Name: in vivo inhibition of microrna to decrease tumor growth in mice
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00
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Siamo grati a Raquel Arocha Riesco per la sua assistenza con il trattamento e la cura dei topi. Ringraziamo il Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) e il Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcellona (Spagna) per aver donato rispettivamente le cellule CMV-Firefly luc- IRES-EGFP e Cal62-Luc.

La sperimentazione animale è stata effettuata in conformità con il Diritto comunitario (86/609/CEE) e la legge spagnola (R.D. 1201/2005), con l'approvazione del Comitato Etico del Superiore del Consejo di Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Spagna).
1. Inoculazione del fianco delle cellule e trattamento dell'antagomiR intratutuale
<ol><li>Preparazione cellulare
	<ol>
<li>Ingegnere una linea cellulare del cancro della tiroide umana Cal62 (mutazioni KRASG12R e p53<...

<ol>
	<li>Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+Thyroid+Cancer+Incidence+and+Mortality+in+the+United+States.">Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).</li><li>Landa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+hallmarks+of+poorly+differentiated+and+anaplastic+thyroid+cancers.">Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).</li><li>Gregory, R. I., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+and+cancer.">MicroRNA biogenesis and cancer.</a> Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Hammond, S. 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Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).</li><li>Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+microRNA+expression+in+thyroid+neoplasias.">Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).</li><li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+thyroid+development,+function+and+tumorigenesis.">MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).</li><li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Deregulation+in+Anaplastic+Thyroid+Cancer+Biology.">MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).</li><li>Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+Tumours:+Advances+in+the+molecular+pathogenesis+of+thyroid+cancer:+lessons+from+the+cancer+genome.">Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome.</a> European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).</li><li>Riesco-Eizaguirre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-146b-3p/PAX8/NIS+Regulatory+Circuit+Modulates+the+Differentiation+Phenotype+and+Function+of+Thyroid+Cells+during+Carcinogenesis.">The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis.</a> Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).</li><li>Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-146b-5p+upregulates+migration+and+invasion+of+different+Papillary+Thyroid+Carcinoma+cells.">MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 16, 108 (2016).</li><li>Lee, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-222+and+microRNA-146b+are+tissue+and+circulating+biomarkers+of+recurrent+papillary+thyroid+cancer.">MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer.</a> Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-146b-5p+promotes+metastasis+and+induces+epithelial-mesenchymal+transition+in+thyroid+cancer+by+targeting+ZNRF3.+Cellular+Physiology+and+Biochemistry.">MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry.</a> International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).</li><li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-146b+promotes+PI3K/AKT+pathway+hyperactivation+and+thyroid+cancer+progression+by+targeting+PTEN.">MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN.</a> Oncogene. , (2018).</li><li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness.">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , (2019).</li><li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer.">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li></ol>

Questo documento descrive un metodo per studiare la funzione in vivo di un miRNA al fine di comprendere meglio il suo ruolo nell'avvio e nella progressione del tumore, e il suo potenziale come bersaglio terapeutico nel cancro della tiroide. I modelli di xenotrapianto tumorale qui descritti si basano sull'uso di cellule che possono essere monitorate dal loro segnale di bioluminescenza, permettendo la misurazione della crescita del tumore in vivo sotto l'influenza di un trattamento. Inoltre, descriviamo l'uso di un trattam...

Il cancro della tiroide è una malignità endocrina con un'incidenza crescente, anche se in termini generali ha un buon risultato1. Tuttavia, alcuni pazienti sviluppano forme aggressive della malattia che non sono curabili e le basi molecolari sono poco comprese2.
I miRNA sono RNA non codificanti lunghi 22 nucleotidi che regolano l'espressione genica in molti tessuti, in genere legandosi di coppie di base alla regione non traslazionale 3' (3'UTR) di RNA messaggeri bersaglio (mRNA), innescando la degradazione dell'mRNA o la repressione traslazionale 3 (COM del nome , 4. Ci sono sempre più prove che dimostrano che la deregolazione dell'espressione del microRNA è un segno distintivo del cancro, in quanto queste molecole modulano la segnalazione proliferale, la migrazione, l'invasione e la metastasi, e possono fornire resistenza all'apoptosi 5,6. Negli ultimi anni, molti studi hanno identificato i miRNA come potenziali biomarcatori perla diagnosi e la prognosi del cancro, nonché obiettivi terapeutici 7, fornendo una nuova dimensione alla valutazione e al trattamento del cancro.
I miRNA hanno preso il centro dell'oncologia molecolare umana come fattori chiave dei neoplasmi tiroidei umani8,9,10,11,12. Tra i miRNA up-regolato, miR-146b è altamente sovraespresso nei tumori Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) e ha dimostrato di aumentare significativamente la proliferazione cellulare, e di essere associato con aggressività e prognosi triste6, 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15. Inoltre, miR-146b regola diversi geni tiroidei coinvolti nella differenziazione12e anche importanti geni soppressori tumorali come PTEN16 e DICER117. Nonostante la loro importanza nella biologia del cancro, la terapia del cancro basata su miRNA è ancora nelle sue fasi iniziali, e pochissimi studi hanno affrontato il cancro della tiroide - il più frequente dei tumori endocrini18. Qui descriviamo un protocollo usando due diversi modelli murini con tumori di origine umana, in cui la somministrazione di un inibitore di miRNA sintetico (antagomiR) che inibisce specificamente un miRNA cellulare può bloccare la crescita del tumore. Per la prima volta abbiamo usato un modello comune di xenotrapianto, e la somministrazione intratumorale locale di un antagomiR ha diminuito la crescita tumorale misurata come riduzione della bioluminescenza tumorale16. Poiché la creazione di robusti modelli murini che imitano la progressione del tumore umano è essenziale per sviluppare approcci terapeutici unici, l'impianto ortotopico dei tumori umani primari è una piattaforma più preziosa per la convalida clinica di nuovi farmaci modelli di impianto sottocutaneo. Così, al fine di valutare meglio il potenziale terapeutico dell'antagomir, abbiamo usato un modello di topo ortotopico con consegna sistemica nel flusso sanguigno, ottenendo gli stessi risultati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464088</td>
			<td>In Vivo Ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DICER antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14601</td>
			<td>IHQ: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IVF3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464077</td>
			<td>In Vivo Ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92552</td>
			<td>WB: 1/2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-7974</td>
			<td>WB: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo inhibition of microrna to decrease tumor growth in mice

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica attraverso la loro capacità di destabilizzare l'mRNA e inibire la traduzione degli mRNA bersaglio. Un numero sempre crescente di studi ha identificato i miRNA come potenziali biomarcatori per la diagnosi e la prognosi del cancro, nonché come obiettivi terapeutici, aggiungendo una dimensione aggiuntiva alla valutazione e al trattamento del cancro. Nel contesto del cancro della tiroide, la tumorigenesi deriva non solo da mutazioni in geni importanti, ma anche dalla sovraespressione di molti miRNA. Di conseguenza, il ruolo dei miRNA nel controllo dell'espressione genica della tiroide si sta evolvendo come un importante meccanismo nel cancro. Qui, presentiamo un protocollo per esaminare gli effetti della somministrazione di miRNA-inibitori come modalità terapeutica nel cancro della tiroide utilizzando modelli di xenotrapianto del tumore umano e modelli murini ortotopici. Dopo aver engineering cellule tumorali della tiroide stabili che esprimono GFP e luciferasi, le cellule vengono iniettate nei topi nudi per sviluppare tumori, che possono essere seguiti da bioluminescenza. L'inibizione in vivo di un miRNA può ridurre la crescita del tumore e upregulate bersagli genici genici del miRNA. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'importanza di un miRNA determinato in vivo, oltre a identificare nuovi bersagli terapeutici.

Abbiamo usato due diversi modelli di topi per determinare se la neutralizzazione di un miRNA potrebbe sopprimere la crescita tumorale. Di conseguenza, le cellule tiroide del tumore umano Cal62-luc sono state iniettate sottocutaneamente nei fianchi dei topi nudi per generare un modello di xenografo. Dopo due settimane, i tumori sono stati stabiliti e potrebbero essere misurati con pinze. A quel punto, i topi sono stati iniettati intratumoralmente con l'inibitore miR-146b, o un controllo appropriato, e il volume del tumore...

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In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

Questo protocollo descrive i modelli murini xenoinpito e ortotopici della tumorigenesi tiroidea umana come piattaforma per testare i trattamenti inibitori basati su microRNA. Questo approccio è ideale per studiare la funzione degli RNA non codificanti e il loro potenziale come nuovi obiettivi terapeutici.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Eseguiamo la prima terapia, basata su un inibitore del microRNA in un modello di cancro alla tiroide. Queste terapie in via di sviluppo mostrano promesse per il trattamento di questa malattia. Questo tipo di modello ortotopico, utilizzando una via sistemica di erogazione del trattamento, facilita la convalida di un nuovo farmaci a base di microRNA.Sebbene usiamo un modello ortotopico per impiantare cellule tumorali tiroidee umane nelle tiroide del topo, questi modelli potrebbero essere tutti sistemici per altri tipi di cancro. A dimostrare la procedura con Julia Ramirez-Moya e Adrian Acuna sarà Raquel Arocha Riesco. È un tecnico del nostro istituto.Dopo aver stabilito un mezzo incompleto della linea cellulare del cancro alla tiroide umana CAL-62, sospendere un'aliquota 1 per 10 alla 6a cella in 50 microlitri di PBS a 4 gradi celsius e mescolare le cellule con un volume uguale di matrice di membrana basale. Caricare le cellule in una siringa da 1 millilitro, dotata di un ago da mezzo pollice da 27 gage, e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri del campione nel fianco sinistro di un topo nudo C della valvola immunodifesa di 6 settimane. Due settimane dopo l'iniezione, aggiungere la soluzione antagomiR o tampone di trattamento controllato a 160 microlitri di reagente di consegna in vivo a temperatura ambiente in un tubo da 1 punto 5 millilitro.E vortice immediatamente la soluzione per 10 secondi per garantire la complessità della miscela. Incubare la soluzione di trattamento per 30 minuti a 50 gradi celsius, seguita da una breve centrifugazione in una micro centrifuga. Quindi, diluire il complesso di trattamento sedimentato di sei volte con PBS fresco e miscelazione accurata.E iniettare l'intero volume di 200 microliter del trattamento direttamente nel tumore. Iniettare 50 microlitri di una soluzione di substrato D-Luciferina da 40 milligrammi per litro 2 volte a settimana, in ogni animale sperimentale. Assicurarsi di confermare una mancanza di risposta al dito del piedi dopo l'anestesia isoflurane.Posizionare l'animale nella camera di un sistema di imaging a bioluminescenza in vivo e immaginare il segnale di bioluminescenza con il software di imaging in vivo secondo protocolli standard. Quindi analizzare la crescita tumorale. Confrontare entrambi i trattamenti e determinare il significato e le differenze di crescita utilizzando un test T.Per l'inoculazione ortotopica delle cellule tumorali tiroidee sospendere un'aliquota di cellule CAL-62 in 5 microlitri di PBS e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di analgesico e 100 microlitri di antibiotico in un topo nudo C della valvola di 7 settimane. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare l'animale al microscopio sezionante e disinfettare il collo dell'animale con iodopovidone. Successivamente, fare un'incisione di circa 2 centimetri nella pelle e spostare il glande salivare per esporre il collo.Utilizzare le forcep di dissezione e/o le forbici per sezionare i muscoli della cinghia per esporre la trachea e la ghiandola tiroidea e utilizzare una siringa da 10 microliter, per iniettare il volume di 5 microliter delle cellule tumorali nel lobulo tiroideo destro, situato sul lato della cartilagine cricoide. Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, riposizionare il glande salivare e utilizzare suture intrecciate, rivestite e non assorbibili di seta per chiudere l'incisione. Quindi applicare iodopovidone sull'area della ferita e posizionare il mouse su una coperta termica con monitoraggio fino al completo recupero.due o tre settimane dopo l'iniezione di cellule intratiroidi, preparare la soluzione di trattamento come dimostrato e fornire la soluzione per via endovenosa mediante iniezione retroorbitale del seno venoso dell'animale anestetizzato che porta il tumore alla tiroide. In questo esperimento rappresentativo, la crescita dei tumori iniettati per via intratumorale senza inibitore del microRNA 146B, è stata significativamente soppressa rispetto al controllo negativo. I livelli di espressione intratumorale di alcuni marcatori di proliferazione sono stati osservati anche in bassi livelli, nei tumori trattati con antagomiR, rispetto ai tumori di controllo.Inoltre, il recupero dei bersagli di micro-RNA può essere studiato attraverso l'analisi dell'RNA estratto dal tumore, o proteina. Rivelando collettivamente che l'inibizione in vivo dei singoli microRNA è efficace e può essere sfruttata terapeuticamente per i trattamenti del cancro alla tiroide. L'analisi istologica dei tumori tiroidei stabiliti nei topi come dimostrato, consente la colorazione per le cellule epiteliali che circondano il tumore, rivelando l'architettura follicolare tiroidea del tessuto tumorale.In particolare, l'iniezione endovenosa di inibitore del microRNA 146B nei topi, con un tumore stabilito, si traduce in una significativa diminuzione del volume tumorale rispetto agli animali trattati con controllo. Inoltre, l'espressione del nuovo microRNA 146B bersaglio DICER1 nel tumore primario, aumenta dopo il trattamento anti micro-RNA 146B, sottoscrivendo ulteriormente il potenziale dell'inibizione dell'espressione indogena di micro-RNA e quindi il ripristino dei suoi geni bersaglio come terapia nel cancro alla tiroide. Questa tecnica, e i successivi risultati della lipina, aprono la possibilità di esplorare nuove terapie a base di RNA non curanti per il trattamento del cancro alla tiroide.

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