Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Vi takker Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecilia Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Hanne N. Janal og Dr. Iriana Zanin for udviklingen af denne undersøgelse. Vi anerkender også Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) for at donere den stamme, der er analyseret i denne undersøgelse.

1. forberedelse af kultur medier
<ol><li>Forberede sabouraud dextrose agar (SDA). Suspendere 65 g af SDA suppleret med chloramphenicol (50 mg/L) i 1000 mL destilleret vand. Kog til at opløse mediet helt. Steriliseres ved autoklavering ved 15 PSI (121° C) i 30 min. afkøles til 45-50 ° C. Bland godt og hæld 20 mL af SDA i sterile Petri plader (størrelse: 100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Forberede gæren nitrogen base (YNB) medium suppleret med 100 mM glucose ved at blande 6,7 g YNB og 18 g af dextrose til 1.000 mL i ultr...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

De mest kritiske trin til vellykket dyrkning af C. albicans biofilm er: 1) at gøre før inokulat og inokulum i YNB medium suppleret med 100 mM glucose; 2) at vente 90 min for vedhæftning fase og omhyggeligt vaskes to gange brønde med 0,89% NaCl til at fjerne ikke-overholdt celler; og 3) at føje RPMI medium til overholdt cellerne til at starte Biofilmdannelse, da RPMI vil stimulere hyfer vækst. Aneuploidies kan opstå, når dyrkning af C. albicans. Det er derfor vigtigt ikke at bruge kolonier, der ...

Den øgede forekomst af diabetes, immunsupprimerende behandling programmer, HIV-smitte, AIDS-epidemien, invasive kliniske procedurer og bredspektret antibiotika forbruget i de seneste år har øget forekomst af Candida albicans relaterede sygdomme1,2. C. albicans infektioner er almindeligvis relateret til biofilm udvikling og kan forårsage kliniske manifestationer, som candidiasis eller systemiske manifestationer, som candidemia1,2. En af de mest bemærkelsesværdige virulens faktorer af biofilm vækst er ekstracellulære polysaccharid matrix etablering. Biofilmdannelse samarbejder for at øge modstanden mod eksisterende svampemidler, miljømæssige stress og vært immun mekanismer3.
Biofilm vækst af C. albicans begynder med den tidlige overholdelse af planktoniske celler til et substrat, efterfulgt af udbredelsen af gærceller gennem substrat overflade og hyphal vækst. Den sidste fase af biofilm vækst er den modning fase, hvori gær-lignende udvikling er undertrykt, den hyphal udvikling udvider, og den ekstracellulære matrix omslutter biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrixen interagere for at danne mannan-glucan komplekse5,6. Samspillet mellem exopolysaccharides er afgørende for forsvaret af biofilm mod narkotika7. Dermed, begrænsning af EPS fra C. albicans ekstracellulære matrix kunne støtte udviklingen af nye antibiofilm protokoller for oral candidiasis kontrol.
Light regulerer vækst, udvikling og opførsel af flere organismer8 og det er blevet anvendt som et antimikrobielt i Fotodynamisk antimikrobiel kemoterapi (PACT). STABILITETSPAGTEN gælder en synligt lys af en bestemt bølgelængde og en lys-absorberende photosensitizer9. Photosensitizers har dog problemer med gennemtrængende biofilm, forårsager lavere effekt10. Terapeutiske agenter manglende fuldt infiltrere biofilm er en grund til, at biofilm lejlighedsvis modstå traditionelle antimikrobiel behandling3,5. Hvis du vil deaktivere de vedlagte mikrobielle celler, skal antimikrobielle stoffer gennemsyre gennem den ekstracellulære matrix; ikke desto mindre, EPS kendetegner en diffusional hindring for sådanne molekyler ved at spørge deres niveau af transport i biofilm eller ved at påvirke svaret af antimikrobielle med matrixen, selv11.
I betragtning af ulemperne af PAGTEN, brugen af lys i sig selv fremstår som en værdifuld forbedring. Foreløbige data viste, at behandling med blåt lys to gange om dagen betydeligt hæmmede produktionen af EPS-uopløseligt i Streptococcus mutans biofilm. Af reduktionen af EPS-uopløseligt formindsket blåt lys biofilm vækst. Ikke desto mindre, resultaterne af lysbehandling ved hjælp af rødt lys i C. albicans biofilm er knappe. Dermed, formålet med denne undersøgelse var at vurdere i hvilken måde lysbehandling ved hjælp af rødt lys påvirker vækst og arrangement af C. albicans biofilm. Til to gange daglig behandling, vi tilpasset vores laboratorium tidligere protokoller9,12 for at give en let og reproducerbare biofilm model, der leverer svar vedrørende levedygtighed, tør-vægt og ekstracellulære polysaccharider beløb efter rødt lys behandling. Samme protokol kan bruges til at teste andre behandlingsformer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere resultaterne af dagpenge røde lys behandling på væksten af Candida albicans biofilm. For at øge de planktoniske vækst af C. albicans SN425, voksede inoculums på Yeast Nitrogen Base medier. Til Biofilmdannelse af blev RPMI 1640 medier, som har høje koncentrationer af aminosyrer, anvendt til at hjælpe biofilm vækst. Biofilm på 48 h blev behandlet to gange om dagen for en periode på 1 min. med en ikke-kohærent lys enhed (rødt lys, bølgelængde = 635 nm; energitæthed = 87.6 J·cm-2). Som positiv kontrol (PC), 0,12% klorhexidin (CHX) blev anvendt, og som en negativ kontrol (NC), 0,89% NaCl blev anvendt til biofilm. Kolonidannende enheder (CFU), tør-vægt, opløselige og uopløselige exopolysaccharides var kvantificeret efter behandlinger. Kort, protokol præsenteres her er enkel, reproducerbare og giver svar vedrørende levedygtighed, tør-vægt og ekstracellulære polysaccharid beløb efter rødt lys behandling.

Figur 2 viser resultaterne af Log10 CFU/mL af C. albicans efter diæten behandlinger med rødt lys for 1 min. Red light betydeligt reduceret Log10 CFU/mL sammenlignet med NC (p = 0,004). Figur 3 præsenterer resultaterne af biomassen (mg) af C. albicans biofilm efter daglige behandlinger. Alle behandlede grupper viste reduktion af biomassen i forhold til NC (p = 0.000) og det røde lys beha...

Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daglige lysbehandling med rødt lys til Regulate Candida albicans Biofilm vækst

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere resultaterne af rødt lys ansøgning på væksten af Candida albicans biofilm. En ikke-kohærent rødt lys enhed med bølgelængde på 635 nm og energi tæthed af 87.6 J·cm-2 blev anvendt i hele vækst af Candida albicans biofilm for 48 h.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida er den mest almindelige årsag til dissemineret svampeinfektion hos immunkompromitterede værter. Den manglende terapeutiske midler til fuldt ud at infiltrere biofilm på grund af matrix er en af grundene til, at biofilm modstå traditionelle behandlinger. Vores protokol evaluerer, hvordan lysbehandling, ved hjælp af rødt lys, forstyrrer væksten og arrangementet af Candida albicans biofilm.De anvendte metoder er veletablerede, da den stamme, der anvendes i denne undersøgelse havde sin ekstracellulære matrix karakteriseret og lysenheden er blevet anvendt med succes på andre planktoniske mikroorganisme suspensioner og biofilm. Den største fordel ved denne enhed er reduktionen i behandlingstiden, hvilket gør den mere synlig for kliniske anvendelser. Når dyrkning Candida albicans være opmærksom på, at antistoffer kan erhverves.Derfor er det vigtigt ikke at bruge kolonier, der er mere end syv dage gamle, ikke at starte plader ved fire grader Celsius, og ikke at re-streak celler fra eksisterende plader. Ligeledes bør en stamme anvendes før 18 timers nattevækst. Når du bruger et spektrofotometer for første gang, er det vigtigt først at få kolonigård i antal enheder for at korrelere med optiske tæthedsværdier.Derfor vil eksperimenter begynde at bruge midten af vækstfasen i den indledende cellekoncentration på 10 til syv celler pr. milliliter. Denne cellekoncentration har vist sig at give de mest afhængige og stabile stof biofilm. Til at begynde, suspendere 65 gram SDA, suppleret med 50 milligram per liter Chloramphenicol, i 1, 000 milliliter destilleret vand i et bægerglas.Anlæt bægerglasset på et varmeapparat i kog for at opløse mediet helt. Overfør derefter mediet til en glasflaske. Placer hætten på flasken, men skru den ikke helt ned for at sikre, at flasken er i stand til at lufte ud.Anlæg flasken i en autoklave for at sterilisere opløsningen ved 15 PSI og 121 grader Celsius i 30 minutter. Cool løsningen til omkring 45 grader Celsius. Brug en engangs, steril pipette, til at blande godt, og pipette 20 milliliter SDA i sterile petriplader.For at forberede YNB medium, suppleret med 100 millimolar glukose, bland 6,7 gram YNB og 18 gram dextrose til 1.000 milliliter ultra rent vand i et bægerglas. Sæt en røre bar i bægeret og læg bægeret på en røreplade til at blande. Mediumn filtreres gennem et 0,22 mikrometer vakuumfiltersystem for at sterilisere.RPMI medium tilberedes ved at blande 10,4 gram RPMI-1640 og 34 gram MOPS til 1.000 milliliter ultra rent vand. Bland i en omrører uden varme og justere PH til syv ved at tilføje en normal natriumhydroxid. Steriliser mediet ved hjælp af et 0,22 mikrometer vakuumfiltersystem.Først tø mikroorganismen Candida albicans SN 425 ved omgivelsestemperatur. Seed 10 mikroliter af stopkulturen på tidligere tilberedte petriskåle indeholdende SDA, suppleret med Chloramphenicol. Inkuber petriskålene aerobisk ved 37 grader Celsius i 48 timer.For pre-inoculum bruge en steriliseret glidecreme til at plukke 10 kolonier af Candida albicans fra petriskåle og placere dem i en centrifuge rør, der indeholder 10 milliliter YNB medium, suppleret med glukose. Inkuber røret aerobisk ved 37 grader Celsius i 16 timer. Derefter forberede inoculums ved at tilføje denne starter kultur i frisk YNB medium, suppleret med glukose, i en 1 til 10 andel for fortynding.Brug spektrofotometeret til at måle den oprindelige OD ved 540 nanometer. Inod inoculums aerobically ved 37 grader Celsius i otte timer, og måle den endelige OD på 540 nanometer. Træk den sidste OD fra den oprindelige OD for at kontrollere, om inokulumenes OD er i vækstfasen i midten af loggen.For at opnå et inokulum med 10 til de syv celler pr. milliliter centrifugeres inokulumet i fem minutter ved 5, 500 gange G.Hæld supernatanten i et bæger indeholdende natriumhypochlorit, og tilsæt frisk YNB for at koncentrere inokulummet til halvdelen af det foregående volumen. Tilsæt en milliliter af inokulumet til hver brønd af en 24 brønd polystyren plade. Inkuber aerobisk ved 37 grader Celsius i 90 minutter for at tillade celle vedhæftning til bunden af brøndene.Biofilmene behandles i et minut med en milliliter 0,12% chlorhexidin for de positive kontrolbiofilm. For den negative kontrol, behandles biofilm i et minut med en milliliter steril, 0,89% natriumchlorid. Derefter vaskes brøndene to gange, et minut hver, med en milliliter steril 0,89% natriumchlorid for at fjerne ikke-klæbende celler.Tænd derefter for et ikke-sammenhængende rødt lys og brug en effektmåler til at måle lysets effekttæthed. Bestemme eksponeringstiden baseret på energitæthed kravet om 87,6 joule per kvadratcentimeter. Anstå pladen under det røde lys.Hold afstanden mellem lyskilden og biofilmen til fem milliliter for at undgå opvarmning af prøven. Efter eksponering i et minut, tilsæt en milliliter af det steriliserede RPMI medium til hver brønd, og inkubere pladerne ved 37 grader Celsius i løbet af natten. Om morgenen gentages den samme vask, lysbehandling, positive og negative kontrolbehandlinger og inkubation i seks timer med RPMI-medium.Igen, vaske biofilm to gange, udsætte dem for rødt lys, og udføre positive og negative kontrol behandlinger. Aspirere opløsningen i brøndene og tilsæt RPMI medium. Gentag inkubation, vask, let behandling, og positive og negative kontrol behandlinger, indtil opnå 48 timers biofilm udvikling.For at starte behandlingen skal du kassere mediet og tilføje en milliliter steril, 0,89% natriumchlorid til brønden, og brug en pipettespids til at ridse biofilmen fra brønden. Overfør den fjernede biofilm til et sterilt rør. Tilsæt en anden milliliter steril, 0,89% natriumchlorid til brønden.Skrab den igen og tilsæt suspensionen til det samme rør, for et samlet volumen på 2 milliliter. Kraftigt vortex biofilm suspension i et minut. Til CFU-analyse overføres en prøve på 0,1 milliliter fra biofilmsuspensionen til et mikrocentrifugerør indeholdende 900 mikroliter på 0,89 % natriumchloridopløsning for hver fortynding.Biofilmopløsningen fortyndes fra 10 til den negative til 10 til de negative fire i saltvandsopløsning. Frø 50 mikroliter af hver fortynding til SDA plader, og inkubere pladerne ved 37 grader Celsius i 48 timer. Tæl kolonierne, og anvend formlen.Til tørvægtanalyse skal mikrocentrifugerør vejes og mærkes. Der tilsættes 0,1 milliliter biofilmsaffjedringen og en milliliter absolut ethanol i rørene, og de opbevares ved negative 20 grader Celsius i 18 timer. Derefter centrifuge det 10,000 gange G i 10 minutter.Kassér supernatanten og læg rørene i en eksikator for at tørre prøverne i en uge. Veje mikrocentrifugerør igen, og gøre subtraktion for at opnå biomasse vægt. I dette eksperiment blev CFU reduceret sammenlignet med den negative kontrol, der blev behandlet med natriumchlorid, efter diætbehandlinger med rødt lys i et minut til Candida albicans biofilm.Resultaterne af biomassen af Candida albicans biofilm efter daglige behandlinger, viser det røde lys behandlet gruppe præsenteret lignende reduktion af biomasse til den observerede i den positive kontrolgruppe, behandlet med chlorhexidin. De to grupper viste også statistisk lighed med hinanden. Mens de begge viste reduktion af biomassen, sammenlignet med den negative kontrol behandlet med natriumchlorid.Ringere mængder af Candida albicans opløselige og uopløselige EPS, blev observeret i positiv kontrol, sammenlignet med negativ kontrol. Selv om det ikke er statistisk signifikant, reducerede per diemapplikationen af rødt lys numerisk mængden af EPS-opløselige og EPS uopløselige. Den negative kontrol og den røde lysbehandlede gruppe viste statistisk lighed.Måling af effekttætheden af lyset ved hjælp af en effektmåler, før behandlingen påbegyndes for at bestemme de nøjagtige anvendelsesperioder. Trinene sikrer, at energitætheden altid vil være 87,6 joule per centimeter kvadreret. Brug den formel, der tidligere er citeret.Målingen foretages ved hjælp af det samme fra lyset til flasken af pladerne, fem millimeter. En sammenhæng mellem lysbehandling og svampedræbende lægemidler kan studeres for at kontrollere, om forbehandling med rødt lys, efterfulgt af lægemiddelansøgning, forbedrer lægemiddelindtrængningen i biofilmen. Til den to gange daglige behandling tilpassede vi vores laboratorieprotokoller, hvilket giver en nem og reproducerbar biofilmmodel, der giver svar vedrørende levedygtighed, tørvægt og ekstracellulære polysaccharidmængder efter behandling med rødt lys.Protokollen er generisk og kan bruges til at teste andre behandlinger, ud over rødt lys, herunder narkotika, andre lys, eller kombinationen af lys og narkotika. Arbejde med mikroorganismer kræver særligt udstyr, såsom sikkerhedsbriller, knap lab coat, og nitro handsker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

At studere mikrobielle samfund<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Host-medieret samspil mellem<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I luftvejene

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: In Vivo overvågning af Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniske sår i en diabetisk Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Dyb Dermal injektion som en Model af Candida albicans hudinfektion histologisk analyser

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering af Candida albicans i murine mave-tarmkanalen ved hjælp fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Afklaring og Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo Assay at studere Candida albicans Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-medieret fotodynamisk terapi til at hæmme Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Brug af In Vivo-billeddannelse til screening for morfogenesefænotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...