhold.Celle levedygtighed inden for te celle suspension kultur blev testet af TTC farvning. Den farveløse TTC sammensatte kan konverteres til rød formadin ved dehydrogenase i mitokondrier af levende celler, men farven kan ikke ændres i døde celler. Og dette er hele processen med at etablere en te celle suspension kultur.Dette er den første sammenlignende undersøgelse af metabolismen af forskellige pesticider i te ved hjælp af en celle suspension kultur teknik. Flere pesticidmetabolitter blev identificeret, og nogle af dem blev yderligere undersøgt i holdt teplanter. Denne nye metode kunne tjene som model for pesticid metaboliske undersøgelser i te eller andre planter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode til måling Metabolisme i Sorteret subpopulationer af Komplekse Cell Fællesskaber Brug stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kortlægning stofskifte: Overvågning af laktat Dehydrogenase aktiviteten direkte i væv

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...