Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
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Agradecemos o Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal e Dr. Iriana Zanin para o desenvolvimento deste estudo. Reconhecemos também o Dr. Alexander m. Johnson (UCSF) para doar a estirpe analisada neste estudo.

1. preparação de meios de cultura
<ol><li>Prepare ágar de sabouraud dextrose (ASD). Suspenda 65g de SDA suplementado com cloranfenicol (50 mg/L) em 1.000 mL de água destilada. Ferva até para dissolver o meio completamente. Esterilizar em autoclave a 15 PSI (121° C) por 30 min. esfriar a 45-50 ° C. Misture bem e despeje a 20 mL de SDA em placas de Petri estéril (tamanho: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Prepare o fermento nitrogênio base (YNB) suplementado com glicose de 100 mM, misturando 6,7 g de YNB e 18 g de dextros...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

Os passos mais críticos para um cultivo bem sucedido de biofilmes de c. albicans são: 1) para fazer o pre- inóculo de e o inóculo em meio YNB complementado com glicose de 100 mM; 2) para esperar 90 min para a fase de adesão e cuidadosamente lavar duas vezes os poços com 0,89% NaCl para remover as células não-aderido; e 3) para adicionar meio RPMI às células aderidas para iniciar a formação de biofilmes, desde RPMI estimulará o crescimento de hifas. Aneuploidies pode ocorrer quando o cultivo de ...

O aumento da incidência de diabetes, aplicações de terapia imunossupressora, infecção pelo HIV, a epidemia de AIDS, procedimentos clínicos invasivos e consumo antibiótico de largo espectro nos últimos anos tem aumentado a incidência de Candida albicans relacionados com doenças1,2. Infecções de c. albicans são comumente relacionadas ao desenvolvimento de biofilme e podem causar manifestações clínicas, tais como candidíase, ou manifestações sistêmicas, tais como candidemia1,2. Dentre os fatores de virulência, mais notáveis do crescimento do biofilme é o estabelecimento de matriz de polissacarídeo extracelular. Formação de biofilmes coopera para aumentar a resistência a drogas antifúngicas existentes, estresse ambiental e de mecanismos imunes do hospedeiro3.
O crescimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão inicial de células planctônicas a um substrato, seguido pela propagação de células de levedura através da superfície do substrato e o crescimento das hifas. A última fase do crescimento do biofilme é a fase de maturação, no qual desenvolvimento de leveduras, como é suprimido, o desenvolvimento das hifas expande e a matriz extracelular inclui o biofilme4. C. albicans exopolissacarídeo (EPS) na matriz interage para formar o complexo5,de Medeiros-glucan6. A interação de exopolissacarídeo é fundamental para a defesa dos biofilmes contra drogas7. Daí, a redução dos EPS da matriz extracelular de c. albicans pode apoiar o desenvolvimento de novos protocolos de antibiofilm para controle da candidíase oral.
Luz regula o crescimento, desenvolvimento e comportamento de vários organismos8 e foi aplicado como um antimicrobiano da quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (Pacto). Pacto aplica-se uma luz visível de um comprimento de onda específico e uma absorção de luz fotossensibilizador9. No entanto, os fotossensibilizadores têm dificuldades em penetrar o biofilme, causando menor eficácia10. O fracasso de agentes terapêuticos para infiltrar totalmente biofilmes é uma razão que biofilmes ocasionalmente resistem tradicional terapia antimicrobiana3,5. Para desactivar as células microbianas fechadas, antimicrobianos precisam permear através da matriz extracelular; Não obstante, o EPS caracteriza um obstáculo de difusão para tais moléculas alertando o seu nível de transporte para o biofilme ou influenciando a resposta do antimicrobiano com a própria matrix11.
Tendo em conta as desvantagens do Pacto, o uso da luz por si só emerge como uma melhoria valiosa. Dados preliminares revelaram que o tratamento com luz azul duas vezes por dia inibiu significativamente a produção de EPS-insolúvel em biofilmes de Streptococcus mutans . Pela diminuição de EPS-insolúvel, luz azul diminuiu o crescimento do biofilme. No entanto, os resultados da fototerapia usando luz vermelha em biofilmes de c. albicans são escassos. Portanto, o objetivo desta investigação foi avaliar em que fototerapia de maneira usando luz vermelha influencia o crescimento e o arranjo de biofilmes de c. albicans . Para o tratamento duas vezes por dia, adaptamos anterior protocolos9,12 para fornecer um modelo de biofilme fácil e reprodutíveis que fornece respostas sobre viabilidade, do nosso laboratório peso seco e extracelulares polissacarídeos quantidades após o tratamento de luz vermelha. O mesmo protocolo pode ser usado para testar outras terapias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os resultados das diárias de luz vermelha tratamento sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Para aumentar o crescimento planctônico de SN425 de c. albicans , o inoculo cresceu na mídia de levedura Base de nitrogênio. Para a formação de biofilme, mídia RPMI 1640, que têm altas concentrações de aminoácidos, foram aplicadas para ajudar o crescimento do biofilme. Biofilmes de 48 h foram tratadas duas vezes por dia por um período de 1 min com um dispositivo de luz não-coerente (luz vermelha; comprimento de onda = 635 nm; densidade de energia = 87,6 J·cm-2). Como um controle positivo (PC), clorexidina 0,12% (CHX) foi aplicado e como um controle negativo (NC), 0,89% NaCl foi aplicado para os biofilmes. Formadoras de colónias (UFC), unidades de peso seco, solúveis e insolúveis exopolissacarídeo foram quantificados depois dos tratamentos. Resumidamente, o protocolo aqui apresentado é simples, Reproduzível e fornece respostas sobre viabilidade, montantes de polissacarídeo extracelular e de peso seco após o tratamento de luz vermelha.

Figura 2 exibe os resultados de Log10 UFC/mL de c. albicans após tratamentos diários com luz vermelha para luz vermelha de 1 min. reduziu significativamente o Log10 UFC/mL em comparação com o NC (p = 0,004). A Figura 3 apresenta os resultados da biomassa (mg) de biofilmes de c. albicans após tratamentos diários. Todos tratados grupos apresentaram redução da biomassa em comparação ...

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Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o resultado da aplicação de luz vermelha sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Um dispositivo não-coerente de luz vermelha com comprimento de onda de 635 nm e densidade de energia de 87,6 J·cm-2 foi aplicado durante todo o crescimento de biofilmes de Candida albicans por 48 h.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

A candida é a causa mais comum de infecção fúngica disseminada em hospedeiros imunocomprometidos. A falha dos agentes terapêuticos em se infiltrar plenamente no biofilme por causa da matriz é uma das razões pelas quais os biofilmes resistem às terapias tradicionais. Nosso protocolo avalia como a fototerapia, usando luz vermelha, interfere no crescimento e arranjo de biofilmes candida albicans.Os métodos aplicados estão bem estabelecidos, uma vez que a cepa utilizada neste estudo teve sua matriz extracelular caracterizada e o dispositivo leve foi aplicado com sucesso a outras suspensões e biofilmes de microrganismos plantônicos. A maior vantagem deste dispositivo é a redução do tempo de tratamento, o que o torna mais visível para aplicações clínicas. Ao culminar candida albicans esteja ciente de que anticorpos podem ser adquiridos.Por isso, é importante não usar colônias com mais de sete dias de idade, não iniciar placas a quatro graus Celsius, e não re-listrar células de placas existentes. Da mesma forma, uma cepa deve ser usada antes de 18 horas de crescimento noturno. Ao usar um espectrômetro pela primeira vez é importante primeiro obter a fazenda colônia em contagem de unidades, para se correlacionar com valores de densidade óptica.Portanto, os experimentos começarão a usar a fase de crescimento em fase inicial de concentração celular de 10 a sete células por mililitros. Esta concentração celular tem sido demonstrada para fornecer os biofilmes de matéria mais dependente e estável. Para começar, suspenda 65 gramas de SDA, suplementado com 50 miligramas por litro de Clororamfenicol, em 1.000 mililitros de água destilada em um béquer.Coloque o béquer em uma campainha para ferver, a fim de dissolver completamente o meio. Então transfira a mídia para uma garrafa de vidro. Coloque a tampa sobre a garrafa, mas não astrague completamente para garantir que a garrafa seja capaz de ventilar.Coloque a garrafa em uma autoclave para esterilizar a solução a 15 PSI e 121 graus Celsius por 30 minutos. Esfrie a solução para cerca de 45 graus Celsius. Use uma pipeta descartável e estéril, para misturar bem, e pipeta 20 mililitros de SDA em placas estéreis de Petri.Para preparar o meio YNB, suplementado com 100 milimonas de glicose, misture 6,7 gramas de YNB e 18 gramas de dextrose a 1.000 mililitros de água ultra pura em um béquer. Coloque uma barra de mexida no béquer e coloque o béquer em uma placa de mexida para misturar. Filtre o meio através de um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro para esterilizar.Prepare o meio RPMI misturando 10,4 gramas de RPMI-1640 e 34 gramas de MOPS, a 1.000 mililitros de água ultra pura. Misture em um agitador sem calor e ajuste o PH para sete adicionando um hidróxido de sódio normal. Esterilize o meio usando um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro.Primeiro, descongele o microrganismo Candida albicans SN 425 à temperatura ambiente. Semente 10 microliters da cultura stop em pratos petri previamente preparados contendo SDA, complementados com Clororamfenicol. Incubar as placas de Petri aerobicamente a 37 graus Celsius por 48 horas.Para o pré-inóculo use um lubrificante esterilizado para colher 10 colônias de albicanos candida dos pratos petri e colocá-los em um tubo de centrífuga contendo 10 mililitros de meio YNB, complementados com glicose. Incubar o tubo aerobicamente a 37 graus Celsius durante 16 horas. Em seguida, prepare o inóculo adicionando esta cultura inicial em meio YNB fresco, suplementado com glicose, em uma proporção de um a 10 para diluição.Use o espectótmetro para medir o OD inicial em 540 nanômetros. Incubar os inóculos aerobicamente a 37 graus Celsius por oito horas, e medir o OD final em 540 nanômetros. Subtraia o OD final do OD inicial para verificar se o OD dos inóculos está na fase de crescimento do registro médio.Para obter um inóculo com 10 a sete células por mililitro, centrífugo o inóculo por cinco minutos a 5.500 vezes G.Despeje o sobrenatante em um béquer contendo hipoclorito de sódio e adicione ynb fresco para concentrar o inóculo à metade do volume anterior. Adicione um mililitro do inóculo a cada poço de uma placa de poliestireno de 24 poços. Incubar aeróbicamente a 37 graus Celsius por 90 minutos para permitir a adesão celular ao fundo dos poços.Trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de 0,12% de clorexidina para os biofilmes de controle positivo. Para o controle negativo, trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de cloreto de sódio estéril e 0,89%. Posteriormente, lave os poços duas vezes, um minuto cada, com um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% para remover células não aderentes.Em seguida, ligue uma luz vermelha não coerente e use um medidor de energia para medir a densidade de energia da luz. Determine o tempo de exposição com base na exigência de densidade energética de 87,6 joules por centímetro quadrado. Coloque a placa sob a luz vermelha.Mantenha a distância entre a fonte de luz e o biofilme para cinco mililitros para evitar o aquecimento da amostra. Após a exposição por um minuto, adicione um mililitro do meio RPMI esterilizado a cada poço, e incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã, repita a mesma lavagem, tratamento leve, tratamentos de controle positivo e negativo e incubação por seis horas com meio RPMI.Novamente, lave os biofilmes duas vezes, exponha-os à luz vermelha e realize tratamentos de controle positivos e negativos. Aspire a solução nos poços e adicione meio RPMI. Repita a incubação, lavagem, tratamento leve e tratamentos de controle positivos e negativos, até alcançar 48 horas de desenvolvimento de biofilme.Para iniciar o processamento, descarte o meio e adicione um mililitro de cloreto de sódio estéril, 0,89% ao poço, e use uma ponta de pipeta para riscar o biofilme do poço. Transfira o biofilme removido para um tubo estéril. Adicione mais um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% ao poço.Arranhe-o novamente e adicione a suspensão ao mesmo tubo, para um volume total de 2 mililitros. Vigorosamente vórtice a suspensão do biofilme por um minuto. Para análise da UFC, transfira uma alíquota de 0,1 mililitros da suspensão do biofilme para um tubo de micro centrífugas contendo 900 microliters de solução de cloreto de sódio de 0,89% para cada diluição.Diluir a solução de biofilme de 10 para a negativa, para 10 para as quatro negativas, em solução salina. Semente 50 microliters de cada diluição em placas SDA, e incubar as placas a 37 graus Celsius por 48 horas. Conte as colônias e aplique a fórmula.Para análise de peso seco, primeiro pesar e rotular tubos micro centrífugas. Adicione 0,1 mililitros da suspensão do biofilme e um mililitro de etanol absoluto nos tubos, e armazene-os a 20 graus Celsius negativos por 18 horas. Então, centrifuá-lo 10.000 vezes G por 10 minutos.Descarte o supernatante e coloque os tubos em um desiccador para secar as amostras por uma semana. Pesar os tubos de micro centrífugas novamente, e fazer a subtração para obter o peso da biomassa. Neste experimento, após tratamentos por diem com luz vermelha por um minuto para os biofilmes candida albicans, a UFC foi reduzida, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.Os desfechos da biomassa dos biofilmes candida albicanos após os tratamentos diários, mostram que o grupo tratado de luz vermelha apresentou redução similar da biomassa à observada no grupo controle positivo, tratado com clorexidina. Os dois grupos também apresentaram semelhança estatística entre si. Embora ambos tenham apresentado redução da biomassa, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.Quantidades inferiores de Cândidas albicans solúveis e insolúveis EPS, observou-se em controle positivo, em comparação com o controle negativo. Embora não estatisticamente significante, a aplicação por diem de luz vermelha diminuiu numericamente as quantidades de EPS solúvel e EPS insolúvel. O controle negativo e o grupo tratado da luz vermelha apresentaram semelhança estatística.Medindo a densidade de energia da luz, usando um medidor de energia antes de iniciar o tratamento para determinar os períodos exatos de aplicação. As etapas garantem que a densidade de energia será sempre de 87,6 joules por centímetros quadrados. Use a fórmula citada anteriormente.A medição é feita utilizando o mesmo da luz para a garrafa das placas, cinco milímetros. Uma associação entre fototerapia e drogas antifúngicas pode ser estudada para verificar se o pré-tratamento com luz vermelha, seguido pela aplicação de drogas, melhora a penetração de drogas no biofilme. Para o tratamento duas vezes ao dia, adaptamos os protocolos do nosso laboratório, fornecendo um modelo de biofilme fácil e reprodutível, que fornece respostas sobre viabilidade, peso seco e quantidades de polissacarídeo extracelular após o tratamento da luz vermelha.O protocolo é genérico e pode ser usado para testar outras terapias, além da luz vermelha, incluindo drogas, outras luzes, ou a combinação de luz e drogas. Trabalhar com microrganismos requer equipamentos especiais, como óculos de segurança, jaleco de botão e luvas de nitro.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Imunologia e Infecção

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...