Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Vi takker Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal og Dr. Iriana Zanin for utvikling av denne studien. Vi erkjenner også Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) for å donere belastningen analysert i denne studien.

1. utarbeidelse av kultur medier
<ol><li>Forberede sabouraud druesukker agar (SDA). Suspendere 65 g SDA med chloramphenicol (50 mg/L) i 1000 mL destillert vann. Kok for å oppløse mediet helt. Sterilisere av autoklavering på 15 PSI (121° C) i 30 min. kult å 45-50 ° C. Bland godt og hell 20 mL SDA i sterilt Petri-platene (størrelse: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Forberede gjær nitrogen base (YNB) medium supplert med 100 mM glukose ved å blande 6,7 g YNB og 18 g druesukker til 1000 mL ultrapure vann. Bland med en røre...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

De viktigste trinnene for vellykket dyrking av C. albicans biofilm er: 1) å gjøre det før inoculum og inoculum i YNB medium supplert med 100 mM glukose; 2) til 90 min venter vedheft fasen og nøye vask dobbelt brønnene 0.89% NaCl fjerne ikke overholdt celler. og 3) til RPMI medium til adhered cellene å starte biofilm formasjon, siden RPMI vil stimulere hyfer vekst. Aneuploidies kan oppstå når dyrking C. albicans. Det er derfor viktig ikke å bruke kolonier som er mer enn syv dager gammel, ikke ?...

Den økte forekomsten av diabetes, suppressive musikkterapi anvendelser, HIV-smitte, AIDS-epidemien, invasiv kliniske prosedyrer og bredspektret antibiotika forbruk i de siste årene har økte forekomsten av Candida albicans relaterte sykdommer1,2. C. albicans infeksjoner er vanligvis knyttet til biofilm utvikling og kan forårsake kliniske manifestasjoner, som candidiasis eller systemisk manifestasjoner, for eksempel candidemia1,2. En av de mest bemerkelsesverdige virulens faktorene biofilm vekst er ekstracellulære polysakkarid matrix etablering. Biofilm formasjon samarbeider for å øke motstanden mot eksisterende antifungal medisiner, miljøbelastning og vert immun mekanismer3.
Biofilm veksten av C. albicans begynner med tidlig tilslutning planktoniske celleområde til et substrat etterfulgt av spredning av gjærceller gjennom substrat overflate og hyphal vekst. Den siste fasen av biofilm vekst er modning fase, der gjær-lignende utvikling er undertrykt hyphal utviklingen utvider og den ekstracellulære matrisen omslutter biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrisen samhandle for å danne mannan – Glukan komplekse5,6. Samspillet av exopolysaccharides er avgjørende for forsvaret av biofilm mot narkotika7. Derfor kan reduksjon av EPS C. albicans ekstracellulær matrix støtte utviklingen av nye antibiofilm protokoller for muntlig candidiasis kontroll.
Lys regulerer vekst, utvikling og atferd av flere organismer8 , og det har vært brukt som en antimikrobiell i Fotodynamisk antimikrobiell kjemoterapi (pakt). PAKTEN gjelder en synlig lys av en bestemt bølgelengde og en lys-absorberende photosensitizer9. Men har photosensitizers vanskeligheter i gjennomtrengende biofilm, forårsaker lavere effekt10. Svikt i terapeutisk agenter å fullt infiltrere biofilm er en grunn til at biofilm sporadisk motstå tradisjonell antimikrobielle terapi3,5. For å deaktivere vedlagte mikrobiell cellene, må poesi aksent gjennomsyre gjennom ekstracellulær matrix; likevel karakteriserer EPS et diffusional hinder for slike molekyler ved å spørre deres nivå av transport inn i biofilm eller påvirke responsen av antimikrobielle med matrix seg11.
Vurderer ulempene av PAKTEN, bruk av lys selv fremstår som en verdifull forbedring. Foreløpige data viste at behandling med blå lys to ganger om dagen betydelig hemmet produksjonen av EPS-uløselig i Streptococcus mutans biofilm. Ved reduksjon av EPS-uløselig, blått lys redusert biofilm vekst. Likevel er utfallet av lysbehandling bruker rødt lys i C. albicans biofilm knappe. Dermed var målet med undersøkelsen å evaluere i hvilken måte fototerapi bruker rødt lys påvirker vekst og ordning av C. albicans biofilm. For to ganger daglig behandling, vi tilpasset vårt laboratorium tidligere protokoller9,12 for å gi en lett og reproduserbar biofilm modell som leverer svar om levedyktighet, tørr vekt og ekstracellulære polysakkarider beløpene etter rødt lys behandling. Samme protokoll kan brukes for å teste andre terapier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere utfallet av kostgodtgjørelse rødt lys behandling på veksten av Candida albicans biofilm. For å øke planktoniske veksten av C. albicans SN425, vokste inoculums på gjær Nitrogen Base media. For biofilm formasjon, ble RPMI 1640 media, som har høye konsentrasjoner av aminosyrer, brukt til å hjelpe biofilm vekst. Biofilm 48 h ble behandlet to ganger om dagen for en periode på 1 min med en ikke-sammenhengende lys enhet (rødt lys, bølgelengde = 635 nm; energi tetthet = 87.6 J·cm-2). Som en positiv kontroll (PC), 0,12% chlorhexidine (CHX) ble brukt, og som en negativ kontroll (NC), 0.89% NaCl ble brukt av biofilm. Kolonien danner enheter (CFU), tørr vekt, løselig og uløselig exopolysaccharides kvantifisert etter behandlinger. Kort, protokollen presenteres her er enkel, reproduserbare og gir svar om levedyktighet, tørr vekt og ekstracellulære polysakkarid beløp etter rødt lys behandling.

Figur 2 viser resultatene av Logg10 CFU/mL av C. albicans etter kostgodtgjørelse behandlinger med rødt lys for 1 min. rødt betydelig redusert Logg10 CFU/mL sammenlignet med NC (p = 0.004). Figur 3 viser resultatene av biomasse (mg) av C. albicans biofilm etter daglig behandlinger. Alle behandlet grupper viste reduksjon av biomasse sammenlignet med NC (p = 0.000) og det røde lyset behand...

Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daglig fototerapi med rødt lys Regulate Candida albicans Biofilm vekst

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere utfallet av rødt lys program på vekst av Candida albicans biofilm. En ikke-sammenhengende rødt lys enhet med bølgelengden til 635 nm og energi tetthet av 87.6 J·cm-2 ble brukt gjennom vekst av Candida albicans biofilm for 48 timer.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida er den vanligste årsaken til spredt soppinfeksjon hos immunkompromitterte verter. Svikt av terapeutiske midler for å fullt infiltrere biofilm på grunn av matrisen er en grunn til at biofilmer motstår tradisjonelle terapier. Vår protokoll evaluerer hvordan lysterapi, ved hjelp av rødt lys, forstyrrer veksten og arrangementet av Candida albicans biofilmer.Metodene som brukes er godt etablert, siden belastningen som brukes i denne studien hadde sin ekstracellulære matrise karakterisert og lysenheten har blitt brukt på andre planktoniske mikroorganismesuspensjoner og biofilmer. Den største fordelen med denne enheten er reduksjonen i behandlingstiden, noe som gjør den mer synlig for kliniske applikasjoner. Når du culturing Candida albicans være klar over at antistoffer kan anskaffes.Derfor er det viktig å ikke bruke kolonier som er mer enn syv dager gamle, for ikke å starte plater på fire grader Celsius, og ikke å re-strek celler fra eksisterende plater. På samme måte bør en belastning brukes før 18 timer med overnattingsvekst. Når du bruker et spektrofotometer for første gang er det viktig å først få kolonigård i enheter teller, for å korrelere med optiske tetthetsverdier.Derfor vil eksperimenter begynne å bruke midten av vekstfasen i innledende cellekonsentrasjon på 10 til syv celler per milliliter. Denne cellekonsentrasjonen har vist seg å gi de mest avhengige og stabile materiebiofilmene. Til å begynne, suspendere 65 gram SDA, supplert med 50 milligram per liter kloramfenikol, i 1000 milliliter destillert vann i et beger.Plasser begeret på en varmeapparat for å koke, for å oppløse mediet helt. Deretter overfører du media til en glassflaske. Sett hetten på flasken, men ikke skru den helt ned for å sikre at flasken er i stand til å lufte.Legg flasken i en autoklav for å sterilisere løsningen ved 15 PSI og 121 grader Celsius i 30 minutter. Avkjøl løsningen til rundt 45 grader Celsius. Bruk en engangs, steril pipette, til å blande godt, og pipette 20 milliliter SDA i sterile Petri plater.For å forberede YNB medium, supplert med 100 millimolar glukose, bland 6,7 gram YNB og 18 gram dekstrose til 1000 milliliter ultra rent vann i et beger. Plasser en rørestang i begeret og sett begeret på en røreplate for å blande. Filtrer mediet gjennom et vakuumfiltersystem på 0,22 mikrometer for å sterilisere.Forbered RPMI medium ved å blande 10,4 gram RPMI-1640 og 34 gram MOPS, til 1000 milliliter ultra rent vann. Bland i en rører uten varme og juster PH til syv ved å legge til en normal natriumhydroksid. Steriliser mediet ved hjelp av et 0,22 mikrometervakuumfiltersystem.Først tine mikroorganismen Candida albicans SN 425 ved omgivelsestemperatur. Seed 10 mikroliter av stoppkulturen på tidligere tilberedte Petri-retter som inneholder SDA, supplert med kloramfenikol. Inkuber Petri-rettene aerobt ved 37 grader Celsius i 48 timer.For pre-inoculum bruk en sterilisert glidemiddel for å plukke 10 kolonier av Candida albicans fra Petri retter og plassere dem i en sentrifuge rør som inneholder 10 milliliter ynb medium, supplert med glukose. Inkuber røret aerobt ved 37 grader Celsius i 16 timer. Deretter forbereder inokusene ved å legge til denne startkulturen i frisk YNB medium, supplert med glukose, i en til 10-andel for fortynning.Bruk spektrofotometeret til å måle den første OD ved 540 nanometer. Inkuber inoculums aerobically ved 37 grader Celsius i åtte timer, og måle den endelige OD på 540 nanometer. Trekk den endelige OD fra den første OD for å sjekke om OD av inoculums er på midtloggvekstfasen.For å få et inokulum med 10 til de syv cellene per milliliter, sentrifuger inokulumet i fem minutter ved 5, 500 ganger G.Hell supernatanten i et beger som inneholder natriumhypokloritt og tilsett fersk YNB for å konsentrere inokulumet til halvparten av det forrige volumet. Tilsett en milliliter inokulum til hver brønn av en 24 brønn polystyrenplate. Inkuber aerobt ved 37 grader Celsius i 90 minutter for å tillate celle vedheft til bunnen av brønnene.Behandle biofilmene i ett minutt med en milliliter 0,12% klorhexidin for den positive kontrollbiofilmene. For negativ kontroll, behandle biofilmene i ett minutt med en milliliter steril, 0,89% natriumklorid. Deretter vasker du brønnene to ganger, ett minutt hver, med en milliliter steril 0,89% natriumklorid for å fjerne ikke-tilhengerceller.Slå deretter på et ikke-sammenhengende rødt lys og bruk en strømmåler for å måle lysets effekttetthet. Bestem eksponeringstiden basert på energitetthetskravet på 87,6 joule per kvadratcentimeter. Plasser platen under det røde lyset.Hold avstanden mellom lyskilden og biofilmen til fem milliliter for å unngå oppvarming av prøven. Etter eksponering i ett minutt, tilsett en milliliter av det steriliserte RPMI-mediet til hver brønn, og inkuber platene ved 37 grader Celsius over natten. Om morgenen gjentar du samme vask, lysbehandling, positive og negative kontrollbehandlinger og inkubasjon i seks timer med RPMI-medium.Igjen, vask biofilmene to ganger, utsett dem for rødt lys, og utfør positive og negative kontrollbehandlinger. Aspirer oppløsningen i brønnene og tilsett RPMI-medium. Gjenta inkubasjon, vasking, lysbehandling og positive og negative kontrollbehandlinger, til du oppnår 48 timer med biofilmutvikling.For å starte behandlingen, kast mediet og tilsett en milliliter steril, 0,89% natriumklorid til brønnen, og bruk en pipettespiss for å skrape biofilmen fra brønnen. Overfør den fjernede biofilmen til et sterilt rør. Tilsett en annen en milliliter steril, 0,89% natriumklorid til brønnen.Klø den igjen og legg suspensjonen til samme rør, for et totalt volum på 2 milliliter. Virvle biofilmfjæringen kraftig i ett minutt. For CFU-analyse, overfør en aliquot på 0,1 milliliter fra biofilm suspensjon til en mikro sentrifuge rør som inneholder 900 mikroliter av 0,89% natriumklorid løsning for hver fortynning.Fortynn biofilmløsningen fra 10 til den negative, til 10 til de negative fire, i saltoppløsning. Frø 50 mikroliter av hver fortynning til SDA plater, og inkuber platene ved 37 grader Celsius i 48 timer. Telle koloniene og bruke formelen.For tørrvektsanalyse må du først veie og merke mikrosentrigerør. Tilsett 0,1 milliliter av biofilmsuspensjonen og en milliliter absolutt etanol i rørene, og oppbevar dem ved negative 20 grader Celsius i 18 timer. Deretter sentrifuge det 10, 000 ganger G i 10 minutter.Kast supernatanten og legg rørene i en desiccator for å tørke prøvene i en uke. Vei mikro sentrifuge rør igjen, og gjør subtraksjon for å oppnå biomasse vekt. I dette eksperimentet, etter per diem behandlinger med rødt lys i ett minutt til Candida albicans biofilms, ble CFU redusert, sammenlignet med den negative kontrollen behandlet med natriumklorid.Resultatene av biomassen av Candida albicans biofilmer etter daglige behandlinger, viser at den røde lysbehandlede gruppen presenterte lignende reduksjon av biomasse som observert i den positive kontrollgruppen, behandlet med klorhexidin. De to gruppene viste også statistisk likhet med hverandre. Mens de begge viste reduksjon av biomassen, sammenlignet med den negative kontrollen behandlet med natriumklorid.Mindreverdige mengder Candida albicans løselig og uoppløselig EPS, ble observert i positiv kontroll, sammenlignet med negativ kontroll. Selv om det ikke var statistisk signifikant, reduserte per diem-bruk av rødt lys numerisk mengden EPS oppløselig og EPS uoppløselig. Den negative kontrollen og den røde lysbehandlede gruppen, viste statistisk likhet.Måling av lysets effekttetthet, ved hjelp av en strømmåler før du starter behandlingen for å bestemme de nøyaktige bruksperiodene. Trinnene sikrer at energitettheten alltid vil være 87,6 joule per centimeter kvadrert. Bruk formelen som tidligere er sitert.Målingen gjøres ved hjelp av det samme fra lyset til flasken på platene, fem millimeter. En sammenheng mellom lysterapi og antifungale legemidler kan studeres for å sjekke om forbehandlingen med rødt lys, etterfulgt av legemiddelapplikasjon, forbedrer legemiddelpenetrasjonen i biofilmen. For den to ganger daglige behandlingen tilpasset vi laboratoriets protokoller, og ga en enkel og reproduserbar biofilmmodell, som gir svar om levedyktighet, tørrvekt og ekstracellulære polysakkaridmengder etter behandling med rødt lys.Protokollen er generisk og kan brukes til å teste andre behandlinger, i tillegg til rødt lys, inkludert narkotika, andre lys, eller kombinasjonen av lys og narkotika. Arbeid med mikroorganismer krever spesialutstyr, for eksempel vernebriller, knappelabfrakk og nitrohansker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studere mikrobielle samfunn<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Dyp Dermal injeksjon som en modell av Candida albicans hudinfeksjon for histologiske analyser

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murine mage-tarmkanalen ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Avklare og imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-mediert fotodynamisk terapi for å hemme Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Bruk av in vivo imaging for å skjerme for morfogenese fenotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infeksjon i en pattedyrvert

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...