Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

واشتركت في دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21676026)، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي الوطني في الصين (المنحة رقم 2017YFD0201400)، والمؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (المنحة رقم 2017M620643). وقد تم دعم الأعمال في معهد النهوض بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (سوتشو) من خلال المنح الداخلية من مقاطعة جيانغسو ومنتزه سوتشو الصناعي.

1. بناء البلازميدات التي تعبر عن الجينات علامة نادرة الغنية codon
<ol><li>حدد جين علامة يحتوي على عدد مناسب من codons المشتركة للحمض الأميني المستهدف. ملاحظة: بالنسبة لL-leucine، يستخدم الجين المقاومكاناشين كانR، الذي يحتوي على 29 codons ليوسين ، منها 27 codons المشتركة ، لبناء نظام الاختيار<sup class=...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

عدد codons نادرة في الجينات علامة ووسيط الاختيار أو الفرز حاسمة لمنع تعبيرات البروتين من الجينات علامة نادرة codon المعدلة. إذا لم يكن من المتمكن الكشف عن فرق كبير بين تعبيرات البروتين من جينات علامات من النوع البري ومشتقاتها، فإن زيادة عدد الكودونات النادرة أو استخدام وسيلة محدودة بالمغذيات ?...

يعتمد الإنتاج الحالي للأحماض الأمينية بشكل كبير على التخمير. ومع ذلك، فإن titers والغلة لمعظم سلالات إنتاج الأحماض الأمينية هي أقل من الطلب المتزايد لسوق الأحماض الأمينية العالمية التي تبلغ قيمتها مليارات الدولارات1،2. الحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية عالية الأداء أمر بالغ الأهمية لرفع مستوى صناعة الأحماض الأمينية.
الاستراتيجية التقليدية لتحديد الأحماض الأمينية الإفراط في الشركات يستغل المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها في تخليق البروتين3،4. هذه النظيرات قادرة على شحن tRNAs التي تعترف الأحماض الأمينية المقابلة وبالتالي تمنع استطالة سلاسل الببتيد، مما يؤدي إلى النمو القبض أو موت الخلية5. إحدى الطرق لمقاومة الضغوط التناظرية هي زيادة تركيزات الأحماض الأمينية داخل الخلايا. الأحماض الأمينية المخصب سوف تتفوق على النظير لtRNAs محدودة وضمان التوليف الصحيح للبروتينات الوظيفية. ولذلك، يمكن اختيار السلالات التي البقاء على قيد الحياة النظير ومن المرجح أن الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المقابلة.
على الرغم من أن ثبت نجاحها في اختيار الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية مثل L-ليوسين6, الاستراتيجية التناظرية القائمة على يعاني من عيوب شديدة. أحد الشواغل الرئيسية هو المقاومة التناظرية التي نشأت من عملية الطفرات أو من خلال الطفرات العفوية. سلالات مع المقاومة يمكن الهروب من الاختيار عن طريقحظر أو تصدير أو تدهور النظير 5. قلق آخر هو الآثار الجانبية السامة للنظائر على العمليات الخلوية الأخرى7. ونتيجة لذلك, السلالات التي البقاء على قيد الحياة اختيار التناظرية قد لا يكون الإفراط في الأحماض الأمينية, في حين أن الإفراط المطلوب يمكن إبادة زورا بسبب الآثار الجانبية السلبية.
هنا، يتم تقديم استراتيجية جديدة على أساس قانون التحيز codon من أجل تحقيق تحديد دقيق وسريع للإفراط في الأحماض الأمينية. يتم ترميز معظم الأحماض الأمينية من قبل أكثر من ثلاثي النيوكليوتيد الذي يفضل بشكل مختلف من قبل الكائنات الحية المضيفة8،9. ونادرا ً ما يتم استخدام بعض codons في تسلسلات الترميز ويشار إليها باسم codons النادرة. ترجماتها إلى الأحماض الأمينية تعتمد على tRNAs الكونات التي تحمل الأحماض الأمينية المقابلة. ومع ذلك، فإن tRNAs التي تعترف codons نادرة عادة ما يكون وفرة أقل بكثير من tRNAs من codons المشتركة10،11. وبالتالي، فإن هذه الـ tRNAs النادرة أقل احتمالاً لالتقاط الأحماض الأمينية الحرة في المسابقات مع النظائر الأخرى، وتبدأ ترجمات التسلسلات الغنية بالكدون النادرة في التباطؤ أو حتى يتم إنهاؤها عندما تكون كميات الأحماض الأمينية محدودة 10.يمكن استعادة الترجمات، من الناحية النظرية، إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن tRNAs المشتركة مرادفة بسبب الإفراط في الإنتاج أو التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة12. إذا كان الجين النادر الغنية codon ترميز مجموعة أو علامة الفرز، يمكن بعد ذلك تحديد سلالات تظهر الأنماط الظاهرية المقابلة ومن المرجح أن تكون الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة.
يتم تطبيق الاستراتيجية المذكورة أعلاه لإنشاء نظام اختيار وفحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية. يستخدم نظام الاختيار جينات مقاومة المضادات الحيوية (على سبيل المثال، kanR)كعلامات بينما يستخدم نظام الفحص الجينات ترميز الفلورسنت (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) أو الكروموجينيك (على سبيل المثال، PrancerPurple) البروتينات. يتم تعديل جينات العلامة في كلا النظامين عن طريق استبدال أرقام محددة من codons المشتركة للحمض الأميني المستهدف مع بديل نادر مرادف لها. يتم اختيار السلالات في مكتبة الطفرة التي تأوي جين العلامة الغنية بالكدون النادر ة أو فحصها في ظروف مناسبة، ويمكن التعرف بسهولة على الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة. يبدأ سير العمل مع بناء نظام الجينات علامة نادرة الغنية codon، تليها الأمثل لظروف العمل، ومن ثم تحديد والتحقق من الإفراط في الأحماض الأمينية. وتستند هذه الاستراتيجية التناظرية المستقلة على العقيدة في ترجمة البروتين، وقد تم التحقق عمليا لتمكين تحديد دقيقة وسريعة من الإفراط في الأحماض الأمينية. من الناحية النظرية، يمكن استخدامه مباشرة إلى الأحماض الأمينية مع codons نادرة وجميع الكائنات الحية الدقيقة. في الكل، فإن الاستراتيجية القائمة على codon نادرة بمثابة بديل فعال للنهج المستندة إلى التناظرية التقليدية عندما النظير السليم للأحماض الأمينية محددة غير متوفرة، أو عندما يكون معدل إيجابي كاذبة عالية هو الشاغل الرئيسي. يستخدم البروتوكول أدناه اللوكين نادرة codon لإثبات هذه الاستراتيجية في تحديد الإشريكية القولونية L-ليوسين الإفراط.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

لتلبية السوق المتنامية باستمرار للأحماض الأمينية، هناك حاجة إلى سلالات الإنتاج عالية الأداء. يتم تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية بشكل تقليدي عن طريق تسخير المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة المستندة إلى التناظرية هي من دقة منخفضة، ونظائرها المناسبة للأحماض الأمينية محددة محدودة. هنا، نقدم استراتيجية بديلة تمكن من فحص دقيق وحساس وعالي الإنتاجية للإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة غنية بالكودون. هذه الاستراتيجية مستوحاة من ظاهرة التحيز استخدام codon في ترجمة البروتين، والتي يتم تصنيف codons في تلك الشائعة أو النادرة على أساس ترددات حدوثها في الحمض النووي الترميز. تعتمد ترجمة codons النادرة على نقلها النادر المقابل RNAs (tRNAs)، والتي لا يمكن شحنها بالكامل من قبل الأحماض الأمينية الكونات تحت المجاعة. من الناحية النظرية، يمكن شحن tRNAs نادرة إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن isoacceptors المشتركة مرادفة. ولذلك، يمكن استعادة الترجمات المتخلفة الناجمة عن codons نادرة عن طريق التغذية أو الإفراط داخل الخلايا من الأحماض الأمينية المقابلة. في ظل هذا الافتراض، يتم إنشاء نظام اختيار أو فحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية عن طريق استبدال codons المشتركة من الأحماض الأمينية المستهدفة مع بدائلها النادرة مرادفة في جينات مقاومة المضادات الحيوية أو الجينات ترميز البروتينات الفلورية أو الكروموجينية. نبين أن تعبيرات البروتين يمكن أن تعوق إلى حد كبير من خلال إدراج codons نادرة وأن مستويات البروتينات ترتبط بشكل إيجابي مع تركيزات الأحماض الأمينية. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المتعددة بسهولة من مكتبات الطفرات. تتطلب هذه الاستراتيجية المستندة إلى codon النادرة جينًا معدلًا واحدًا فقط، والمضيف أقل احتمالاً للهروب من الاختيار منه في طرق أخرى. ويوفر نهجا بديلا للحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية.

بالنسبة لنظام الاختيار، ينبغي ملاحظة انخفاض حاد في OD600 للسلالات التي تأوي جين مقاومة المضادات الحيوية الغنية بالكدون النادر ة مقارنة بسلالة إيواء جين مقاومة المضادات الحيوية من النوع البري عند المستزرع في مناسبة متوسطة(الشكل 1أ). في ظل نفس الظروف، ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

تقدم هذه الدراسة استراتيجية بديلة للطريقة التقليدية السامة المستندة إلى التناظرية في تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة الغنية codon لتحقيق الدقة والحساسية، والإنتاجية العالية في وقت واحد.

تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة Codon الغنية

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

توفر هذه الطريقة بديلاً فعالاً للنهج التقليدي القائم على التناظرية في الحصول على الأحماض الأمينية المفرطة. هذه التقنية outcompetes الأسلوب التقليدي المستندة إلى التناظرية بتوفير دقة حساسية و سرعة عالية في نفس الوقت. هذه الطريقة يلقي ضوءا جديدا على فهم الأحماض الأمينية الإفراط في إنتاج القوة وترجمة كودونات نادرة، ويمكن، نظريا، يمكن تطبيقها على جميع الكائنات الحية الدقيقة.يعتمد هذا البروتوكول في الغالب على العمليات التجريبية الجزيئية الأساسية التي يسهل اتباعها ولكنها قد تتطلب تجارب متعددة من أجل تحقيق الاختيار المناسب من السلاسل المجهدة. عرض مرئي لهذه التقنية يقدم تقديراً مباشراً على أداء الاختيار ونظام فحص في تحديد منتجي الأحماض الأمينية. لبدء هذا الإجراء، إضافة المتجه في شظايا علامة، على الجليد، في نسبة المول من واحد إلى سبع نقاط خمس ميكرولترات من مزيج التجميع إلى حجم إجمالي قدره عشرة ميكرولترات.احتضان في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تحويل خمسة ميكرولترات من المنتج التجميع إلى 50 ميكرولترات من الخلايا المكونة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. استعادة الخلايا في مرق سوبر الأمثل مع قمع Catabolite المتوسطة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.ثم، لوحة لهم على LB أغار المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم مجموعة مفضلة تجارية لعزل البلازميد. أولا ، تحويل 50 ميكرولترات من الخلايا المختصة مع ميكرولتر واحد من plasmid التي تحمل كانر من النوع البرية.تحويل مجموعة ثانية من الخلايا المختصة مع plasmid التي تحتوي على KanR RC 29 مع جميع codons leucine استبدالها كودون CTA نادرة. لوحة واحتضان ثقافة الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، نقل المستعمرات التي تؤوي جين علامة الاختيار من النوع البري في المشتقة الغنية بالكدون النادرة بشكل فردي إلى خمسة ملليلتر من متوسط LB المخفف خمسة أضعاف يحتوي على الكاناميسين بتركيز 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. ثم، نقل 200 ميكرولتراتر من كل من الثقافات الخلية إلى لوحة 96 جيدا في ثلاث ية في نقاط زمنية محددة. استخدام قارئ لوحة لقياس OD600.تلقيح البقع التي تؤوي الجين علامة KanR RC 29 في مجموعتين من خمس ملليلتر من 0.2 × LB المتوسطة التي تحتوي على kanamycin، مع أو بدون إمدادات من L-leucine. إضافة L-leucine إلى واحدة من وسائل الإعلام إلى تركيز النهائي من غرام واحد للتر الواحد. احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة وقياس OD600 لكل ثقافة في نقاط زمنية محددة.للبدء ، وتحويل 50 ميكرولترات من سلالة الأم المستخدمة في الطفرات مع ميكرولتر واحد من plasmid التي تحمل GFP من النوع البرية أو PPG من النوع البرية. لوحة واحتضان ثقافات الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل المستعمرات بشكل فردي إلى خمسة ملليلتر من متوسط LB المخفف بشكل صحيح.احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة. بالنسبة لعلامات الفلوريس، نقل 200 ميكرولترات من ثقافات الخلايا إلى 96 لوحة خلفية واضحة بشكل جيد في ثلاث نسخ في نقاط زمنية محددة. قياس OD600 في الفلوريسنس وحساب كثافة الفلوريسين.بالنسبة لعلامات chromogenic، قياس تطور اللون من الثقافات الخلية. تنفيذ فحص التغذية كما هو موضح سابقا وقياس كثافة الفلوريسين أو تطور اللون في نقاط زمنية محددة. أولا، تحويل 50 ميكرولتردات من الخلايا المتحولة مع ميكرولتر واحد من البلازميد تحمل علامة اختيار KanR RC 29، أو علامات الفرز GFP RC أو PPG RC. بعد ذلك، أجهزة الطرد المركزي الثقافات الخلية في 4000 مرات G لمدة خمس دقائق.لاختيار، والتخلص من عظمى وإضافة خمسة ملليلترات من 0.2 × LB المتوسطة التي تحتوي على kanamycin إلى الخلايا التي تحمل علامة الاختيار. احتضان العينة بين عشية وضحاها في شاكر في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، لوحة ثقافة بين عشية وضحاها على 0.2 × LB أغار المتوسطة التي تحتوي على كاناميسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.للفحص، لوحة العدد المناسب من الخلايا التي تأوي علامة الفحص على LB agar المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات. بعد ذلك، تلقيح متوسطة LB التي تحتوي على المضاد الحيوي المناسب مع كل مستعمرة واحدة من الصفيحة.احتضان العينات في شاكر في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. قياس OD600 وفلوريسنس وحساب كثافة الفلورس إذا تم استخدام GFP RC. قياس تطور الألوان من الثقافات الخلية إذا تم استخدام PPG RC.للتحقق من إنتاجية الأحماض الأمينية من سلالات المرشح، وإعداد ثقافة البذور عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB المتوسطة مع كل من سلالات المرشح والسماح للخلايا تنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة وعند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، حصاد الخلايا من ملليلتر واحد من خلية من ثقافة عن طريق الطرد المركزي في 4000 مرات G لمدة دقيقتين. تجاهل السوبر و resuspend لوحة مع ملليلتر واحد من الماء المعقم.تلقيح 20 ملليلتر من M9 المتوسطة التي تحتوي على أربعة في المئة الجلوكوز مع 200 ميكرولترات من تعليق الخلية واحتضان في شاكر 250 ملليلتر في 250 دورة في الدقيقة وعند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، كان جهاز الطرد المركزي ملليلتراً واحداً من الوسط الثقافي عند 4000 مرة من G لمدة خمس دقائق. نقل 200 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة.إعداد حلول L-leucine القياسية في التركيزات هو مبين هنا. في غطاء الدخان، إضافة 100 ميكرولترات من ثلاثي اليثيلامين واحد ملليمولار و 100 ميكرولترات من واحد المولر فينيل isothiocyanate إلى كل من فائقة والمعايير. اخلطي الحلول بلطف وحضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم، إضافة 400 ميكرولترات من ن-الهيكسان إلى نفس الأنبوب ودوامة لمدة عشر ثوان. المرحلة السفلي يحتوي على مشتقات الأحماض الأمينية ويستخدم لتحليل HPLC. تصفية المرحلة السفلى من خلال 0.2 أغشية البوليتيترافلورو الإيثيلين ميكرولتر.بعد ذلك، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من العينة على HPLC فائقة مجهزة بعمود C18 بمعدل تدفق 0.42 ملليلتر في الدقيقة وفي درجة حرارة العمود ل 40 درجة مئوية. استخدم كاشف صفيف ثنائي ثنائي للكشف عن الأحماض الأمينية المستهدفة في 254 نانومتر وحساب تركيزاتها عن طريق رسم خرائط مناطق الذروة تحت المنحنى القياسي. في هذه الدراسة، يتم تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة الغنية بالكدون لتحقيق الدقة والحساسية والإنتاجية العالية في وقت واحد.بالنسبة لنظام الاختيار ، يجب ملاحظة انخفاض حاد في OD600 للسلالات التي تؤوي جين مقاومة المضادات الحيوية الغنية بالكدون النادرة بالمقارنة مع السلالة التي تؤوي النوع البري. تثبيط كودون نادرة على تعبيرات البروتين يحدث في الغالب في ظل ظروف تجويع. بعد التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة، وOD600 لسلالة إيواء الجينات النادرة الغنية بالمضادات الحيوية codon الغنية يزيد بشكل ملحوظ.بالنسبة لنظام الفحص ، فإن شدة الفلوريس في عدد الخلايا الفلورية أقل بكثير بالنسبة للإجهاد الذي يعبر عن البروتين الفلوري من الجين النادر الغني بالكدون منه من الجين البري. تغذية من الأحماض الأمينية المقابلة سوف استعادة التعبيرات البروتين من الجينات النادرة الغنية كودون. عند استخدام البروتين الأرجواني ، فإن اللون الذي تم تطويره من PPG الغنية بالكودون النادرة أخف من ذلك من الجين البري.يسمح متوسط LB غير المخفف بالتعبير البطيء عن PPG الغنية بالكدون النادرة دون تغذية L-leucine في البروتين الأرجواني المعبر عنه يصبح مرئيًا بمجرد أن يتم بيليه الخلايا. ومع ذلك، هذا لا يخفي حقيقة أن يتم تعزيز التعبير الجيني من PPG الغنية كودون نادرة عن طريق تغذية ل-لوسين. استراتيجية نادرة القائمة على كودون يمكن تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة من مكتبة الطفرات وهذه المسوخ ينبغي أن تنتج كميات أعلى من الأحماض الأمينية المستهدفة من سلالات الأم.عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ضبط تردد كودون نادرة لتحقيق تمييز واضح في OD أو اللون بين الخلايا التي تأوي علامات من النوع البري ومشتقاتها الغنية بالكدون النادرة. ويمكن تطبيق تحليل النسخ وتسلسل الجينوم على السلالات المختارة للتحقيق في الآلية المتعلقة بإنتاج الأحماض الأمينية. باستخدام هذه التقنية، يمكن تحديد الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية بكفاءة وتحليل معلوماتهم الوراثية من شأنه أن يقدم رؤى جديدة في آلياتها وراء الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية.يمكن أن يكون اشتقاق الأحماض الأمينية ضارة. تأكد من ارتداء القفازات والملابس الواقية وأداء هذه الخطوات في غطاء أبخرة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

التحلل من شيف-قاعدة ني مجمع الظروف عن طريق مناسبة للاحتباس حماية المجموعات حمض عطوب

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

عزل هيستون من نسيج أوراق الذرة الرفيعة لقياس الطيف الكتلي العلوي لأسفل من العلامات اللاجينية المحتملة

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

الدمج الأمثل لنظائر الأحماض الدهنية ألكينيل للكشف عن البروتينات الأسيلات الدهنية باستخدام Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

تحديد البروتينات الملزمة للليجاندات الصغيرة مع العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...