Name: study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves
Uploaded: 2019-06-15T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo programa nacional de pesquisa & desenvolvimento (2016YFD0200900) da China, a Fundação Nacional de ciência natural da China (n º 31772076 e n º 31270728), China pós-doutorado Science Foundation (2018M630700), e fundo aberto de Laboratório chave do estado da biologia e da utilização da planta do chá (SKLTOF20180111).

1. cultura do calo do chá
Nota: as folhas estéreis foram derivadas de linhas de plânteria cultivadas in vitro, desenvolvidas pela primeira vez no grupo de pesquisa17. Todos os procedimentos até a seção 5 foram conduzidos em uma capa estéril do fluxo laminar, à exceção do tempo da cultura em uma incubadora.
<ol><li>Ajuste o pH dos dois meios (Murashige e Skoog [MS] meio basal e o meio líquido B5 de Gamborg) para 5,8 antes de autoclavagem (121 ° c, 20 min).<...

<ol>
	<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+identification,+quantitation,+and+principal+component+analysis+of+green+pu-erh,+green,+and+white+teas+using+UPLC/DAD/MS.">Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS.</a> Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).</li><li>Alcazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+green,+white,+black,+Oolong,+and+Pu-erh+teas+according+to+their+free+amino+acids+content.">Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).</li><li>Kopjar, M., Tadic&#180;, M., Piliz&#711;ota, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+content+and+antioxidant+activity+of+green,+yellow+and+black+tea+leaves.">Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves.</a> Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).</li><li>Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+QuEChERS+sample+preparation+method+for+the+analysis+of+70+pesticide+residues+in+tea+using+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).</li><li>Hou, R. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+acephate+using+a+developed+bacterial+consortium+and+toxicological+analysis+using+earthworms+(Lumbricus+terrestris)+as+a+model+animal.">Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal.</a> International Biodeterioration &amp; Biodegradation. 69, 1-9 (2012).</li><li>Ford, K. A., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metabolism+and+pharmacokinetics+of+seven+neonicotinoid+insecticides+in+spinach.">Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).</li><li>Frear, D. S., Swanson, H. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+Translocation,+Metabolism,+and+Distribution+of+Glyphosate+in+Nontarget+Tea+Plant+(Camellia+sinensis+L).">Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).</li><li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Extraction+Method+for+Determination+of+Neonicotinoid+Residues+in+Tea.">Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).</li><li>Karmakar, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence,+metabolism+and+safety+evaluation+of+thiamethoxam+in+tomato+crop.">Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop.</a> Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).</li><li>Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).</li><li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Metabolic+Behaviors+of+Six+Systemic+Insecticides+in+a+Newly+Established+Cell+Suspension+Culture+Derived+from+Tea+(L.)+Leaves.">Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).</li><li>Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures.">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).</li><li>Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+plant+growth+regulators+on+cell+growth+and+ginsenoside+saponin+production+by+suspension+cultures+of+Panax+quinquefolium.">Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium.</a> Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoterpenoids+and+aroma+compounds+from+cell+suspension+cultures+of+Camellia+sinensis.">Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).</li><li>Lei, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevent+Browning+of+Axillary+Buds+in+vitro+Culture+of+Camellia+sinensis.">Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis.</a> Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).</li><li>Hou, X., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+various+nitrogen+sources+on+the+growth+and+nitrate+assimilation+indicator+of+suspension+roselle+cell.">The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell.</a> Guihaia. 18, 169-172 (1998).</li><li>Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotic+Metabolism+in+Plants:+In+vitro+Tissue,+Organ,+and+Isolated+Cell+Techniques.">Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques.</a> ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).</li></ol>

Este artigo apresenta o processo detalhado de estabelecimento de um modelo de metabolismo de pesticidas no tecido vegetal do chá, incluindo a seleção de explantes, a determinação da viabilidade celular, e o estabelecimento de uma cultura de suspensão de células de chá com alta metabólica Atividade. Todas as partes de um tecido vegetal podiam ser usadas para iniciar o calo em um ambiente esterilizado25. As folhas de chá foram escolhidas para a iniciação do calo neste estudo, não soment...

O chá é uma das bebidas não alcoólicas mais consumidas no mundo1,2. O chá é produzido a partir das folhas e gemas do Woodyperene Camellia sinensis L. as plantas de chá são cultivadas em vastas plantações e são suscetíveis a numerosas pragas de insetos3,4. Os insecticidas do organophosphorus e do neonicotinóides são usados frequentemente como insecticidas sistemáticas5 para proteger plantas de chá das pragas tais como whiteflies, funis da folha, e alguma espécie do lepidóptero6,7. Após a aplicação, estes insecticidas são absorvidos ou translocalizados na planta. Dentro da planta, esses inseticidas sistêmicas podem ser transformados por meio de reações de hidrólise, oxidação ou redução por enzimas vegetais. Estes produtos da transformação podem ser mais polares e menos tóxicos do que os compostos do pai. No entanto, para alguns organofosforados, as Bioatividades de alguns produtos são mais elevadas. Por exemplo, o acefato metaboliza-se nos metamidofos mais tóxicos8,9, e dimetoato no ometoato10,11. Os estudos metabólicos da planta são assim importantes para determinar o Fate de um insecticida dentro de uma planta12.
As culturas de tecidos vegetais têm sido provadas como uma plataforma útil para investigar o metabolismo de pesticidas, com os metabólitos identificados semelhantes aos encontrados em plantas intactas13,14,15. O uso de culturas de tecidos, particularmente culturas de suspensão celular, tem várias vantagens. Em primeiro lugar, experimentos podem ser realizados livres de microrganismos, evitando assim a interferência da transformação de pesticidas ou degradação por micróbios. Em segundo lugar, a cultura do tecido fornece materiais consistentes para o uso a qualquer hora. Em terceiro lugar, os metabolitos são mais fáceis de extrair das culturas do tecido do que das plantas intactas, e as culturas do tecido têm frequentemente menos compostos interring e uma mais baixa complexidade dos compostos. Finalmente, as culturas do tecido podem mais facilmente ser usadas para comparar uma série de metabolismo dos insecticidas em um único experimento16.
Neste estudo, uma suspensão da pilha derivada das folhas do plantlet estéril-crescido do chá foi estabelecida com sucesso. A cultura de suspensão de células de chá foi então utilizada para comparar os comportamentos de dissipação de seis inseticidas sistêmicas.
Este protocolo detalhado é pretendido fornecer alguma orientação de modo que os investigadores possam estabelecer uma plataforma da cultura do tecido de planta útil para estudar o Fate metabólico de xenobióticos no chá.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:674px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Acetamiprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">46717</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 135410-20-7</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Acetonitrile (CAN, 99.9%)</td>
			<td style="width:188px;">Tedia</td>
			<td style="width:175px;">AS1122-801</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 75-05-8</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Agar</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">A8190</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 9002-18-0</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Clothianidin (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">525</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 210880-92-5</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Dimethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">109217</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 60-51-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidacloprid (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">91029</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 138261-41-3</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Imidaclothiz (99.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Toronto Research Chemical</td>
			<td style="width:175px;">I275000</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 105843-36-5</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Kinetin (KT, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">K8010</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 525-79-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Omethoate (98.5%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">105491</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 1113-02-6</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">P8070</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 25249-54-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:188px;">Sucrose</td>
			<td style="width:188px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:175px;">5511</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 57-50-1</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Thiamethoxam (99.8%)</td>
			<td style="width:188px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:175px;">20625</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 153719-23-4</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:188px;">Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td style="width:175px;">T8170</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 298-96-4</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:188px;">2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, &#62;98.0%)</td>
			<td style="width:188px;">Guangzhou Saiguo Biotech</td>
			<td style="width:175px;">D8100</td>
			<td style="width:123px;">CAS No: 94-75-7</td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:188px;">chiral column</td>
			<td style="width:188px;">Agilent CYCLOSIL-B</td>
			<td>112-6632</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Gas chromatography (GC)</td>
			<td style="width:188px;">Shimadu</td>
			<td>2010-Plus</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Flame Photometric Detector (FPD)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">High-performance liquid chromatography (HPLC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260</td>
			<td style="width:123px;">Paired with Ultraviolet detector (UV)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">HSS T3 C18 column</td>
			<td style="width:188px;">Waters</td>
			<td>186003539</td>
			<td style="width:123px;">Chromatography column (100 mm &#215; 2.1 mm &#215; 1.8 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Agilent</td>
			<td>1290-6545</td>
			<td style="width:123px;">Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:188px;">Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)</td>
			<td style="width:188px;">Thermo Scientific</td>
			<td>Ultimate 3000-Q Exactive Focus</td>
			<td style="width:123px;">Connected to a Orbitrap mass spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study on the metabolism of six systemic insecticides in a newly established cell suspension culture derived from tea (camellia sinensis l.) leaves

Uma plataforma para estudar o metabolismo do insecticida usando in vitro os tecidos da planta de chá foi desenvolvida. As folhas das plântulas de chá estéreis foram induzidas para formar calo solto nos meios basais de Murashige e Skoog (MS) com os hormônios vegetais 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 1,0 mg L-1) e CINETINA (KT, 0,1 mg l-1). Callus formado após 3 ou 4 rodadas de subculturação, cada um com duração de 28 dias. O calo frouxo (aproximadamente 3 g) foi inoculado então em meios líquidos B5 que contêm os mesmos hormônios de planta e foi cultivado em uma incubadora de agitação (120 rpm) no escuro em 25 ± 1 ° c. Após 3 − 4 subculturas, uma suspensão da pilha derivada da folha do chá foi estabelecida em uma relação da subcultura que varia entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco). Usando esta plataforma, seis insecticidas (5 μg mL-1 cada Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, e omethoate) foram adicionados na cultura folha-derivada do chá da suspensão da pilha. O metabolismo dos inseticidas foi rastreado usando cromatografia líquida e cromatografia gasosa. Para validar a utilidade da cultura da suspensão da pilha de chá, os metabolitos do tiametoxam e do dimetoato atuais em culturas de pilha tratadas e em plantas intactas foram comparados usando a espectrometria maciça. Em culturas tratadas da pilha de chá, sete Metabolites de tiametoxam e dois Metabolites do dimetoato foram encontrados, quando em plantas intactas tratadas, somente dois Metabolites do tiametoxam e um do dimetoato foram encontrados. O uso de uma suspensão celular simplificou a análise metabólica em comparação com o uso de plantas de chá intactas, especialmente para uma matriz difícil, como o chá.

A indução de calo de folhas colhidas de árvores de chá cultivadas em campo e de folhas excisadas de plântulas de chá cultivadas in vitro em ambiente estéril foi comparada através da medição de contaminação, escurecimento e indução após 28 dias de cultivo em MS Media ( Figura 1a). O crescimento do calo foi registrado aos 20, 37, 62 e 90 dias de cultura (Figura 1b). O calo derivado das folhas cultivadas in vitro most...

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

O chá é uma das bebidas mais populares em todo o mundo. Pesticidas às vezes são usados para proteger plantas de chá de pragas. Alguns pesticidas sistêmicos podem ser feitos para isso por enzimas em árvore de chá.E então integrado através de oxidação, hidrólise ou reações de redução. Culturas de suspensão de células vegetais podem ser usadas como um, facilmente para estudar o comportamento do metabolismo vegetal de pesticidas. Este método tem várias vantagens.Em primeiro lugar, pode ser operado em condições de microrganismos livres, evitando assim a interferência da degradação dos pesticidas causada pelos micróbios. Em segundo lugar, pode fornecer material constante para nós a qualquer momento. Finalmente, também pode ser usado facilmente para comparar teorias do comportamento de pesticidas em um único experimento.Neste estudo, estabelecemos culturas de suspensão de células de chá a partir de cores variáveis de folhas de chá. O status ideal das culturas das suspensões celulares foi então usado para comparar o comportamento de dissipação de seis pesticidas. Este experimento será conduzido por Jiao Weiting e Ge Guoqin.Esta é a nossa planta estéril de chá que funciona como fonte de explante. Corte ao longo da asa média de uma folha estéril usando uma tesoura. E então, subdividir cada metade em pequenos pedaços de cerca de 0,3 vezes 0,3 centímetros em uma placa de Petri.Coloque as explantas estéreis no meio visual ms contendo 2, 4D e KT. Seis explantas podem ser colocadas em um frasco de 300 mililitros. Cultura a folha explanta a uma temperatura constante de 25 graus Celsius no escuro. Após 28 dias, selecione a primeira geração de calo induzido e depois transfira para frasco fresco.Adquira o calo solto e variável após três a quatro subculturas. Corte os grandes, calos variáveis e soltos do meio sólido em pequenos pedaços usando uma lâmina cirúrgica estéril em condições estéreis. Somos cerca de três gramas dos pequenos pedaços de um calo.Coloque o calo em B5 contendo 2, 4-D e o KT. Cultume a suspensão da célula líquida a uma temperatura constante na incubadora de agitação no escuro. Depois de sete a dez dias de cultivo, remova o frasco de cultura, e deixe-os de pé por alguns minutos. Tome o supernante como sedimento aqui forçará a cultura a um meio fresco.Remova os calos grandes precipitados. Obtenha a cultura final de suspensão celular bem cuidada após quatro a três ciclos de subcultura de 28 dias cada. Mantenha uma amostra de células vivas a cem graus celsius por dez minutos como a célula de controle antes da coloração de viabilidade.Centrifugar toda a cultura de suspensão celular por oito minutos a 6.000 G.Remova o supernasce antes de suspender as células em 5 mililitros de tampão PBS e agite-o por um minuto à mão. Adicione 2,5 mililitros da solução TTC e aperte à mão novamente. Incubar a mistura por uma hora em uma incubadora em pé a 13 graus Celsius.Adicione uma alíquota de 400 microliters em vista para esterilizar a solução de estoque de todos os neonicotinóides Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid e Imideproxase. Tudo para a primeira fase orgânica. Dimetonato e omethoato nas culturas de suspensão celular, respectivamente.Amostras de cultura de suspensões celulares com inseticidas em temperatura constante, e aceleração da incubadora. Pegue as amostras em dias diferentes. Para testar a amostra contendo um neonicotinóide, remova uma alíquota de 1 mililitro da cultura celular homogênea.Coloque-o em um tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro e centrifuá-lo a 4.000 G por dois minutos. Passe o supernante através de uma membrana de filtro de 0,22 micrômetros antes da análise por HPLC-UV e UPLC QTOF. Para testar a amostra, continue na primeira fase orgânica.Remova uma alíquota de 500 microliter da cultura celular e coloque em um tubo de centrífuga de 35 mililitros ou tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro. Adicione 0,1 gramas de cloreto de sódio e cinco mililitros extraem solvente no tubo de centrífuga de 35 mililitros das 500 amostras de microliter. Vórtice a mistura por um minuto.E então deixe-os descansar por 10 minutos. Pegue 2,5 mililitros de supernascentes em um tubo de vidro de 10 mililitros e evapore até a quase secura usando um evaporador de nitrogênio a 14 graus Celsius. Dissolva o resíduo com um mililitro de acetona.Vórtice por um minuto, passe-o através de uma membrana de filtro de 0,22 micrômetros antes da análise por GC-FPD. Coloque cinco plantas em quatro potes de plástico de quatro litros por quinze dias. Adicione zero micrograma por mililitro ou 100 microgramas por mililitro de Thiamethoxam ou dimetoaxe em potes plásticos, respectivamente.Prepare a amostra intacta da planta de acordo com o método anterior, exceto para pré-imersão e, em seguida, analise pela espectrometria de massa orbitrap. Use um HPLCUV para detectar o conteúdo e os produtos metabólicos do Tiatoxam e Acetimoprid em comprimentos de onda de 254 nanômetros, e de Imidacloprid e Imideproxase a 270 nanômetros. Detecte o conteúdo de dimetoato e omethoato por GC-FPD usando uma coluna tubular.Detecte os metabólitos de inseticidas na cultura celular usando o UPRC QTOF com uma coluna Carbono-18. Detecte os metabólitos de inseticidas no extrato de planta de teste usando espectrometria de massa UPLC Orbitrap. O calo de uma planta estéril tem menor contaminação, mas maior indutividade que a do calo das folhas de chá colhidas.O calo derivado de folhas estéreis sempre foi amarelado brilhante, enquanto o calo derivado de folhas colhidas era branco com manchas marrons. Quando a concentração de KT era de 0,1 miligrama por litro, o calo era amarelado de cor e solto em textura. A taxa de crescimento do calo foi a mais alta, até 61,5% quando a concentração de 2, 4-D foi de um miligrama por litro com a concentração de KT foi de 0,5 miligramas por litro.Os dados de crescimento do calo foram os melhores e a taxa de crescimento do calo foi a mais alta chegou a 46,9% Portanto, a melhor combinação de planta homent foi de um miligrama por litro de 2, 4D e 0,1 miligrama por litro de KT para o crescimento do chá calo. O calo cobriu completamente as folhas pela quarta subcultura, e quando o ciclo de subcultura foi de 28 dias. O calo tinha crescido vigorosamente com cor amarelada e textura solta e sem browning.Após comparar os dados brutos do calo e a cor da suspensão celular, o meio líquido B5 foi mais adequado para a cultura de suspensão celular. O valor de OD da cultura de suspensão celular foi usado para representar a quantidade de crescimento celular. Durante os 75 dias de cultivo, a razão de 15 gramas por 40 mililitros teve um valor de OD significativamente maior do que o das outras duas proporções.A viabilidade celular dentro da cultura de suspensão da célula de chá foi testada pela coloração TTC. O composto TTC incolor pode ser convertido em formadin vermelho por desidrogenase em mitocôndrias de células vivas, mas a cor não pode ser alterada em células mortas. E este é todo o processo de estabelecer uma cultura de suspensão de células de chá.Este é o primeiro estudo comparativo do metabolismo de diferentes pesticidas no chá usando uma técnica de cultura de suspensão celular. Vários metabólitos de pesticidas foram identificados, e alguns deles foram investigados em plantas de chá mantidas. Este novo método poderia servir como modelo para estudos metabólicos de pesticidas em chá ou outras plantas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...