Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
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Agradecemos a Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecilia Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal y Dr. Iriana Zanin para el desarrollo de este estudio. También reconocemos el Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) por donar la cepa analizada en este estudio.

1. preparación de medios de cultivo
<ol><li>Preparar el agar dextrosa de sabouraud (SDA). Suspender 65 g del SDA suplementado con cloranfenicol (50 mg/L) en 1.000 mL de agua destilada. Ebullición para disolver el medio completamente. Esterilizar en autoclave a 15 PSI (121° C) durante 30 minutos, enfriar a 45-50 ° C. Mezclar bien y verter 20 mL de SDA en placas de Petri estériles (tamaño: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Preparar la levadura nitrógeno base (YNB) suplementado con glucosa 100 mM mezclando 6,7 g de YNB y 18 ...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

Los pasos más críticos para el cultivo exitoso de biopelículas de C. albicans son: 1) hacer el inóculo previo y el inóculo en medio YNB con 100 mM de glucosa; 2) y esperar 90 minutos para la fase de adhesión cuidadosamente lavar dos veces los pozos con 0,89% NaCl para eliminar las células no adheridas; y 3) para agregar Medio RPMI a las células adheridas para iniciar formación de biopelículas, ya que RPMI será estimular el crecimiento de hifas. Aneuploidías pueden ocurrir cuando el cultivo de C....

El aumento de la incidencia de diabetes, usos de la terapia inmunosupresora, infección por el VIH, epidemia, procedimientos clínicos invasivos y consumo de antibióticos del amplio-espectro en los últimos años han aumentado la incidencia de Candida albicans relacionados con enfermedades1,2. Infecciones por C. albicans son comúnmente relacionados con el desarrollo de biofilm y pueden causar manifestaciones clínicas, tales como candidiasis o manifestaciones sistémicas, como la candidemia1,2. Uno de los factores de virulencia más notables del crecimiento del biofilm es el establecimiento de la matriz de polisacárido extracelular. Formación de biopelículas colabora para aumentar la resistencia a los medicamentos antimicóticos existentes, estrés ambiental y de mecanismos inmunes del huésped3.
El crecimiento de biopelículas de C. albicans se inicia con la adhesión temprana de células planctónicas a un substrato, seguida de la propagación de las células de levadura a través de la superficie del sustrato y el crecimiento hifal. La última fase de crecimiento del biofilm es la fase de maduración, en donde se suprime el desarrollo de la levadura como se expande el desarrollo hifal y la matriz extracelular incluye el biofilm4. C. albicans exopolisacáridos (EPS) en la matriz de interactúan para formar el complejo5,manan-glucan del6. La interacción de exopolisacáridos es crítica para la defensa de los biofilms contra drogas7. Por lo tanto, la reducción de la EPS de la matriz extracelular de C. albicans puede apoyar el desarrollo de nuevos protocolos de antibiofilm para el control de la candidiasis oral.
La luz regula el crecimiento, desarrollo y comportamiento de varios organismos8 y se ha aplicado como un antimicrobiano en quimioterapia fotodinámica antimicrobiana (Pacto). Pacto aplica una luz visible de una determinada longitud de onda y absorbe la luz fotosensibilizador9. Sin embargo, el photosensitizers tienen dificultades para penetrar en el biofilm, causando menor eficacia10. La falta de agentes terapéuticos totalmente infiltrarse en biofilms es una razón que biofilms resisten ocasionalmente tradicional terapia antimicrobiana3,5. Para desactivar las células microbianas cerradas, antimicrobianos deben permear a través de la matriz extracelular; sin embargo, la EPS caracteriza un obstáculo difusional para tales moléculas por lo que su nivel de transporte en el biofilm o por influir en la respuesta de los antimicrobianos con la matriz sí mismo11.
Teniendo en cuenta las desventajas del Pacto, el uso de la luz por sí misma surge como una valiosa mejora. Datos preliminares revelaron que el tratamiento con luz azul dos veces al día inhibieron significativamente la producción de EPS-insoluble en biopelículas del Streptococcus mutans . Por la disminución de EPS-insoluble, luz azul disminuye crecimiento de biopelícula. Sin embargo, los resultados de la fototerapia con luz roja en biopelículas de C. albicans son escasos. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar en qué fototerapia manera usando luz roja influye en el crecimiento y disposición de biopelículas de C. albicans . Para el tratamiento dos veces al día, hemos adaptado anteriores protocolos9,12 para proporcionar un modelo de biofilm fácil y reproducible que ofrece respuestas en cuanto a viabilidad, de nuestro laboratorio polisacáridos extracelulares y peso seco cantidades después del tratamiento de la luz roja. El mismo protocolo puede utilizarse para probar otros tratamientos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los resultados de viáticos luz roja tratamiento sobre el crecimiento de biofilm de Candida albicans . Para aumentar el crecimiento planctónico de C. albicans SN425, el inóculo creció en medio de la Base de nitrógeno de la levadura. Para la formación de biofilm, se aplicaron medios RPMI 1640, que tienen altas concentraciones de aminoácidos, para ayudar a crecimiento de biopelícula. Biopelículas de 48 h fueron tratados dos veces al día durante un período de 1 minuto con un dispositivo de luz no coherente (luz roja, longitud de onda = 635 nm; densidad de energía = 87,6 J·cm-2). Como control positivo (PC), 0,12% de clorhexidina (CHX) fue aplicado y como control negativo (NC), 0,89% NaCl se aplicó a los biofilms. Colonias formando unidades (UFC), peso seco, solubles e insolubles exopolisacáridos se cuantificaron después de tratamientos. Brevemente, el protocolo que presentamos es simple, reproducible y proporciona respuestas con respecto a la viabilidad, cantidades de polisacárido extracelular y seco-peso después del tratamiento de la luz roja.

La figura 2 muestra los resultados de Log10 UFC/mL de C. albicans después de dietas tratamientos con luz roja para 1min rojo redujo significativamente el Log10 UFC/mL en comparación con la NC (p = 0.004). Figura 3 presenta los resultados de la biomasa (mg) de biopelículas de C. albicans después de tratamientos diarios. Todos los grupos mostraron una reducción de la biomasa en comparaci...

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Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Diario fototerapia con luz roja para regular crecimiento de Biofilm de Candida albicans

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el resultado de la aplicación de luz roja en el crecimiento de biofilm de Candida albicans . Un dispositivo de luz roja no coherente con la longitud de onda de 635 nm y densidad de energía de 87,6 J·cm-2 se aplicó durante todo el crecimiento de Candida albicans biofilms durante 48 h.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

La cándida es la causa más frecuente de infección por hongos diseminada en huéspedes inmunocomprometidos. El fracaso de los agentes terapéuticos para infiltrarse completamente en la biopelícula debido a la matriz es una de las razones por las que las biopelículas resisten a las terapias tradicionales. Nuestro protocolo evalúa cómo la fototerapia, utilizando luz roja, interfiere con el crecimiento y la disposición de las biopelículas Candida albicans.Los métodos aplicados están bien establecidos, ya que la cepa utilizada en este estudio tenía su matriz extracelular caracterizada y el dispositivo de luz se ha aplicado con éxito a otras suspensiones de microorganismos planctónicos y biopelículas. La mayor ventaja de este dispositivo es la reducción del tiempo de tratamiento, lo que lo hace más visible para aplicaciones clínicas. Al cultivar Candida albicans tenga en cuenta que se pueden adquirir anticuerpos.Por lo tanto, es importante no utilizar colonias que tienen más de siete días de edad, no iniciar placas a cuatro grados celsius, y no volver a rayar las células de las placas existentes. Del mismo modo, se debe utilizar una cepa antes de 18 horas de crecimiento durante la noche. Cuando se utiliza un espectrofotómetro por primera vez es importante obtener primero la granja de colonias en recuentos de unidades, para correlacionar con los valores de densidad óptica.Por lo tanto, los experimentos comenzarán a utilizar la fase media de crecimiento en la concentración celular inicial de 10 a siete células por mililitros. Se ha demostrado que esta concentración celular proporciona las biopelículas de materia más dependientes y estables. Para empezar, suspender 65 gramos de ASD, complementado con 50 miligramos por litro de cloramphenicol, en 1.000 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados.Coloque el vaso de precipitados en un calentador para hervir, con el fin de disolver el medio por completo. A continuación, transfiera el medio a una botella de vidrio. Coloque la tapa en la botella, pero no la atornille completamente para asegurarse de que la botella pueda ventilar.Coloque el frasco en un autoclave para esterilizar la solución a 15 PSI y 121 grados Celsius durante 30 minutos. Enfríe la solución a unos 45 grados centígrados. Utilice una pipeta desechable y estéril, para mezclar bien, y pipetee 20 mililitros de ASD en placas petri estériles.Para preparar el medio YNB, complementado con 100 milivolares de glucosa, mezclar 6,7 gramos de YNB y 18 gramos de dextrosa a 1.000 mililitros de agua ultra pura en un vaso de precipitados. Coloque una barra de agitación en el vaso de precipitados y coloque el vaso de precipitados en un plato de agitación para mezclar. Filtrar el medio a través de un sistema de filtro de vacío de 0,22 micrómetros para esterilizar.Preparar el medio RPMI mezclando 10,4 gramos de RPMI-1640 y 34 gramos de MOPS, a 1.000 mililitros de agua ultra pura. Mezclar en un agitador sin calor y ajustar el PH a siete añadiendo un hidróxido de sodio normal. Esterilice el medio con un sistema de filtro de vacío de 0,22 micrómetros.En primer lugar, descongelar el microorganismo Candida albicans SN 425 a temperatura ambiente. Semilla 10 microlitros del cultivo de parada en platos Petri previamente preparados que contienen ASD, complementados con cloramphenicol. Incubar los platos Petri aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 48 horas.Para el pre-inóculo utilizar un lubricante esterilizado para recoger 10 colonias de Candida albicans de los platos petri y colocarlos en un tubo centrífugo que contiene 10 mililitros de medio YNB, complementado con glucosa. Incubar el tubo aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 16 horas. A continuación, preparar los inóculos mediante la adición de este cultivo de arranque en medio YNB fresco, complementado con glucosa, en una proporción de uno a 10 para la dilución.Utilice el espectrofotómetro para medir el OD inicial a 540 nanómetros. Incubar los inóculos aeróbicamente a 37 grados centígrados durante ocho horas, y medir la OD final a 540 nanómetros. Restar el OD final del OD inicial para comprobar si el OD de los inóculos está en la fase de crecimiento del registro medio.Para obtener un inóculo con 10 a las siete células por mililitro, centrifugar el inóculo durante cinco minutos a 5.500 veces G.Vierta el sobrenadante en un vaso de precipitados que contenga hipoclorito de sodio y agregue YNB fresco para concentrar el inóculo a la mitad del volumen anterior. Añadir un mililitro del inóculo a cada pocódulo de una placa de poliestireno de 24 pocillos. Incubar aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 90 minutos para permitir la adhesión celular al fondo de los pozos.Tratar las biopelículas durante un minuto con un mililitro de 0,12% de clorhexidina para las biopelículas de control positivo. Para el control negativo, tratar las biopelículas durante un minuto con un mililitro de cloruro estéril, 0,89%sódico. Posteriormente, lavar los pozos dos veces, un minuto cada uno, con un mililitro de cloruro de sodio estéril 0,89% para eliminar las células no adherentes.A continuación, encienda una luz roja no coherente y utilice un medidor de potencia para medir la densidad de potencia de la luz. Determinar el tiempo de exposición basado en el requisito de densidad de energía de 87,6 julios por centímetro cuadrado. Coloque la placa debajo de la luz roja.Mantenga la distancia entre la fuente de luz y el biofilm a cinco mililitros para evitar calentar la muestra. Después de la exposición durante un minuto, agregue un mililitro del medio RPMI esterilizado a cada pozo, e incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Por la mañana, repita el mismo lavado, tratamiento ligero, tratamientos de control positivos y negativos, e incubación durante seis horas con medio RPMI.Una vez más, lave las biopelículas dos veces, exponga a la luz roja y realice tratamientos de control positivos y negativos. Aspirar la solución en los pozos y añadir el medio RPMI. Repita la incubación, lavado, tratamiento ligero y tratamientos de control positivos y negativos, hasta lograr 48 horas de desarrollo de biopelículas.Para comenzar a procesar, deseche el medio y agregue un mililitro de cloruro de sodio estéril, 0,89% al pozo, y utilice una punta de pipeta para rascar la biopelícula del pozo. Transfiera el biofilm eliminado a un tubo estéril. Añadir otro mililitro de cloruro estéril, 0,89% de sodio al pozo.Rascalo de nuevo y añade la suspensión al mismo tubo, para un volumen total de 2 mililitros. Vórtice vigorosamente la suspensión del biofilm durante un minuto. Para el análisis de la CFU, transfiera una alícuota de 0,1 mililitros de la suspensión del biofilm a un tubo de micro centrífuga que contenga 900 microlitros de 0,89% de solución de cloruro de sodio para cada dilución.Diluir la solución de biopelícula de 10 a la negativa, a 10 a la cuatro negativa, en solución salina. Siembra 50 microlitros de cada dilución a placas ASD, e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cuente las colonias y aplique la fórmula.Para el análisis de peso seco, primero pese y etiquete los tubos de micro centrífuga. Añadir 0,1 mililitros de la suspensión del biofilm y un mililitro de etanol absoluto en los tubos, y almacenarlos a 20 grados Celsius negativos durante 18 horas. Luego, centrífla 10.000 veces G durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y coloque los tubos en un desecador para secar las muestras durante una semana. Pesar los tubos de micro centrífuga de nuevo, y hacer la resta para obtener el peso de biomasa. En este experimento, después de tratamientos de viáticos con luz roja durante un minuto a las biopelículas de Candida albicans, la UFC se redujo, en comparación con el control negativo tratado con cloruro de sodio.Los resultados de la biomasa de las biopelículas de Candida albicans después de los tratamientos diarios, muestran que el grupo tratado con luz roja presentó una reducción similar de la biomasa a la observada en el grupo de control positivo, tratada con clorhexidina. Los dos grupos también mostraron similitud estadística entre sí. Mientras que ambos mostraron una reducción de la biomasa, en comparación con el control negativo tratado con cloruro de sodio.Se observaron cantidades inferiores de EpS solubles e insolubles de Candida albicans, en control positivo, en comparación con el control negativo. Aunque no es estadísticamente significativa, la aplicación por viáticos de la luz roja disminuyó numéricamente las cantidades de EPS soluble e EPS insoluble. El control negativo y el grupo tratado con luz roja mostraron similitud estadística.Medición de la densidad de potencia de la luz, utilizando un medidor de potencia antes de iniciar el tratamiento para determinar los períodos exactos de aplicación. Los pasos aseguran que la densidad de energía siempre será de 87,6 julios por centímetros cuadrados. Utilice la fórmula anteriormente citada.La medida se realiza utilizando la misma de la luz a la botella de las placas, cinco milímetros. Se puede estudiar una asociación entre la fototerapia y los medicamentos antifúngicos para comprobar si el pretratamiento con luz roja, seguido de la aplicación del fármaco, mejora la penetración del fármaco en el biofilm. Para el tratamiento dos veces al día adaptamos los protocolos de nuestro laboratorio, proporcionando un modelo de biofilm fácil y reproducible, que ofrece respuestas sobre viabilidad, peso seco y cantidades de polisacáridos extracelulares después del tratamiento de luz roja.El protocolo es genérico y se puede utilizar para probar otras terapias, además de la luz roja, incluyendo medicamentos, otras luces, o la combinación de luz y medicamentos. Trabajar con microorganismos requiere equipo especial, como gafas de seguridad, capa de laboratorio de botones y guantes de nitro.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Investigación

Inmunología e Infección

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...