Name: daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Vi tackar Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal och Dr. Iriana Zanin för utvecklingen av denna studie. Vi erkänner också Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) för att donera den stam som analyseras i denna studie.

1. beredning av kultur media
<ol><li>Förbereda sabouraud dextros agar (SDA). Avbryta 65 g SDA kompletteras med kloramfenikol (50 mg/L) i 1000 mL destillerat vatten. Koka upp att upplösa mediet helt. Sterilisera i autoklav vid 15 PSI (121° C) för 30 min. svalna till 45-50 ° C. Blanda väl och häll 20 mL av SDA i sterila Petri plattor (storlek: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Förbereda jäst kväve bas (YNB) medium kompletteras med 100 mM glukos genom att blanda 6,7 g YNB och 18 g dextros till 1 000 mL av ultrarent vatten...

<ol>
	<li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species:+current+epidemiology,+pathogenicity,+biofilm+formation,+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options.">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li><li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms:+effects+on+antimicrobial+resistance.">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li><li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+antifungal+resistance.">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li><li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development.">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li><li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia.">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li><li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function.">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li><li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+super+glue:+the+biofilm+matrix+and+its+composition,+assembly,+and+functions.">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).</li><li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection:+efficacy,+safety,+and+mechanism+of+action.">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li><li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development.">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).</li><li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms.">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology.">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).</li><li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms.">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).</li><li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection.">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li><li>Kuchar&#237;kov&#225;, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujd&#225;kov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin.">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li><li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth,+adhesion+and+biofilm+development.">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li><li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression:+a+genome-wide+analysis.">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li><li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device.">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li></ol>

De viktigaste stegen för framgångsrik odling av C. albicans biofilm är: 1) att göra det före inokulatet och inokulatet i YNB medium kompletteras med 100 mM glukos; (2) att vänta 90 min för fasen vidhäftning och noggrant tvätta två gånger brunnarna med 0,89% NaCl att avlägsna icke-följs celler; och 3) lägga till RPMI medium till klibbade cellerna att starta biofilm bildning, eftersom RPMI kommer att stimulera hyfer tillväxten. Aneuploidies kan uppstå när odling C. albicans. Det är där...

Den ökade incidensen av diabetes, immunsuppressiv terapi program, HIV-infektion, AIDS-epidemin, kliniska ingrepp och brett spektrum antibiotika förbrukning under de senaste åren har ökade incidensen av Candida albicans relaterade sjukdomar1,2. C. albicans infektioner är ofta relaterade till biofilm utveckling och kan orsaka kliniska manifestationer, exempelvis candidiasis eller systemiska manifestationer, såsom candidemi1,2. En av de mest anmärkningsvärda virulensfaktorer biofilm tillväxt är extracellulära polysackarid matrix etableringen. Biofilm bildning samarbetar för att öka motståndet mot befintliga svampdödande läkemedel, miljöbelastning och värd immunologiska mekanismer3.
Biofilm tillväxten av C. albicans börjar med plankton celler tidig anslutning till ett substrat, följt av förökningen av jästceller genom substrat yta och hyphal tillväxt. Den sista fasen av biofilm tillväxt är den mognad fasen, vari jäst-liknande utvecklingen dämpas, hyphal utveckling expanderar och extracellulärmatrix omsluter den biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrisen samverkar för att bilda mannan-glukan komplexa5,6. Växelverkan av exopolysaccharides är avgörande för försvar av biofilmer mot droger7. Minskning av EPS från C. albicans extracellulärmatrix kunde därför stödja utvecklingen av nya antimikrobiella protokoll för oral candidos kontroll.
Ljus reglerar tillväxt, utveckling och uppförande av flera organismer8 och den har använts som en antimikrobiell i fotodynamisk antimikrobiell kemoterapi (PACT). PAKTEN gäller en synligt ljus av en viss våglängd och en ljus-absorberande photosensitizer9. Photosensitizers har dock svårigheter att penetrera biofilmen, orsakar lägre effekt10. Terapeutiska medel underlåtenhet att fullt infiltrera biofilmer är en anledning att biofilmer ibland motstå traditionell antimikrobiell terapi3,5. Om du vill inaktivera bifogade mikrobiella cellerna, behöver antimikrobiella ämnen genomsyra genom den extracellular matrisen; dock karaktäriserar EPS en diffusionsstyrd hinder för sådana molekyler genom att fråga deras nivå av transport in i biofilm eller genom att påverka svaret av det antimikrobiella medlet uteslutande med matrisen själv11.
Med tanke på nackdelarna med pakten, användningen av ljus i sig framstår som en värdefull förbättring. Preliminära data visade att behandling med blått ljus dagligen betydligt hämmade produktionen av EPS-olöslig i Streptococcus mutans biofilm. Av minskningen av EPS-olöslig minskat blått ljus biofilm tillväxt. Dock är resultaten av ljusbehandling med rött ljus i C. albicans biofilmer knappa. Därför var syftet med denna undersökning att utvärdera i vilken sätt ljusbehandling med rött ljus påverkar tillväxt och arrangemang av C. albicans biofilm. För behandling två gånger dagligen, vi anpassat våra laboratoriets föregående protokoll9,12 för att ge en lätt och reproducerbara biofilm modell som ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarider belopp efter rött ljus behandling. Samma protokoll som kan användas för att testa andra behandlingar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1115px;" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Clorhexidine 20%&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C9394</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Dextrose (D-Glucose) Anhydroous</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">D16-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:372px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">DSP-MD.43</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LumaCare LC-122 A&#160;</td>
			<td style="width:372px;">LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">S641-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Bioreagents&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BP 359-500</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol 5%</td>
			<td style="width:372px;">Milipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">843984</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)</td>
			<td style="width:372px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">R7755</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:449px;">Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol</td>
			<td style="width:372px;">Acumedia</td>
			<td style="width:123px;">7306A</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:123px;">SA200-1</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast nitrogen base&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Difco</td>
			<td style="width:123px;">DF0392-15-9</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS</td>
			<td style="width:372px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M1254</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;24-well polystyrene plate&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353935</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

daily phototherapy with red light to regulate candida albicans biofilm growth

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultaten av traktamente rött ljus behandling på tillväxten av Candida albicans biofilm. För att öka plankton tillväxten av C. albicans SN425, växte inoculums på jäst kväve Base media. För biofilm bildning tillämpades RPMI 1640 media, som har höga halter av aminosyror, för att hjälpa biofilm tillväxt. Biofilmer på 48 h behandlades två gånger dagligen under en period av 1 min med en icke-koherent ljus enhet (rött ljus, våglängd = 635 nm; energitäthet = 87,6 J·cm-2). Som en positiv kontroll (PC), 0,12% klorhexidin (CHX) tillämpades, och som en negativ kontroll (NC), 0,89% NaCl tillämpades på biofilmer. Kolonibildande enheter (CFU), torr vikt, lösliga och olösliga exopolysaccharides kvantifierades efter behandlingar. Kortfattat, det protokoll som presenteras här är enkel, reproducerbar och ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarid belopp efter rött ljus behandling.

Figur 2 visar resultaten av Log10 CFU/mL av C. albicans efter traktamente behandlingar med rött ljus för 1 min. Red light reducerade signifikant den Log10 CFU/mL jämfört med NC (p = 0,004). Figur 3 presenterar resultaten av biomassa (mg) av C. albicans biofilmer efter dagliga behandlingar. Alla behandlade grupperna visade minskning av biomassa jämfört med NC (p = 0.000) och den röda ...

Watch this Scientific Journal Video about Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth at JoVE.com

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Dagliga ljusbehandling med rött ljus att reglera Candida albicans Biofilm tillväxt

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultatet av rött ljus ansökan om tillväxten av Candida albicans biofilm. En icke-koherent rött ljus enhet med våglängd 635 nm och energitäthet av 87,6 J·cm-2 tillämpades under hela tillväxten av Candida albicans biofilmer för 48 h.

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida är den vanligaste orsaken till spridas svampinfektion i immunkomprometterade värdar. Misslyckandet med terapeutiska medel att helt infiltrera biofilm på grund av matrisen är en anledning till att biofilmer motstå traditionella terapier. Vårt protokoll utvärderar hur ljusterapi, med rött ljus, stör tillväxten och arrangemanget av Candida albicans biofilms.De metoder som tillämpas är väl etablerade, eftersom den stam som används i denna studie hade sin extracellulära matris karakteriseras och ljuset enheten har framgångsrikt tillämpas på andra planktonmikroorganism suspensioner och biofilms. Den största fördelen med denna apparat är minskningen av behandlingstiden, vilket gör den mer synlig för kliniska tillämpningar. När kulturing Candida albicans vara medveten om att antikroppar kan förvärvas.Därför är det viktigt att inte använda kolonier som är mer än sju dagar gamla, att inte starta plattor vid fyra grader Celsius, och inte att återstrimma celler från befintliga plattor. Likaså bör en stam användas före 18 timmars tillväxt över natten. När du använder en spektrofotometer för första gången är det viktigt att först erhålla koloni gård i enheter räknas, att korrelera till optisk densitet värden.Därför kommer experiment att börja använda mitten av tillväxtfasen i initial cellkoncentration på 10 till sju celler per milliliter. Denna cellkoncentration har visat sig ge de mest beroende och stabila materia biofilmer. Till att börja, suspend 65 gram SDA, kompletterat med 50 milligram per liter kloramfenikol, i 1, 000 milliliter destillerat vatten i en bägare.Placera bägaren på en värmare för att koka, för att lösa upp mediet helt. Överför sedan media till en glasflaska. Placera locket på flaskan, men gör ingen skruva ner det helt för att säkerställa att flaskan kan ventilera.Placera flaskan i en autoklav för att sterilisera lösningen vid 15 PSI och 121 grader Celsius i 30 minuter. Kyl lösningen till runt 45 grader Celsius. Använd en engångs, steril pipettering, för att blanda väl, och pipettera 20 milliliter SDA i sterila Petri plattor.För att förbereda YNB-medium, kompletterat med 100 millimolarglukos, blanda 6,7 gram YNB och 18 gram dextros till 1, 000 milliliter ultra rent vatten i en bägare. Placera en rör bar i bägaren och lägg bägaren på en omrörning tallrik för att blanda. Filtrera mediet genom ett 0,22 mikrometer vakuumfiltersystem för att sterilisera.Förbered RPMI medium genom att blanda 10,4 gram RPMI-1640 och 34 gram MOPS, till 1, 000 milliliter ultra rent vatten. Blanda i en omrörare utan värme och justera PH till sju genom att tillsätta en normal natriumhydroxid. Sterilisera mediet med hjälp av ett 0,22 mikrometer vakuumfiltersystem.Först tina mikroorganismen Candida albicans SN 425 vid omgivande temperatur. Frö 10 mikroliter av stoppkulturen på tidigare tillagade Petriskålar som innehåller SDA, kompletterat med Kloramfenikol. Inkubera Petri-diskarna aerobt vid 37 grader Celsius i 48 timmar.För pre-inokulat använda en steriliserad glidmedel för att plocka 10 kolonier av Candida albicans från Petri-rätter och placera dem i en centrifugrör som innehåller 10 milliliter av YNB medium, kompletterat med glukos. Inkubera röret aerobt vid 37 grader Celsius i 16 timmar. Förbered sedan inokulat genom att lägga till denna förrätt kultur i färskt YNB medium, kompletterat med glukos, i en en till 10 andel för utspädning.Använd spektrofotometern för att mäta den initiala OD vid 540 nanometer. Inkubera inokulat aerobt vid 37 grader Celsius i åtta timmar, och mät den slutliga OD på 540 nanometer. Subtrahera den slutliga OD från den inledande OD för att kontrollera om OD av inokulaten är på mitten av log tillväxtfasen.För att få ett inokulat med 10 till de sju cellerna per milliliter, centrifuger inokulet i fem minuter vid 5, 500 gånger G.Häll supernatanten i en bägare som innehåller natriumhypoklorit och tillsätt färsk YNB för att koncentrera inokulet till hälften av den tidigare volymen. Tillsätt en milliliter av inokulat till varje brunn av en 24 väl polystyren platta. Inkubera aerobt vid 37 grader Celsius i 90 minuter för att tillåta celladhesion till botten av brunnarna.Behandla biofilmerna i en minut med en milliliter på 0,12%klorhexidin för de positiva kontrollbiofilmerna. För den negativa kontrollen, behandla biofilmerna i en minut med en milliliter steril, 0,89%natriumklorid. Därefter tvätta brunnarna två gånger, en minut vardera, med en milliliter steril 0,89%natriumklorid för att avlägsna icke-anhängare celler.Slå sedan på ett icke-sammanhängande rött ljus och använd en effektmätare för att mäta ljusets effekttäthet. Bestäm exponeringstiden baserat på energitäthetskravet på 87,6 joule per kvadratcentimeter. Placera plattan under det röda ljuset.Håll avståndet mellan ljuskällan och biofilmen till fem milliliter för att undvika att provet värms upp. Efter exponering i en minut, tillsätt en milliliter av det steriliserade RPMI-mediet till varje brunn, och inkubera plattorna i 37 grader Celsius över natten. På morgonen, upprepa samma tvätt, ljusbehandling, positiva och negativa behandlingar kontroll, och inkubation i sex timmar med RPMI medium.Återigen, tvätta biofilmer två gånger, utsätta dem för rött ljus, och utföra positiva och negativa kontrollbehandlingar. Aspirera lösningen i brunnarna och lägg till RPMI medium. Upprepa inkubation, tvätt, ljusbehandling, och positiva och negativa kontrollbehandlingar, tills uppnå 48 timmars biofilm utveckling.För att börja bearbetningen, kassera mediet och tillsätt en milliliter steril, 0,89%natriumklorid till brunnen, och använd en pipett spets för att repa biofilmen från brunnen. Överför den borttagna biofilmen till ett sterilt rör. Tillsätt ytterligare en milliliter steril, 0,89%natriumklorid till brunnen.Skrapa den igen och lägg till suspensionen i samma rör, för en total volym på 2 milliliter. Virvel kraftfullt biofilm suspensionen i en minut. För CFU-analys, överför en alikvot på 0,1 milliliter från biofilms suspensionen till ett mikrocentrifugrör som innehåller 900 mikroliter med 0,89%natriumkloridlösning för varje spädning.Späd biofilmlösningen från 10 till den negativa, till 10 till de negativa fyra, i saltlösning. Frö 50 mikroliter av varje spädning till SDA-plattor, och inkubera plattorna i 37 grader Celsius i 48 timmar. Räkna kolonierna och applicera formeln.För torrviktsanalys, först väga och märka mikro centrifugrör. Tillsätt 0,1 milliliter av biofilm suspension och en milliliter absolut etanol i rören, och förvara dem på negativa 20 grader Celsius i 18 timmar. Sedan centrifugera det 10, 000 gånger G i 10 minuter.Kassera supernatanten och lägg rören i en exsiccator för att torka proverna i en vecka. Väg mikrocentrifugrören igen, och gör subtraktionen för att erhålla biomassavikten. I detta experiment, efter per diem behandlingar med rött ljus i en minut till Candida albicans biofilms, CFU minskades, jämfört med den negativa kontrollen behandlas med natriumklorid.Resultaten av biomassan av Candida albicans biofilmer efter dagliga behandlingar, visar rött ljus behandlade gruppen presenteras liknande minskning av biomassa som observerats i den positiva kontrollgruppen, behandlas med klorhexidin. De två grupperna visade också statistisk likhet med varandra. Medan de båda visade minskning av biomassan, jämfört med den negativa kontrollen behandlas med natriumklorid.Sämre mängder candida albicans lösliga och olösliga EPS, observerades i positiv kontroll, jämfört med negativ kontroll. Även om inte statistiskt signifikant, per diem tillämpning av rött ljus numeriskt minskat mängder eps lösliga och EPS olösliga. Den negativa kontrollen och den röda ljusbehandlade gruppen, visade statistisk likhet.Mätning av ljusets effekttäthet, med hjälp av en effektmätare innan behandlingen påbörjas för att bestämma de exakta ansökningsperioderna. Stegen försäkrar att energitätheten alltid kommer att vara 87,6 joule per centimeter i kvadrat. Använd den formel som tidigare citerats.Mätningen görs med samma från ljuset till flaskan av plattorna, fem millimeter. Ett samband mellan ljusterapi och svampdödande läkemedel kan studeras för att kontrollera om förbehandlingen med rött ljus, följt av läkemedelsapplikation, förbättrar läkemedelspenetrationen i biofilmen. För två gånger dagligen behandling vi anpassat våra laboratorium protokoll, vilket ger en enkel, och reproducerbara biofilm modell, som ger svar om lönsamhet, torr vikt, och extracellulära polysackarid belopp efter rött ljus behandling.Protokollet är generiskt och kan användas för att testa andra terapier, förutom rött ljus, inklusive droger, andra lampor, eller kombinationen av ljus och droger. För att arbeta med mikroorganismer krävs särskild utrustning, som skyddsglasögon, knapplabbet och nitrohandskar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

En 96 Väl mikrotiterplatta-baserad metod för övervakning Bildning och svampdödande resistensbestämning av Candida albicans Biofilmer

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studera Microbial gemenskaperna<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av Host-medierad interaktion mellan<em&gt; Candida albicans</em&gt; Och<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Djup Dermal injektion som en modell av Candida albicans hudinfektion för histologiska analyser

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murin mag-tarmkanalen med fluorescerande in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Förtydligande och Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

En Ex vivo-analys att studera Candida albicans Hyphal Morphogenesis i mag-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-medied fotodynamisk terapi för att hämma Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Användning av in vivo-avbildning för att screena för morfogenesfenotyper i Candida albicans mutanta stammar under aktiv infektion hos en däggdjursvärd

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...