Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

אנו מודים ד ר פאולה דה Silveira, ד ר Cecília בן מלונות שבדקתי Araújo דה קוסטה, שון מ מאולה, שיין מ מאולה, ד ר מערל (ש ע) Janal, Iriana Zanin ד ר לפיתוח של מחקר זה. אנו גם להכיר את ד ר אלכסנדר ד ג'ונסון (UCSF) עבור תרומת המתח שנותחו במחקר זה.

1. הכנת תרבות המדיה
<ol><li>להכין sabouraud דקסטרוז אגר (SDA). להשעות 65 גר' SDA בתוספת כלורמפניקול (50 מ"ג/ליטר) ב- 1,000 מ ל מים מזוקקים. מרתיחים להתמוסס המדיום לחלוטין. לחטא על ידי autoclaving ב 15 PSI (121 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות מגניב ל 45-50 מעלות צלזיוס. מערבבים היטב ויוצקים 20 מיליליטר SDA לתוך צלחות פטרי סטריליות (ג?...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing מוצלחת של biofilm אלביקנס ג הם: 1) לעשות את inoculum מראש ולא את inoculum בינוני YNB השלים עם גלוקוז 100 מ מ; 2) כדי לחכות 90 דקות השלב אדהזיה ולשטוף היטב פעמיים הבארות עם 0.89% NaCl כדי להסיר תאים שאינם דבקה; ו 3) כדי להוסיף RPMI בינוני התאים מודבקת להתחיל ביופילמים, מאז RPMI מגרה צ?...

שכיחות מוגברת של סוכרת, טיפול לדיכוי המערכת החיסונית יישומים, הידבקות ב- HIV, מגפת האיידס, הליכים פולשניים קליניים צריכת אנטיביוטיקה רחבת-טווח השנים האחרונות הגדילו את השכיחות של קנדידה אלביקנס הקשורים במחלות1,2. זיהומים אלביקנס ג בדרך כלל קשורים להתפתחות biofilm, עלול לגרום הביטויים הקליניים, כגון קנדידה או ביטויים מערכתית, כגון candidemia1,2. אחד הגורמים התקפה אלימה הבולטת ביותר של צמיחה biofilm הוא הממסד מטריצה חוץ-תאית רב-סוכר. ביופילמים משתף פעולה כדי להגדיל את ההתנגדות הקיימת תרופות נגד פטריות, עקה של מנגנונים חיסוניים מארח3.
צמיחת biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות מוקדם של תאים פלנקטוניים מצע, ואחריו התפשטות של תאי שמרים דרך משטח המצע, צמיחה hyphal. השלב האחרון של צמיחה biofilm הוא שלב ההבשלה, שבה, כמו שמרים פיתוח מדוכא מרחיבה את ההתפתחות hyphal, מטריצות יקיף את biofilm4. Exopolysaccharides אלביקנס ג (EPS) המטריצה אינטראקציה כדי ליצור את מנן-גלוקן מורכב5,6. האינטראקציה של exopolysaccharides חיוני להגנה על biofilms נגד סמים7. לפיכך, ההפחתה של EPS של מטריצות אלביקנס ג יכול לתמוך בפיתוח של פרוטוקולים antibiofilm חדשים לבקרת בפה.
אור מווסת צמיחה, התפתחות, התנהגות של אורגניזמים מספר8 , שהוחלה כמו מיקרוביאלית כימותרפיה פוטודינמי מיקרוביאלית (ברית). ההסכם חל על אש גלויה של גל מסוים ו פוטוסנסיטייזר אור קליטת9. אולם, photosensitizers יש קשיים בחדירה של biofilm, גורם היעילות נמוכה10. הכישלון של סוכני טיפולית לחדור biofilms מלא הוא סיבה biofilms להתנגד לעתים טיפול מיקרוביאלית מסורתי3,5. כדי לבטל את תאי חיידקים סגורה, antimicrobials צריך לחדור דרך מטריצה חוץ-תאית; יחד עם זאת, קובצי EPS מאפיינת מכשול diffusional עבור מולקולות כאלה על-ידי המבקשת רמתם של הכרכרה לתוך biofilm או המשפיעים על התגובה של מיקרוביאלית עם המטריצה עצמה11.
בהתחשב החסרונות של ההסכם, מתגלה השימוש באור בפני עצמו שיפור רב ערך. המידע הראשוני חשף כי הטיפול באור כחול פעמיים ביום באופן משמעותי עכבות הייצור של EPS-לא מסיס ב biofilm mutans סטרפטוקוקוס . על ידי הירידה של EPS-לא מסיס, אור כחול פחתה biofilm צמיחה. עם זאת, התוצאות של פוטותרפיה באמצעות אור אדום ב ג אלביקנס biofilms נדירים. לפיכך, מטרת החקירה היה שיש לחשב מה פוטותרפיה באופן באמצעות אור אדום השפעות את הצמיחה ואת סידור biofilm אלביקנס ג . על הטיפול פעמיים ביום, שינינו של המעבדה שלנו הקודם פרוטוקולים9,12 לספק מודל biofilm לשחזור וקלה המספק תשובות לגבי הכדאיות, פוליסכרידים משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום. ניתן להשתמש באותו הפרוטוקול לבדיקות טיפולים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאות של אש באור אדום טיפול על צמיחת קנדידה אלביקנס biofilm. כדי להגדיל את צמיחת פלנקטוניים אלביקנס ג SN425, inoculums גדל על בסיס חנקן שמרים מדיה. עבור ביופילמים, מדיה RPMI 1640, אשר יש ריכוזים גבוהים של חומצות אמינו, הוחלו לעזור biofilm צמיחה. Biofilms של 48 שעות טופלו פעמיים ביום למשך תקופה של 1 דקה עם מכשיר האור הלא קוהרנטי (אור אדום; אורך גל = 635 ננומטר; צפיפות אנרגיה = 87.6 J·cm-2). כמו פקד חיובי (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) היה מוחל, וכפי פקד שלילי (NC), 0.89% NaCl היה מוחל על biofilms. המושבה יוצרי יחידות (CFU), exopolysaccharides משקל יבש, מסיסים ובחלקם לא מסיסים היו לכמת לאחר טיפולים. בקצרה, פרוטוקול המובאת כאן היא פשוטה, לשחזור ומספק תשובות לגבי הכדאיות, רב-סוכר משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום.

איור 2 מציג התוצאות של יומן10 CFU/mL של אלביקנס ג לאחר טיפולים אש"ל עם אור אדום עבור אור אדום דק 1 הקטינה באופן משמעותי את יומן10 בהשוואה של NC CFU/mL (p = 0.004). תרשים 3 מציג את התוצאות של ביומסה (מ ג) של biofilms אלביקנס ג לאחר טיפולים. כל...

Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

פוטותרפיה יומי עם אור אדום כדי לווסת קנדידה אלביקנס Biofilm צמיחה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאה של יישום באור אדום הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilm. מכשיר האור הלא קוהרנטי אדום עם אורך הגל של 635 nm, צפיפות האנרגיה של 87.6 J·cm-2 הוחל ברחבי הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilms במשך 48 שעות.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

קנדידה היא הגורם השכיא ביותר לזיהום פטרייתי מופץ אצל מארחים immunocompromised. הכישלון של סוכנים טיפוליים לחדור באופן מלא biofilm בגלל המטריצה היא אחת הסיבות מדוע biofilms להתנגד טיפולים מסורתיים. הפרוטוקול שלנו מעריך כיצד פוטותרפיה, באמצעות אור אדום, מפריעה לצמיחה ולסידור של ביופילמים של קנדידה אלביקנים.השיטות המיושמות מבוססות היטב, שכן הזן המשמש במחקר זה היה מטריצה חוץ תאית שלה מאופיין מכשיר האור הוחל בהצלחה על מתלים מיקרואורגניזם פלנקטוני אחרים biofilms. היתרון הגדול ביותר של מכשיר זה הוא צמצום זמן הטיפול, מה שהופך אותו גלוי יותר עבור יישומים קליניים. כאשר culturing קנדידה אלביקנים להיות מודעים לכך נוגדנים ניתן לרכוש.לכן, חשוב לא להשתמש במושבות כי הם יותר משבעה ימים, לא להתחיל צלחות בארבע מעלות צלזיוס, ולא לפס מחדש תאים מן הלוחות הקיימים. כמו כן, יש להשתמש במתח לפני 18 שעות של צמיחה לילה. בעת שימוש בספקטרופוטומטר בפעם הראשונה חשוב להשיג תחילה חוות מושבה ביחידות ספירת, כדי לתאם לערכי צפיפות אופטית.לכן, ניסויים יתחילו להשתמש באמצע שלב הצמיחה בריכוז התא הראשוני של 10 עד 7 תאים למיליליטר. ריכוז תאים זה הוכח לספק את הביופילמים החומר התלויים והיציבים ביותר. כדי להתחיל, להשעות 65 גרם של SDA, בתוספת 50 מיליגרם לליטר של כלוראמפניקול, ב 1, 000 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק.מניחים את הסקילר על תנור לרתיחה, על מנת להמיס את המדיום לחלוטין. ואז להעביר את התקשורת לבקבוק זכוכית. מניחים את הכובע על הבקבוק, אבל לא לדפוק אותו לחלוטין כדי להבטיח את הבקבוק הוא מסוגל לפרוק.מניחים את הבקבוק במקלבה אוטומטית כדי לעקר את הפתרון ב 15 PSI ו 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מצננים את הפתרון סביב 45 מעלות צלזיוס. השתמש חד פעמי, פיפטה סטרילית, כדי לערבב היטב, ו pipette 20 מיליליטר של SDA לתוך צלחות פטרי סטרילי.כדי להכין בינוני YNB, בתוספת 100 גלוקוז מילימולר, לערבב 6.7 גרם של YNB ו 18 גרם של דקסטרוז ל 1, 000 מיליליטר של מים טהורים במיוחד בבקבוק. מניחים בר מערבבים בפקק ומכניסים את הסקילר לצלחת ערבוב כדי לערבב. סנן את המדיום באמצעות מערכת סינון ואקום של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר.הכן מדיום RPMI על ידי ערבוב 10.4 גרם של RPMI-1640 ו 34 גרם של MOPS, ל 1, 000 מיליליטר של מים טהורים במיוחד. מערבבים תוך ערבוב ללא חום ומתאימים את ה-PH לשבעה על ידי הוספת נתרן הידרוקסידי רגיל אחד. יש לעקר את המדיום באמצעות מערכת סינון ואקום של 0.22 מיקרומטר.ראשית, להפשיר את מיקרואורגניזם קנדידה אלביקנים SN 425 בטמפרטורת הסביבה. זרעים 10 microliters של תרבות להפסיק על מנות פטרי שהוכנו בעבר המכיל SDA, בתוספת כלוראמפניקול. חודרים את מנות פטרי באופן אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.עבור טרום inoculum להשתמש סיכה מעורקת כדי לבחור 10 מושבות של קנדידה אלביקנים מן הכלים פטרי למקם אותם לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 10 מיליליטר של מדיום YNB, בתוספת גלוקוז. דגירה הצינור באופן אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר מכן, להכין את inoculums על ידי הוספת תרבות זו המתנע לתוך מדיום YNB טרי, בתוספת גלוקוז, בפרופורציה אחת עד 10 לדילול.השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את OD הראשונית ב 540 ננומטר. דגירה inoculums אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות, ולמדוד את OD הסופי ב 540 ננומטר. הפחת את ה- OD הסופי מ- OD הראשוני כדי לבדוק אם ה- OD של האנוקולומים נמצא בשלב הצמיחה באמצע יומן הרישום.כדי להשיג inoculum עם 10 עד שבעה תאים למיליליטר, צנטריפוגה inoculum במשך חמש דקות ב 5, 500 פעמים G.Pour את העל טבעי לתוך מקור המכיל hypochlorite נתרן ולהוסיף YNB טרי לרכז את inoculum למחצית הנפח הקודם. מוסיפים מיליליטר אחד של inoculum לכל באר של צלחת פוליסטירן 24 היטב. דגירה אירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי לאפשר הידבקות התא לתחתית הבאר.לטפל בביופילמים במשך דקה אחת עם מיליליטר אחד של 0.12% כלורקסידין עבור ביופילמים שליטה חיובית. לשליטה שלילית, לטפל biofilms במשך דקה אחת עם מיליליטר אחד של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי. לאחר מכן, לשטוף את הבאר פעמיים, דקה אחת כל אחד, עם מיליליטר אחד של סטרילי 0.89% נתרן כלורי כדי להסיר תאים שאינם חסידים.לאחר מכן הפעל נורה אדומה לא עקבית ולהשתמש במד כוח כדי למדוד את צפיפות הכוח של האור. לקבוע את זמן החשיפה בהתבסס על דרישת צפיפות האנרגיה של 87.6 joules לס"מ מרובע. מניחים את הצלחת מתחת לאור האדום.שמור על המרחק בין מקור האור לביופילם לחמישה מיליליטר כדי להימנע מחימום הדגימה. לאחר החשיפה במשך דקה אחת, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום RPMI מעוקר לכל באר, ו דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. בבוקר, לחזור על אותו כביסה, טיפול קל, טיפולי בקרה חיוביים ושליליים, ודגירה במשך שש שעות עם מדיום RPMI.שוב, לשטוף את הביופילמים פעמיים, לחשוף אותם לאור אדום, ולבצע טיפולי בקרה חיוביים ושליליים. שאפו את הפתרון בארות והוסיפו מדיום RPMI. חזור על הדגירה, הכביסה, הטיפול הקל וטיפולי הבקרה החיוביים והשליליים, עד להשגת 48 שעות של התפתחות ביופילם.כדי להתחיל לעבד, השלך את המדיום והוסף מיליליטר אחד של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי ל באר, ולהשתמש בקצה פיפטה כדי לגרד את הביופילם מה באר. מעבירים את הביופילם שהוסר לצינור סטרילי. מוסיפים עוד מיליליטר של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי ל באר.לגרד אותו שוב ולהוסיף את ההשעיה לאותו צינור, עבור נפח כולל של 2 מיליליטר. מערבולת נמרצת ההשעיה ביופילם לדקה אחת. לניתוח CFU, להעביר aliquot של 0.1 מיליליטר מן ההשעיה biofilm לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 900 microliters של 0.89% פתרון נתרן כלורי עבור כל דילול.מדללים את תמיסת הביופילם מ-10 לתמיסה השלילית, ל-10 לארבע השליליות, בתמיסת מלח. זרעים 50 microliters של כל דילול צלחות SDA, ו דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. ספור את המושבות והחל את הנוסחה.לניתוח משקל יבש, ראשית לשקול ולתייג צינורות מיקרו צנטריפוגה. מוסיפים 0.1 מיליליטר של ההשעיה ביופילם ומיליליטר אחד של אתנול מוחלט לתוך הצינורות, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה זה 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות.השליכו את העל-טבעי והמקמים את הצינורות במייבש כדי לייבש את הדגימות למשך שבוע. לשקול את צינורות מיקרו צנטריפוגה שוב, ולעשות את ההפחתה כדי להשיג את משקל ביומסה. בניסוי זה, לאחר טיפולי פר-דיאם באור אדום למשך דקה לביופילמים של קנדידה אלביקנים, הופחת ה-CFU, בהשוואה לשליטה השלילית שטופלה בנתרן כלורי.התוצאות של ביומסה של ביופילמים קנדידה אלביקנים לאחר טיפולים יומיים, להראות את הקבוצה שטופלו באור אדום הציג הפחתה דומה של ביומסה לזה שנצפה בקבוצת הביקורת החיובית, מטופלים עם כלורהקסידין. שתי הקבוצות גם הראו דמיון סטטיסטי זו עם זו. בעוד ששניהם הראו הפחתה של הביומסה, בהשוואה לשליטה השלילית שטופלה בנתרן כלורי.כמויות נחותות של קנדידה אלביקנים מסיסים ובלתי מסיסים EPS, נצפתה בשליטה חיובית, לעומת שליטה שלילית. למרות שלא מובהק סטטיסטית, יישום פר diem של אור אדום פחתה מספרית כמויות של EPS מסיסים EPS מסיסים EPS מסיסים. הבקרה השלילית והקבוצה שטופלה באור אדום הראו דמיון סטטיסטי.מדידת צפיפות הכוח של האור, באמצעות מד כוח לפני תחילת הטיפול כדי לקבוע את תקופות היישום המדויקות. הצעדים מבטיחים כי צפיפות האנרגיה תמיד תהיה 87.6 joules אחוז סנטימטרים בריבוע. השתמש בנוסחה שצוטטה בעבר.המדידה נעשתה באמצעות אותו דבר מהאור לבקבוק הצלחות, חמישה מילימטרים. קשר בין פוטותרפיה ותרופות נגד פטריות ניתן ללמוד כדי לבדוק אם הטיפול הקדם עם אור אדום, ואחריו יישום סמים, משפר חדירת סמים לתוך biofilm. לטיפול פעמיים ביום התאמתי את פרוטוקולי המעבדה שלנו, המספקים מודל ביופילם קל ובלתי ניתן לשחזור, המספק תשובות לגבי כדאיות, משקל יבש כמויות פוליסכריד חוץ-תאי לאחר טיפול באור אדום.הפרוטוקול הוא כללי ונוה יכול לשמש לבדיקת טיפולים אחרים, בנוסף לאור אדום, כולל תרופות, אורות אחרים, או שילוב של אור ותרופות. עבודה עם מיקרואורגניזמים דורשת ציוד מיוחד, כגון משקפי בטיחות, חלוק מעבדה לכפתורים וכפפות ניטרו.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...