Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Arbejdet blev understøttet af National Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 21676026), det nationale Key R & D program i Kina (Grant No. 2017YFD0201400), og China postdoc Science Foundation (Grant No. 2017M620643). Værker på UCLA Institute of avancement (Suzhou) blev støttet af de interne tilskud fra Jiangsu-provinsen og Suzhou Industrial Park.

1. konstruktion af plasmider udtrykker de sjældne-codon-rige markørgener
<ol><li>Vælg en markør gen, der indeholder et passende antal af de fælles kodon for den målrettede aminosyre. Bemærk: for L-leucin anvendes kanamycin-resistens genet kanR, som indeholder 29 leucin codons, hvoraf 27 er almindeligt codons, til opførelse af udvælgelsessystemet13. Gfp -genet, som indeholder 17 almindelige kodon ud af 19 leucin kodon, eller det lilla protein-kodnings-gen<...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Antallet af sjældne kodon i markørgener og udvælgelse eller screening medium er afgørende for at hæmme protein udtryk fra de sjældne-codon-modificerede markørgener. Hvis der ikke kan påvises nogen signifikant forskel mellem protein udtryk fra Wild-type markørgener og derivater heraf, kan en forøgelse af antallet af sjældne kodon eller anvendelse af et nærings begrænset medium forstærke forskellene. Men hvis hæmnings effekten er for stærk, kan protein udtrykkene ikke inddrives, selv ved ekstra fodring af d...

Den nuværende produktion af aminosyrer er stærkt afhængig af gæring. Men, titre og udbytter for de fleste aminosyre produktion stammer er under de stigende krav fra det globale aminosyre marked, der er værd milliarder af dollars1,2. Opnåelse af højtydende aminosyre over producenter er afgørende for opgraderingen af aminosyre industrien.
Traditionel strategi til at identificere aminosyre over producenter udnytter konkurrencer mellem aminosyrer og deres analogier i proteinsyntesen3,4. Disse analogerne er i stand til at oplade tRNAs, der genkender de tilsvarende aminosyrer og dermed hæmme forlængelsen af peptidkæder, fører til anholdt vækst eller celledød5. En måde at modstå de analoge belastninger er at øge koncentrationerne af intracellulære aminosyrer. De berigede aminosyrer vil udkonkurrere analoger til finite tRNAs og sikre den korrekte syntese af funktionelle proteiner. Derfor kan stammer, der overlever analoerne vælges og er sandsynligvis over producenter af de tilsvarende aminosyrer.
Selv om det viste sig at være vellykket at udvælge over producenter for aminosyrer som L-leucin6, lider den analoge-baserede strategi af alvorlige ulemper. Et stort problem er den analoge modstand stammer fra processen med mutagenese eller gennem spontane mutationer. Stammer med resistens kan undslippe udvælgelsen ved at blokere, eksportere eller nedværdigende analoner5. En anden bekymring er de giftige bivirkninger af analoerne på andre cellulære processer7. Som en konsekvens, stammer, der overlever den analoge udvælgelse kan ikke være aminosyren over producenter, mens de ønskede over producenter kunne være falsk udryddet på grund af de negative bivirkninger.
Her præsenteres en ny strategi baseret på loven om codon bias for at opnå nøjagtige og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. De fleste aminosyrer er kodet af mere end en nucleotid triplet, der er begunstiget forskelligt af værts organismerne 8,9. Nogle kodon bruges sjældent i kodning sekvenser og omtales som de sjældne kodon. Deres oversættelser til aminosyrer er afhængige af de cognate tRNAs, der bærer de tilsvarende aminosyrer. Men de trnas, der genkender sjældne kodon normalt har meget lavere mængder end trnas af de fælles kodon10,11. Derfor er disse sjældne tRNAs mindre tilbøjelige til at fange de frie aminosyrer i konkurrencerne med andre isoacceptorer, og oversættelser af de sjældne-codon-rige sekvenser begynder at aftage eller endda afsluttes, når mængderne af aminosyrer er begrænset 10. oversættelserne kunne teoretisk set genoprettes, hvis der er en aminosyre overskud efter opladning af de synonyme fælles tRNAs på grund af over produktioner eller ekstra fodring af de tilsvarende aminosyrer12. Hvis det sjældne-codon-rige gen koder et valg eller screening markør, kan stammer, der udviser de tilsvarende fænotyper, så let identificeres og er sandsynligvis over producenterne af de målrettede aminosyrer.
Ovennævnte strategi anvendes til at etablere en udvælgelse og et screening system til identifikation af aminosyre over producenter. Udvælgelsessystemet bruger antibiotikaresistensgener (f. eks. kanR) som markører, mens Screenings systemet bruger de gener, som koder fluorescerende (f. eks. grønt fluorescerende protein [gfp]) eller kromogene (f. eks. prancerpurple) proteiner. Markør generne i begge systemer ændres ved at erstatte definerede numre af de fælles kodon for den målrettede aminosyre med dens synonyme sjældne alternativ. Stammer i mutation biblioteket, der havnen den sjældne-codon-rige markør genet udvælges eller screenes under ordentlige forhold, og over producenter af de målrettede aminosyrer kan let identificeres. Arbejdsprocessen begynder med opførelsen af den sjældne-codon-rige markør gensystem, efterfulgt af optimering af arbejdsvilkårene, og derefter identifikation og verifikation af aminosyren over producenter. Denne analoge-uafhængige strategi er baseret på dogmet i protein oversættelse og er praktisk talt blevet verificeret for at muliggøre præcise og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. Teoretisk, det kunne være direkte ansat til aminosyrer med sjældne kodon og til alle mikroorganismer. I alt vil den sjældne-codon-baserede strategi tjene som et effektivt alternativ til den konventionelle analog-baserede tilgang, når passende analogier til specifikke aminosyrer er utilgængelige, eller når en høj falsk positiv sats er den største bekymring. Nedenstående protokol bruger leucin rare codon til at demonstrere denne strategi for at identificere over producenter af Escherichia coli L-leucin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

For at tilfredsstille det stadigt voksende marked for aminosyrer er der behov for højtydende produktions stammer. Aminosyren over producenter er konventionelt identificeret ved at udnytte de konkurrencer mellem aminosyrer og deres analoner. Men, denne analoge-baserede metode er af lav nøjagtighed, og korrekt analoner til specifikke aminosyrer er begrænset. Her præsenterer vi en alternativ strategi, der muliggør en nøjagtig, følsom og høj gennemløbs screening af aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører. Denne strategi er inspireret af fænomenet codon skik bias i protein oversættelse, for hvilke kodon er kategoriseret i fælles eller sjældne dem baseret på deres frekvenser af forekomsten i kodning DNA. Oversættelsen af sjældne kodon afhænger af deres tilsvarende sjældne Transfer RNAs (trnas), som ikke kan oplades fuldt ud af de cognate aminosyrer under hungersnød. Teoretisk kan de sjældne tRNAs oplades, hvis der er et overskud af aminosyrer efter opladning af de synonyme fælles isoacceptorer. Derfor kan retarderede oversættelser forårsaget af sjældne kodon gendannes ved fodring eller intracellulære over produktioner af de tilsvarende aminosyrer. Under denne antagelse etableres et udvælgelses-eller screeningssystem til identificering af aminosyre overproducenter ved at erstatte de almindelige kodon af de målrettede aminosyrer med deres synonyme sjældne alternativer i antibiotikaresistensgener eller gener kodning af fluorescerende eller kromogene proteiner. Vi viser, at protein udtryk kan være stærkt hæmmet af inkorporering af sjældne kodon, og at niveauerne af proteiner korrelerer positivt med aminosyre koncentrationer. Ved hjælp af dette system, over producenter af flere aminosyrer kan let screenes ud fra mutation biblioteker. Denne sjældne-codon-baserede strategi kræver kun et enkelt modificeret gen, og værten er mindre tilbøjelige til at undslippe udvælgelsen end i andre metoder. Det tilbyder en alternativ tilgang til at opnå aminosyre over producenter.

For udvælgelsessystemet bør et kraftigt fald i OD600 for stammer, der harkedeligt det sjældne-codon-rige antibiotikaresistens-gen, observeres i forhold til den stamme, der harkedeligt det vilde antibiotikaresistens-gen, når det dyrkes i en egnet medium (figur 1a). Under de samme betingelser, faldet i celle OD600 bliver mere indlysende, da antallet af sjældne kodon i antibiotikaresistens genet stiger (figur 1a</s...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Denne undersøgelse præsenterer en alternativ strategi for konventionel toksisk analog-baseret metode til at identificere aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører for at opnå nøjagtighed, følsomhed, og høj gennemløb samtidigt.

Identificering af amino syre-over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Denne metode giver et effektivt alternativ til den konventionelle analog-baserede tilgang til at opnå aminosyre overproducenter. Denne teknik udkonkurrerer den traditionelle analogbaserede metode ved at give nøjagtighed, følsomhed og høj overførselshastighed samtidigt. Denne metode kaster nyt lys over forståelsen af aminosyreoverproduktionsstyrke og oversættelse af sjældne codons og kan teoretisk set anvendes på alle mikroorganismer.Denne protokol er hovedsagelig baseret på grundlæggende molekylære eksperimentelle operationer, som er nemme at følge, men kan kræve flere forsøg for at opnå et passende udvalg af belastende stringenser. En visuel demonstration af denne teknik giver en direkte forståelse af udvælgelsens ydeevne og et screeningssystem til identifikation af aminosyreproducenter. For at starte denne procedure, tilsæt vektoren i markør fragmenter, på is, i en kindtand forhold på en til et til syv punkt fem mikroliter af samleblanding til et samlet volumen på ti mikroliter.Inkubere ved 50 grader Celsius i en time. Omdan fem mikroliter af samleproduktet til 50 mikroliter af komponentceller ved 42 grader Celsius i 30 sekunder. Gendan cellerne i Super Optimal bouillon med katabolit undertrykkelse medium ved 37 grader Celsius i en time.Derefter plade dem på LB Agar medium og inkubere natten over ved 37 grader Celsius. Den næste dag, bruge en foretrukken kommerciel kit til at isolere plasmid. Først omdanne 50 mikroliter af de kompetente celler med en microliter af plasmid, der bærer wild-type KanR.Omdan et andet sæt af de kompetente celler med plasmid, der indeholder KanR RC 29 med alle leucin codoner erstattet af den sjældne codon CTA. Plade og inkuber cellekulturen som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst overføres de kolonier, der huser det vilde markeringsmarkørgen i det sjældne codonrige derivat individuelt, i fem milliliter femdume fortyndet LB-medium indeholdende kanamycin i en koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter.Inkuber prøverne i en shaker ved 37 grader Celsius, mens der rystes ved 250 omdrejninger i minuttet. Derefter overføres 200 mikroliter af hver af cellekulturerne til en 96 brøndplade i tre eksemplarer på definerede tidspunkter. Brug en pladelæser til at måle OD600.Inokuler pletterne huser KanR RC 29 markør genet i to sæt af fem milliliter af 0,2 x LB medium, der indeholder kanamycin, med eller uden en levering af L-leucin. Tilføj L-leucin til et af medierne til en endelig koncentration på et gram pr. liter. Inkuber prøverne i en shaker ved 37 grader Celsius med omrystning ved 250 omdr./min., og OD600 måles for hver kultur på definerede tidspunkter.Til at begynde med omdanne 50 mikroliter af moderselskabet stamme, der anvendes til mutagenese med en mikroliter af plasmid, der bærer den vilde type GFP eller wild-type PPG. Plade og inkuber cellekulturerne som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst overføres kolonierne individuelt til fem milliliter af det korrekt fortyndede LB-medium.Inkuber prøverne i en shaker ved 37 grader Celsius med omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet. For fluorescensmarkører overføres 200 mikroliter af cellekulturerne til en 96 godt klar bundplade i tre eksemplarer på definerede tidspunkter. Od600 måles i fluorescensen, og fluorescensintensiteten beregnes.For kromogene markører måles cellekulturens farveudvikling. Udfør fodring assay som tidligere beskrevet og måle fluorescens intensitet eller farveudvikling på definerede tidspunkter. Først omdannes 50 mikroliter af de mutante celler med en mikroliter af plasmid, der bærer markeringsmarkøren KanR RC 29, eller screeningsmarkørerne GFP RC eller PPG RC. Dernæst centrifuge cellekulturer på 4000 gange G i fem minutter.Ved valg kasseres supernatanten, og der tilsættes fem milliliter 0,2 x LB-medium, der indeholder kanamycin, til celler, der bærer markeringsmarkøren. Inkuber prøven natten over i en shaker ved 37 grader Celsius. Den næste dag, plade natten kultur på 0,2 x LB agar medium, der indeholder kanamycin og inkubere ved 37 grader Celsius i 12 timer.Til screening, plade det passende antal celler huser screening markør på LB agar medium, der indeholder passende antibiotika. Inkubere ved 37 grader Celsius i otte timer. Derefter vaccineres LB-mediet med det relevante antibiotikum med hver enkelt koloni fra pladen.Inkuber prøverne i en shaker ved 37 grader Celsius, mens der rystes ved 250 omdrejninger i minuttet. Mål OD600 og fluorescensen, og udregn fluorescensintensiteten, hvis der anvendes GFP RC. Mål farveudviklingen af cellekulturerne, hvis DER anvendes PPG RC.For at kontrollere aminosyren productivities af kandidaten stammer, forberede frø kultur ved podning fem milliliter LB medium med hver af de kandidat stammer og lad cellerne vokse natten over i en shaker på 250 rpm og ved 37 grader Celsius. Den næste dag, høste cellerne fra en milliliter af cellekulturen ved centrifugering ved 4000 gange G i to minutter. Kassér supernatanten og opsvar paletten igen med en milliliter sterilt vand.Inokuler 20 milliliter M9-medium, der indeholder fire procent glukose med 200 mikroliter af cellesuspensionen og inkuberes i en 250 millilitershaker ved 250 omdrejninger i minuttet og ved 37 grader Celsius i 24 timer. Den næste dag, centrifuge en milliliter af kulturmediet på 4000 gange G i fem minutter. Overfør 200 mikroliter af supernatanten til et rent 1,5 milliliterrør.Forbered L-leucin standardopløsninger ved de koncentrationer, der vises her. I en røghætte tilsættes 100 mikroliter af en millimolar triethylamin og 100 mikroliter af en molar phenyl isothiocyanat til både supernatanten og standarderne. Opløsningerne blandes forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i en time.Derefter tilsættes 400 mikroliter n-hexan til samme rør og vortex det i ti sekunder. Den nederste fase indeholder aminosyrederivaterne og anvendes til HPLC-analyse. Den nederste fase filtreres gennem 0,2 mikroliterpolytetrafluorethylenmembraner.Derefter køres en mikroliter af prøven på en ultra HPLC udstyret med en C18 kolonne med en strømningshastighed på 0,42 milliliter i minuttet og ved kolonnetemperatur i 40 grader Celsius. Brug en diodearraydetektor til at detektere de målrettede aminosyrer ved 254 nanometer og beregne deres koncentrationer ved at kortlægge topområderne under standardkurven. I denne undersøgelse, aminosyre overproducenter identificeres ved hjælp af sjældne codon-rige markører til samtidig opnå nøjagtighed, følsomhed, og høj-throughput.For udvælgelsessystemet bør der observeres et kraftigt fald i OD600 for stammer, der huser det sjældne codonrige antibiotikaresistensgen, i forhold til den stamme, der huser den vilde type. Hæmning af sjældne codon på proteinudtryk for det meste finder sted under udsultede forhold. Efter ekstra fodring af den tilsvarende aminosyre, OD600 for stammen huser den sjældne codon-rige antibiotikaresistens gen stiger betydeligt.For screeningssystemet er fluorescensintensiteten i antallet af lysstofrør betydeligt lavere for den stamme, der udtrykker fluorescerende protein fra det sjældne codonrige gen end fra det vilde gen. Fodring af den tilsvarende aminosyre vil genoprette proteinudtryk fra de sjældne codon-rige gener. Når du bruger det lilla protein, er farven udviklet fra den sjældne codon-rige PPG lettere end fra det vilde gen.Det ufortyndede LB-medie giver mulighed for langsom ekspression af den sjældne codonrige PPG uden L-leucinfodring i det udtrykte lilla protein bliver synligt, når cellerne pelleteres. Dette skjuler dog ikke det faktum, at genekspression fra den sjældne codon-rige PPG forstærkes ved fodring af L-leucin. Den sjældne codon-baserede strategi kunne identificere overproducenter af de målrettede aminosyrer fra mutationsbiblioteket, og disse mutanter bør producere større mængder af de målrettede aminosyrer end forældrestammerne.Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at justere sjældne codon frekvens for at opnå en klar forskelsbehandling i OD eller farve mellem celler huser wild-type markører og de sjældne codon-rige derivater. Transskriptionsanalyse og genomsekvensering kunne anvendes på de udvalgte stammer for at undersøge mekanismen relateret til aminosyreproduktioner. Ved hjælp af denne teknik, aminosyre overproducenter kunne identificeres effektivt og analyse af deres genetiske oplysninger ville give ny indsigt i deres mekanismer bag aminosyre overproduktioner.Aminosyre derivatization kan være skadeligt. Sørg for at bære handsker og beskyttelsesbeklædning og udføre disse trin i en røghætte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Forberedelse og<em&gt; In vivo</em&gt; Anvendelse af en aktivitetsbaseret Probe til<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid-amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Udnytte den Ethylen-frigivende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som værktøj til at studere Ethylen Respons Bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spændingsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjælp af fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyseprodukter af en Ni-Schiff-Base Complex Brug af betingelser egnet til Bevarelse af syrelabile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering af Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Massespektrometri Profilering af potentielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimeret inkorporering af alkynylfedtsyreanaloger til påvisning af fedtaylerede proteiner ved hjælp af klikkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifikation af bindingsproteiner fra små ligands med Ligand Assays differentierede radiale kapillærhandling (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...