Name: study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves
Uploaded: 2019-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית פיתוח מפתח & לאומי (2016YFD0200900) של סין, הקרן הלאומית המדעית הטבעית של סין (No. 31772076 ו-No. 31270728), סין פוסט דוקטורט הקרן (2018M630700), ואת הקרן הפתוחה של מפתח המעבדה לביולוגיה של צמח התה וניצול (SKLTOF20180111).

1. התרבות שלנו תה
הערה: העלים הסטריליים נגזרו מתוך שורות מחוץ לתחום שפותחו לראשונה בקבוצת המחקר17. כל ההליכים עד לסעיף 5 בוצעו במכסה זרימה סטרילית, למעט זמן התרבות בחממה.
<ol><li>כוונן את ה-pH של שתי המדיות (מורראשיג ו-Skoog [MS] המדיום הבזאלי ו-B5 בינוני נוזלי של גאמבורג) עד...

<ol>
	<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+identification,+quantitation,+and+principal+component+analysis+of+green+pu-erh,+green,+and+white+teas+using+UPLC/DAD/MS.">Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS.</a> Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).</li><li>Alcazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+green,+white,+black,+Oolong,+and+Pu-erh+teas+according+to+their+free+amino+acids+content.">Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).</li><li>Kopjar, M., Tadic&#180;, M., Piliz&#711;ota, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+content+and+antioxidant+activity+of+green,+yellow+and+black+tea+leaves.">Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves.</a> Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).</li><li>Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+QuEChERS+sample+preparation+method+for+the+analysis+of+70+pesticide+residues+in+tea+using+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).</li><li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+Nonsystemic+Behavior+of+the+Pesticide+Ferbam+on+Tea+Leaves+by+Engineered+Gold+Nanoparticles.">Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles.</a> Environmental Science &amp; Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).</li><li>Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+C-14-Ethion+insecticide+in+the+presence+of+deltamethrin+and+dimilin+pesticides+in+cotton+seeds+and+oils,+removal+of+ethion+residues+in+oils,+and+bioavailability+of+its+bound+residues+to+experimental+animals.">Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).</li><li>Fang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+Dynamics+and+Dietary+Risk+Assessments+of+Two+Neonicotinoid+Insecticides+during+Lonicerajaponica+Planting,+Drying,+and+Tea+Brewing+Processes.">Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes.</a> Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissipation+pattern,+processing+factors,+and+safety+evaluation+for+dimethoate+and+its+metabolite+(omethoate)+in+tea+(Camellia+sinensis).">Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis).</a> PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).</li><li>Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+intoxication+with+omethoate.">Fatal intoxication with omethoate.</a> International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).</li><li>Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residues+of+acephate+and+its+metabolite+methamidophos+in/on+mango+fruit+(Mangifera+indica+L.).">Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.).</a> Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).</li><li>Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+acephate+using+a+developed+bacterial+consortium+and+toxicological+analysis+using+earthworms+(Lumbricus+terrestris)+as+a+model+animal.">Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal.</a> International Biodeterioration &amp; Biodegradation. 69, 1-9 (2012).</li><li>Ford, K. A., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metabolism+and+pharmacokinetics+of+seven+neonicotinoid+insecticides+in+spinach.">Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).</li><li>Frear, D. S., Swanson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+cisanilide+(cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide)+by+Excised+Leaves+and+Cell+Suspension+Cultures+of+Carrot+and+Cotton.">Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).</li><li>Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+plant+cell+cultures+to+study+the+metabolism+of+environmental+chemicals.">Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).</li><li>Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metabolite+profiling+of+the+insecticide+thiamethoxam+in+plant+and+cell+suspension+culture+of+tomato.">Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).</li><li>Lichtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+mobility+of+crop+protection+products.">Phloem mobility of crop protection products.</a> Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shoot+basal+ends+as+novel+explants+for+in+vitro+plantlet+regeneration+in+an+elite+clone+of+tea.">Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea.</a> Journal of Horticultural Science &amp; Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).</li><li>Meng, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+Translocation,+Metabolism,+and+Distribution+of+Glyphosate+in+Nontarget+Tea+Plant+(Camellia+sinensis+L).">Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).</li><li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Extraction+Method+for+Determination+of+Neonicotinoid+Residues+in+Tea.">Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).</li><li>Karmakar, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence,+metabolism+and+safety+evaluation+of+thiamethoxam+in+tomato+crop.">Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop.</a> Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).</li><li>Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Dimethoate+and+Metabolites+Following+Foliar+Application+to+Plants.">Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).</li><li>Lucier, G. W., Menzer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+oxidative+metabolites+of+dimethoate+formed+in+rats,+liver+microsomes,+and+bean+plants.">Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).</li><li>Yang, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).</li><li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Metabolic+Behaviors+of+Six+Systemic+Insecticides+in+a+Newly+Established+Cell+Suspension+Culture+Derived+from+Tea+(L.)+Leaves.">Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).</li><li>Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures.">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).</li><li>Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+plant+growth+regulators+on+cell+growth+and+ginsenoside+saponin+production+by+suspension+cultures+of+Panax+quinquefolium.">Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium.</a> Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoterpenoids+and+aroma+compounds+from+cell+suspension+cultures+of+Camellia+sinensis.">Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).</li><li>Lei, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevent+Browning+of+Axillary+Buds+in+vitro+Culture+of+Camellia+sinensis.">Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis.</a> Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).</li><li>Hou, X., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+various+nitrogen+sources+on+the+growth+and+nitrate+assimilation+indicator+of+suspension+roselle+cell.">The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell.</a> Guihaia. 18, 169-172 (1998).</li><li>Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotic+Metabolism+in+Plants:+In+vitro+Tissue,+Organ,+and+Isolated+Cell+Techniques.">Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques.</a> ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).</li></ol>

מאמר זה מציג את התהליך המפורט של הקמת מודל של חילוף חומרים של חומרי הדברה ברקמת צמח תה, כולל הבחירה של explants, קביעת הכדאיות של התא, והקמת תרבות תא תה ההשעיה עם מטבולית גבוהה פעילות. חלקים כלשהם של רקמת הצמח יכול לשמש כדי ליזום יבלות בסביבה מחוטאת25. עלי תה נבחרו עבור חניכה יבלות במ...

תה הוא אחד המשקאות הלא אלכוהוליים הנפוצים ביותר בעולם1,2. תה מופק מן העלים וניצנים של Camellia סיננסיס וודי צמחי תה מגודלים במטעים עצומים ורגישים מזיקים חרקים רבים3,4. בדרך כלל משתמשים בחומרי הדברה זרחניים ובneonicotinoid, כמו קוטלי חרקים מערכתית5 כדי להגן על צמחי תה ממזיקים כגון ויטנפלאס, העלים, ומינים שחדוניים6,7. לאחר היישום, חומרי הדברה אלה נספגים או ממוקמים בתוך הצמח. בתוך הצמח, קוטלי חרקים מערכתית אלה עשויים להשתנות באמצעות הידרוליזה, חמצון או הפחתת תגובות על ידי אנזימים צמח. מוצרי טרנספורמציה אלה יכולים להיות יותר קוטביים ורעילים פחות מאשר תרכובות האב. עם זאת, עבור חלק מהזרחן, הביו-פעילות של מוצרים מסוימים גבוהה יותר. לדוגמה, acephate הוא מטבוליזם לתוך מתיאמאמאופטות2 הרעילים יותר8,9, ומתועד לתוך omethoate10,11. מחקרים מטבוליים צמחיים חשובים ולכן לקביעת גורלם של חומרי הדברה בתוך צמח12.
תרביות רקמות הצמח הוכחו להיות פלטפורמה שימושית לחקירת חילוף החומרים של חומרי הדברה, עם מטבוליטים מזוהה דומה לאלה שנמצאו צמחים שלמים13,14,15. השימוש בתרביות רקמות, בעיקר בתרבויות ההשעיה של התא, יש מספר יתרונות. ראשית, ניסויים יכולים להתבצע ללא מיקרואורגניזמים, ובכך הימנעות הפרעות של שינוי הדברה או השפלה על ידי חיידקים. שנית, תרבות הרקמה מספקת חומרים עקביים לשימוש בכל עת. שלישית, מטבוליטים קל יותר לחלץ מתרבויות רקמה מאשר צמחים שלמים, ותרבויות רקמה לעתים קרובות יש פחות תרכובות interring והמורכבות הנמוכה של תרכובות. לבסוף, תרבויות רקמה יכול לשמש יותר בקלות כדי להשוות סדרה של חומרי הדברה מטבוליזם בניסוי אחד16.
במחקר זה, השעיית תא נגזר העלים של שתילי תה סטרילי מבוגרים הוקמה בהצלחה. התרבות ההשעיה של תא התה הייתה משמשת להשוואת התנהגויות הפיזור של שישה קוטלי חרקים מערכתית.
פרוטוקול זה מפורט נועד לספק מספר הדרכה כך החוקרים יכולים להקים מפעל התרבות הצמח פלטפורמה שימושי לחקר גורלם של מטבולית של xenobiotics לתה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:674px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Acetamiprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">46717</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 135410-20-7</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Acetonitrile (CAN, 99.9%)</td>
			<td style="width:188px;">Tedia</td>
			<td style="width:175px;">AS1122-801</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 75-05-8</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Agar</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">A8190</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 9002-18-0</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Clothianidin (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">525</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 210880-92-5</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Dimethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">109217</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 60-51-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidacloprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">91029</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 138261-41-3</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidaclothiz (99.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Toronto Research Chemical</td>
			<td style="width:175px;">I275000</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 105843-36-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Kinetin (KT, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">K8010</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 525-79-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Omethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">105491</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 1113-02-6</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">P8070</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 25249-54-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Sucrose</td>
			<td style="width:188px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:175px;">5511</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 57-50-1</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Thiamethoxam (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">20625</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 153719-23-4</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">T8170</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 298-96-4</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:188px;">2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Guangzhou Saiguo Biotech</td>
			<td style="width:175px;">D8100</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 94-75-7</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:188px;">chiral column</td>
			<td style="width:188px;">Agilent CYCLOSIL-B</td>
			<td>112-6632</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Gas chromatography (GC)</td>
			<td style="width:188px;">Shimadu</td>
			<td>2010-Plus</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Flame Photometric Detector (FPD)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">High-performance liquid chromatography (HPLC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Ultraviolet detector (UV)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">HSS T3 C18 column</td>
			<td style="width:188px;">Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (100 mm &#215; 2.1 mm &#215; 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Agilent</td>
			<td>1290-6545</td>
			<td style="width:123px;">Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Thermo Scientific</td>
			<td>Ultimate 3000-Q Exactive Focus</td>
			<td style="width:123px;">Connected to a Orbitrap mass spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves

פלטפורמה לחקר חילוף החומרים קוטל חרקים באמצעות רקמות מבחנה של צמח תה פותחה. עלים של שתילי תה סטרילי המושרה כדי ליצור שיחה רופפת על מורראשיג ' ו Skoog (MS) בסיס מדיה עם הורמוני הצמח 2, 4-diלורוophenאוקסיאנפנול חומצה (2, 4-D, 1.0 mg L-1) ו kinetin (KT, 0.1 mg l-1). Callus נוצר לאחר 3 או 4 סיבובים של subculturing, כל אחד נמשך 28 ימים. יבלות משוחרר (כ 3 גרם) היה לאחר מכן מחוסן לתוך מדיה נוזלי B5 המכיל את אותו הורמוני צמח היה תרבותי באינקובטור רועד (120 rpm) בחושך ב 25 ± 1 ° c. לאחר 3 שלוש ארבע תרבויות, השעיית תא נגזר מעלה תה הוקמה ביחס תת-תרבות החל בין 1:1 ו 1:2 (אמא ההשעיה נוזל: בינוני טרי). באמצעות פלטפורמה זו, שישה קוטלי חרקים (5 μg mL-1 כל thiamethoxam, imidacloprid, מרחאמפריד, imidacloprid, מתודיטה, ו-omethoate) נוספו לתרבות ההשעיה של התה הנגזר של התא. מעקב אחר חילוף החומרים של הקוטלי חרקים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וכרומטוגרפיה של גז. כדי לאמת את התועלת של תרבות תא תה ההשעיה, מטבוליטים של thiamethoxan ו diמתואט הקיימים בתרביות תאים מטופלים וצמחים שלמים הושוו באמצעות ספקטרומטר מסה. בתרבויות תה מטופלים, שבעה מטבוליטים של טימאמתוסן ושני מטבוליטים של דימיואט נמצאו, בעוד שבצמחים שלמים שטופלו, רק שני מטבוליטים של תיאמטוקסאם ואחד מדיותוטה נמצאו. השימוש בתא מושעה באופן מפושט את ניתוח חילוף החומרים לעומת שימוש בצמחי תה שלמים, במיוחד עבור מטריצה קשה כגון תה.

האינדוקציה של יבלות מעלים שנקטפו מן השדה הגדלים עצי תה ומעלים שנקטח מתוך שתילי תה גדל בתוך מבחנה בסביבה סטרילית הושווה על ידי מדידת זיהום, בראונינג, ו אינדוקציה לאחר 28 ימים של טיפוח על MS מדיה ( איור 1A). צמיחה callus הוקלטה ב 20, 37, 62 ו 90 ימים של תרבות (א?...

Watch this Scientific Journal Video about Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves at JoVE.com

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

עבודה זו מציגה פרוטוקול להקמת תרבות ההשעיה התא נגזר תה (Camellia סיננסיס L.) עלים כי ניתן להשתמש כדי ללמוד את חילוף החומרים של תרכובות חיצוניות, כי ניתן לקחת על ידי המפעל כולו, כגון הדברה.

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

תה הוא אחד המשקאות הפופולריים ביותר ברחבי העולם. חומרי הדברה משמשים לעתים כדי להגן על צמחי תה מפני מזיקים. כמה חומרי הדברה מערכתיים עשויים להיעשות על ידי אנזימים בעץ התה.ולאחר מכן משולב באמצעות חמצון, הידרוליזה, או הפחתת תגובות. תרבות השעיה של תאי צמחים יכולות לשמש, בקלות, כדי לחקור את התנהגות חילוף החומרים של חומרי הדברה. לשיטה זו יש מספר יתרונות.ראשית, ניתן להפעיל אותו בתנאים של מיקרואורגניזמים חופשיים, ובכך למנוע את ההפרעה של השפלת חומרי ההדברה הנגרמת על ידי מיקרואורגניזמים. שנית, הוא יכול לספק לנו חומר קבוע בכל עת. לבסוף, זה יכול לשמש גם בקלות כדי להשוות תיאוריות של התנהגות חומרי הדברה בניסוי אחד.במחקר זה, אנו קובעים תרבויות השעיה תא תה מצבים משתנים של עלי תה. מצב התרבויות האופטימליות של השעיות תאים שימש אז להשוואת התנהגות ההתפוגגות של שישה חומרי הדברה. ניסוי זה יתבצע על ידי ג'יאו ויינג וגה גואקין.אלה צמחי התה הסטריליים שלנו שעובדים כמקור לתה. חותכים לאורך הכנף האמצעית של עלה סטרילי באמצעות מספריים. ואז, לחלק כל חצי לחתיכות קטנות של כ 0.3 פעמים 0.3 ס"מ בצלחת פטרי.מניחים את המזיקים הסטריליים על גבי מדיום חזותי של MS המכיל 2, 4-D ו- KT. שישה explants ניתן להציב בבקבוק 300 מיליליטר. תרבות העלה מתפוצץ בטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 28 ימים, בחר את הדור הראשון של callus המושרה ולאחר מכן להעביר בקבוק טרי.לרכוש את callus רופף ומשתנה לאחר שלוש עד ארבע תת תתי תתי. חותכים את הגדולים, יבלות משתנות ומשוחררות מהמדיום המוצק לחתיכות קטנות באמצעות להב כירורגי סטרילי בתנאים סטריליים. אנחנו בערך שלושה גרם של חתיכות קטנות של קאלוס.מקם את ה Callus לתוך B5 המכיל 2, 4-D ו KT. תרבות השעיית התא הנוזלי בטמפרטורה קבועה באינקובטור הרועד בחושך. לאחר שבעה עד עשרה ימים של פולחן, להסיר את בקבוק התרבות, ולהשאיר אותם לעמוד במשך כמה דקות. קח את העל-טבעי כמעים כאן יאלץ את התרבות למדיום טרי.הסר את היבלות הגדולות המזרזות. השג את תרבות השעיית התאים המטופחת הסופית לאחר ארבעה עד שלושה מחזורי תת-תרבות של 28 ימים כל אחד. שמור מדגם של תאים חיים ב 100 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות כתם תא הבקרה לפני כתמי הכדאיות.צנטריפוגה כל תרבות ההשעיה התא במשך שמונה דקות ב 6, 000 G.Remove את supernatant לפני השעיית התאים לתוך 5 מיליליטר של חיץ PBS וללחוץ אותו במשך דקה אחת ביד. הוסף 2.5 מיליליטר של פתרון TTC וללחוץ ביד שוב. דוגרים את התערובת במשך שעה באינקובטור עומד ב 13 מעלות צלזיוס.הוסף aliquot של ארבע מאות microliters על התצוגה כדי לעקר את פתרון המניות של כל neonicotinoids Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid, ו Imideproxase. הכל לשלב הראשון האורגני. דימתואט ו omethoate לתוך תרבויות השעיית התא בהתאמה.דגימות תרבות של השעיות תאים עם קוטלי חרקים בטמפרטורה קבועה, ומהירות אינקובטור רועדת. קח את הדגימות בימים שונים. כדי לבדוק את המדגם המכיל neonicotinoid, להסיר aliquot 1 מיליליטר של תרבות התא הומוגנית.מניחים אותו לתוך צינור צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה אותו ב 4, 000 G במשך שתי דקות. העבר את העל-טבעי דרך קרום מסנן מיקרומטר 0.22 לפני ניתוח על-ידי HPLC-UV ו- UPLC QTOF. כדי לבדוק את הדגימה, המשך בשלב הראשון האורגני.הסר aliquot 500 microliter של תרבות התא וממקום לתוך צינור צנטריפוגה 35 מיליליטר או צינור צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מיליליטר. הוסף 0.1 גרם של נתרן כלורי וחמישה מיליליטר לחלץ ממס לתוך צינור צנטריפוגה 35 מיליליטר של 500 דגימות microliter. מערבולת את התערובת לדקה אחת.ואז לאפשר להם לנוח במשך 10 דקות. קח 2.5 מיליליטר של על טבעי לתוך צינור זכוכית 10 מיליליטר להתאדות כמעט יובש באמצעות אידוי חנקן ב 14 מעלות צלזיוס. ממיסים את השאריות עם אצטון מיליליטר אחד.מערבולת למשך דקה אחת, להעביר אותו דרך קרום מסנן מיקרומטר 0.22 לפני ניתוח על ידי GC-FPD. שים חמישה צמחים בארבעה סירי פלסטיק ליטר במשך חמישה עשר ימים. הוסף אפס מיקרוגרם למיליליטר או 100 מיקרוגרם למיליליטר של Thiamethoxam או dimethoaxe לתוך סירי פלסטיק, בהתאמה.הכן את דגימת הצמח שלם על פי השיטה הקודמת, למעט השרייה מראש ולאחר מכן לנתח על ידי ספקטרומטריית מסה Orbitrap. השתמש HPLCUV כדי לזהות את התוכן ואת המוצרים המטבוליים של Thiamethoxam ו Acetimoprid באורך גל של 254 ננומטר, של Imidacloprid ו Imideproxase ב 270 ננומטר. זהה את התוכן של דימתוט ו omethoate על ידי GC-FPD באמצעות עמודה צינורית.לזהות את המטבוליטים של קוטלי חרקים בתרבות התא באמצעות QTOF UPRC עם טור פחמן-18. לזהות את המטבוליטים של קוטלי חרקים בתמצית צמח הבדיקה באמצעות ספקטרומטריית מסת UPLC Orbitrap. ה callus של צמח סטרילי אחד יש זיהום נמוך יותר השחמה אבל אינדקטיביות גבוהה יותר כי זה של callus מעלי תה הרים.ה callus נגזר עלים סטריליים היה תמיד צהבהב בהיר, בעוד callus נגזר עלים הרים היה לבן עם כתמים חומים. כאשר ריכוז KT היה 0.1 מיליגרם לליטר, callus היה צהבהב בצבע רופף במרקם. קצב הגידול של קאלוס היה הגבוה ביותר, עד 61.5% כאשר הריכוז של 2, 4-D היה מיליגרם אחד לליטר עם ריכוז של KT היה 0.5 מיליגרם לליטר.נתוני הצמיחה של callus היה הטוב ביותר ואת קצב הצמיחה של callus היה הגבוה ביותר הגיע 46.9%לכן, השילוב הטוב ביותר של צמח homent היה מיליגרם אחד לליטר של 2, 4-D ו 0.1 מיליגרם לליטר של KT לצמיחה callus תה. ה Callus כיסה לחלוטין את העלים על ידי תת תרבות הרביעית, וכאשר מחזור תת תרבות היה 28 ימים. ה Callus גדל במרץ עם צבע צהבהב ומרקם רופף ללא השחמה.לאחר השוואת הנתונים ברוטו של callus ואת הצבע של השעיית התא, המדיום נוזלי B5 היה מתאים יותר לתרבות השעיית התא. ערך ה- OD של תרבות המתלים של התא שימש לייצוג כמות צמיחת התאים. במהלך 75 ימי הטיפוח, היחס של 15 גרם לכל 40 מיליליטר היה בעל ערך OD גבוה משמעותית מזה של שני היחסים האחרים.כדאיות התא בתוך תרבות ההשעיה של תא התה נבדקה על ידי כתמי TTC. תרכובת TTC חסרת צבע ניתן להמיר formadin אדום על ידי דהידרוגנאז במיטוכונדריה של תאים חיים, אבל הצבע לא ניתן לשנות בתאים מתים. וזה כל התהליך של הקמת תרבות השעיית תא תה.זהו המחקר ההשוואתי הראשון של חילוף החומרים של חומרי הדברה שונים בתה באמצעות טכניקת תרבות השעיית תא. זוהו מספר מטבוליטים של חומרי הדברה, וחלקם נחקרו עוד יותר בצמחי תה שמורים. שיטה חדשה זו יכולה לשמש כמודל למחקרים מטבוליים חומרי הדברה בתה או צמחים אחרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...