Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Het werk werd gezamenlijk gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 21676026), het National key R & D-programma van China (Grant No. 2017YFD0201400), en de China postdoctorale Science Foundation (Grant No. 2017M620643). De werken in het UCLA Institute of vooruitgang (Suzhou) werden gesteund door de interne subsidies van de provincie Jiangsu en het Suzhou Industrial Park.

1. bouw van de plasmiden die de zeldzame codon-rijke marker genen uitdrukken
<ol><li>Selecteer een marker gen dat een passend aantal van de gemeenschappelijke Codons voor het beoogde aminozuur bevat. Opmerking: voor L-leucine wordt de kanamycine resistentie Gene kanR, die 29 Leucine Codons bevat, waarvan 27 gemeenschappelijke Codons, gebruikt voor de bouw van het selectiesysteem13. Het GFP -gen, dat 17 gemeenschappelijke Codons van 19 Leucine Codons bevat, of het ...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Het aantal zeldzame Codons in de marker genen en het selectie-of screening medium is van cruciaal belang voor de remming van eiwit expressies uit de zeldzame-codon-gemodificeerde marker genen. Als er geen significant verschil kan worden gedetecteerd tussen eiwit uitdrukkingen van de wild-type marker genen en hun derivaten, kan het verhogen van het aantal zeldzame Codons of het gebruik van een nutriënt-beperkt medium de verschillen versterken. Echter, als het effect van de remming te sterk is, kunnen de eiwit uitdrukking...

De huidige productie van aminozuren is sterk afhankelijk van fermentatie. Echter, de Antilichaamtiters en opbrengsten voor de meeste aminozuren productie stammen zijn onder de stijgende eisen van de wereldwijde aminozuur markt die miljarden dollars waard is1,2. Het verkrijgen van high-performance aminozuur overproducers zijn essentieel voor de upgrade van de aminozuur industrie.
Traditionele strategie voor het identificeren van aminozuur overproducers exploiteert de competities tussen aminozuren en hun analogen in eiwitsynthese3,4. Deze analogen zijn in staat om de Trna's die de overeenkomstige aminozuren herkennen en dus remmen de rek van de peptide ketens, leidt tot gearresteerd groei of celdood5. Een manier om weerstand te bieden aan de analoge spanningen is het verhogen van de concentraties van intracellulaire aminozuren. De verrijkte aminozuren zullen de analogen voor de eindige Trna's overtreffen en zorgen voor de juiste synthese van functionele eiwitten. Daarom kunnen stammen die de analogen overleven, worden geselecteerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de overeenkomstige aminozuren.
Hoewel bewezen succesvol in het selecteren van overproducers voor aminozuren zoals L-leucine6, de analoge-gebaseerde strategie lijdt aan ernstige nadelen. Een belangrijk punt van zorg is de analoge weerstand die voortkomt uit het proces van mutagenese of door spontane mutaties. Stammen met resistentie kunnen ontsnappen aan de selectie door het blokkeren, exporteren of vernederende de analogen5. Een andere zorg is de toxische neveneffecten van de analogen op andere cellulaire processen7. Als gevolg daarvan, stammen die de analoge selectie overleven mogelijk niet het aminozuur overproducers, terwijl de gewenste overproducers kunnen worden ten onrechte uitgeroeid als gevolg van de negatieve bijwerkingen.
Hier wordt een nieuwe strategie op basis van de wet van codon bias gepresenteerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers te bereiken. De meeste aminozuren worden gecodeerd door meer dan één nucleotide triplet die anders wordt begunstigd door de gastheerorganismen8,9. Sommige Codons worden zelden gebruikt in de codeer sequenties en worden de zeldzame Codons genoemd. Hun vertalingen in aminozuren vertrouwen op de verwant trna's die de corresponderende aminozuren dragen. Echter, de Trna's die zeldzame Codons herkennen hebben meestal veel lagere Abundances dan de Trna's van de gemeenschappelijke Codons10,11. Bijgevolg zijn deze zeldzame Trna's minder waarschijnlijk de vrije aminozuren vast te leggen in de competities met andere isoacceptoren, en vertalingen van de zeldzame-codon-rijke sequenties beginnen te vertragen of zelfs worden beëindigd wanneer de hoeveelheden aminozuren beperkt zijn 10. de vertalingen kunnen in theorie worden hersteld als er na het opladen van een aminozuur overschot de synoniem gebruikelijke Trna's worden opgeladen als gevolg van overproducties of extra voedingen van de overeenkomstige aminozuren12. Als het zeldzame-codon-rijke gen een selectie-of screening marker codeert, kunnen stammen die de corresponderende fenotypes vertonen, gemakkelijk worden geïdentificeerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de beoogde aminozuren.
De bovengenoemde strategie is van toepassing op de vaststelling van een selectie en een screeningsysteem voor de identificatie van aminozuur overproducenten. Het selectiesysteem gebruikt antibioticaresistentiegenen (bijv. kanR) als markers, terwijl het screenings systeem gebruik maakt van de genen codering fluorescentie (bijv. groen FLUORESCERENDE eiwitten [GFP]) of Chromogene (bijv. prancerpurple) eiwitten. De marker genen in beide systemen worden gewijzigd door het vervangen van gedefinieerde aantallen van de gemeenschappelijke Codons voor het beoogde aminozuur met zijn synoniem zeldzame alternatief. Stammen in de mutatie bibliotheek die het zeldzame-codon-rijke marker gen in de haven worden geselecteerd of gescreend onder de juiste omstandigheden, en de overproducenten van de beoogde aminozuren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. De werkstroom begint met de bouw van het zeldzame-codon-rijke marker gensysteem, gevolgd door de optimalisatie van de arbeidsomstandigheden, en vervolgens de identificatie en verificatie van het aminozuur overproducers. Deze analoge-onafhankelijke strategie is gebaseerd op het dogma in eiwit vertaling en is praktisch geverifieerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers mogelijk te maken. Theoretisch, het kan rechtstreeks worden gebruikt om aminozuren met zeldzame Codons en alle micro-organismen. In alle, de zeldzame-codon gebaseerde strategie zal dienen als een efficiënt alternatief voor de conventionele analoge-gebaseerde aanpak wanneer de juiste analogen voor specifieke aminozuren niet beschikbaar zijn, of wanneer een hoge vals positief percentage is de grootste zorg. Het onderstaande protocol gebruikt Leucine rare codon om deze strategie te demonstreren bij de identificatie van Escherichia coli L-leucine overproducers.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Om te voldoen aan de steeds groeiende markt voor aminozuren, zijn high-performance productie stammen nodig. Het aminozuur overproducers worden conventioneel geïdentificeerd door het benutten van de competities tussen aminozuren en hun analogen. Echter, deze analoge gebaseerde methode is van lage nauwkeurigheid, en goede analogen voor specifieke aminozuren zijn beperkt. Hier presenteren we een alternatieve strategie die een accurate, gevoelige en high-throughput screening van aminozuur overproducers met behulp van zeldzame-codon-rijke markers mogelijk maakt. Deze strategie is geïnspireerd door het fenomeen van codon gebruik bias in eiwit vertaling, waarvoor Codons zijn onderverdeeld in gemeenschappelijke of zeldzame degenen op basis van hun frequentie van voorkomen in het coderen van DNA. De vertaling van zeldzame Codons hangt af van hun corresponderende zeldzame overdrachts rna's (trna's), die niet volledig kunnen worden opgeladen door de verwant aminozuren onder de honger. Theoretisch kan de zeldzame tRNAs worden opgeladen als er een overschot van de aminozuren is na het opladen van de synoniem gemeenschappelijke isoacceptors. Daarom kunnen vertraagde vertalingen veroorzaakt door zeldzame Codons worden hersteld door het voeden of intracellulaire overproducties van de overeenkomstige aminozuren. Onder deze aanname wordt een selectie-of screeningsysteem voor het identificeren van aminozuur overproducenten vastgesteld door de gemeenschappelijke Codons van de beoogde aminozuren te vervangen door hun synoniem zeldzame alternatieven in de antibioticaresistentie-genen of de genen coderen van fluorescerende of chromogene eiwitten. We tonen aan dat de eiwit uitdrukkingen sterk kunnen worden gehinderd door de opname van zeldzame Codons en dat de niveaus van eiwitten positief correleren met de aminozuur concentraties. Met behulp van dit systeem, overproducers van meerdere aminozuren kunnen gemakkelijk worden afgeschermd uit mutatie bibliotheken. Deze zeldzame-codon-gebaseerde strategie vereist slechts één gemodificeerd gen, en de gastheer is minder geneigd om te ontsnappen aan de selectie dan in andere methoden. Het biedt een alternatieve aanpak voor het verkrijgen van aminozuur overproducers.

Voor het selectiesysteem moet een scherpe afname in OD600 voor stammen die het zeldzame-codon-rijke gen met antibioticaresistentie verkotteren, worden geobserveerd in vergelijking met de stam die het wild-type antibioticumresistentie-gen verveelt wanneer gekweekt in een geschikte medium (Figuur 1a). Onder dezelfde omstandigheden wordt de afname in cel OD600 duidelijker naarmate het aantal zeldzame Codons in het gen met antibioticaresiste...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Deze studie presenteert een alternatieve strategie voor de conventionele toxische analoge gebaseerde methode bij het identificeren van aminozuur overproducers door gebruik te maken van zeldzame-codon-rijke markers om tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bereiken.

Identificeren van aminozuur Overproducers met behulp van zeldzame-codon-Rich markers

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Deze methode biedt een efficiënt alternatief voor de conventionele analoge benadering bij het verkrijgen van aminozuur overproducers. Deze techniek bestendigt de traditionele op analoge basis gebaseerde methode door tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bieden. Deze methode werpt nieuw licht op het begrijpen van aminozuur overproductie sterke punten en de vertaling van zeldzame codons en kan, theoretisch, worden toegepast op alle micro-organismen.Dit protocol is meestal gebaseerd op elementaire moleculaire experimentele operaties die gemakkelijk te volgen zijn, maar die meerdere proeven vereisen om de juiste selectie van overspannen stringencies te bereiken. Een visuele demonstratie van deze techniek biedt een directe waardering voor de prestaties van de selectie en een screeningsysteem bij het identificeren van aminozuurproducenten. Om deze procedure te beginnen, voeg de vector in de marker fragmenten, op ijs, in een kies verhouding van een tot zeven punt vijf microliters van de assemblage mix aan een totaal volume van tien microliters.Broed een uur lang op 50 graden Celsius. Transformeer vijf microliter van het assemblageproduct in 50 microliter van componentcellen bij 42 graden Celsius gedurende 30 seconden. Herstel de cellen in Super Optimale bouillon met Kataboliet onderdrukking medium op 37 graden Celsius gedurende een uur.Dan, plaat ze op LB Agar medium en incubeer 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag, gebruik maken van een voorkeur commerciële kit om de plasmid te isoleren. Ten eerste, transformeer 50 microliter van de bevoegde cellen met een microliter plasmide die het wild-type KanR draagt.Transformeer een tweede set van de bevoegde cellen met de plasmide met KanR RC 29 met alle leucine codons vervangen door de zeldzame codon CTA. Plaat en incubeer de celcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens de kolonies over die het wild-type selectiemarkeringsgen in het zeldzaam-codon-rijke derivaat individueel in vijf milliliter van vijfvoudig verdund LB-medium met kanamycine met een concentratie van 50 microgram per milliliter bevatten.Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius tijdens het schudden bij 250 rpm. Breng vervolgens 200 microliter van elk van de celculturen over in een 96-putplaat in drievoud op bepaalde tijdstippen. Gebruik een plaatlezer om de OD600 te meten.Inenting van de vlekken herbergen de KanR RC 29 marker gen in twee sets van vijf milliliter van de 0,2 x LB medium dat kanamycine bevat, met of zonder een levering van L-leucine. Voeg L-leucine toe aan een van de media tot een uiteindelijke concentratie van één gram per liter. Broed de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius met schudden bij 250 rpm en meet de OD600 voor elke cultuur op bepaalde tijdstippen.Om te beginnen, transformeren 50 microliters van de ouder stam gebruikt voor mutagenese met een microliter van plasmide dat de wilde-type GFP of de wild-type PPG draagt. Plaat en uitbroeden de celculturen zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng de kolonies vervolgens individueel over naar vijf milliliter van het goed verdunde LB-medium.Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius met schudden bij 250 rpm. Voor fluorescentiemarkers, breng 200 microliters van de celculturen in een 96 goed duidelijke bodemrugplaat in drievoud op bepaalde tijdspunten over. Meet de OD600 in de fluorescentie en bereken de fluorescentieintensiteit.Voor chromogene markers, meet de kleurontwikkeling van de celculturen. Voer de voertest uit zoals eerder beschreven en meet de fluorescentieintensiteit of de kleurontwikkeling op bepaalde tijdstippen. Transformeer eerst 50 microliter van de gemuteerde cellen met één microliter van de plasmide die de selectiemarker KanR RC 29 draagt, of de screeningmarkers GFP RC of PPG RC. Vervolgens centrifugeren de celculturen op 4000 keer G gedurende vijf minuten.Gooi voor de selectie de supernatant weg en voeg vijf milliliter 0,2 x LB-medium toe met kanamycine aan cellen die de selectiemarkering dragen. Incubeer het monster 's nachts in een shaker op 37 graden Celsius. De volgende dag, plaat de nachtelijke cultuur op 0,2 x LB agar medium met kanamycine en incubbate op 37 graden Celsius voor 12 uur.Voor de screening, plaat het juiste aantal cellen die de screening marker op LB agar medium met het juiste antibioticum. Broed acht uur lang op 37 graden Celsius. Daarna inentuleer het LB-medium met het juiste antibioticum bij elke kolonie van de plaat.Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius tijdens het schudden bij 250 rpm. Meet de OD600 en de fluorescentie en bereken de fluorescentieintensiteit als GFP RC wordt gebruikt. Meet de kleurontwikkeling van de celculturen als PPG RC wordt gebruikt.Om de aminozuurproductiviteiten van de kandidaatstammen te verifiëren, bereidt u zaadkweek voor door vijf milliliter LB-medium te inenten met elk van de kandidaatstammen en laat u de cellen 's nachts groeien in een shaker bij 250 tpm en bij 37 graden Celsius. De volgende dag, oogst de cellen van een milliliter van de celcultuur door te centrifugeren op 4000 keer G gedurende twee minuten. Gooi het supernatant weg en verleg het palet met een milliliter steriel water.Inenting 20 milliliter M9 medium met vier procent glucose met 200 microliter van de cel suspensie en incubbate in een 250 milliliter shaker bij 250 rpm en bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag, centrifuge een milliliter van het cultuurmedium op 4000 keer G gedurende vijf minuten. Breng 200 microliter van de supernatant over in een schone buis van 1,5 milliliter.Bereid L-leucine standaardoplossingen voor op de hier getoonde concentraties. Voeg in een rookkap 100 microliter van één millimolar triethylamine en 100 microliter van één molaire fenylfenothiocyanaat toe aan zowel de supernatant als de normen. Meng de oplossingen voorzichtig en broed ze een uur lang op kamertemperatuur.Voeg vervolgens 400 microliters n-hexaan toe aan dezelfde buis en draaikolk gedurende tien seconden. De onderste fase bevat de aminozuurderivaten en wordt gebruikt voor HPLC-analyse. Filtreer de onderste fase door 0,2 microliter polytetrafluorethyleenmembranen.Voer hierna een microliter van het monster uit op een ultra HPLC die is uitgerust met een C18-kolom met een stroomsnelheid van 0,42 milliliter per minuut en bij kolomtemperatuur van 40 graden Celsius. Gebruik een diode array detector om de beoogde aminozuren te detecteren op 254 nanometer en hun concentraties te berekenen door het in kaart brengen van de piekgebieden onder de standaardcurve. In deze studie worden aminozuuroverproducenten geïdentificeerd met behulp van zeldzame codon-rijke markers om tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bereiken.Voor het selectiesysteem moet een scherpe afname van OD600 worden waargenomen voor stammen die het zeldzame codon-rijke antibioticaresistentiegen herbergen, in vergelijking met de stam die het wilde type herbergt. De remming van zeldzame codon op eiwituitdrukkingen vindt meestal plaats onder uitgehongerde omstandigheden. Na extra voeding van het overeenkomstige aminozuur neemt de OD600 voor de stam die het zeldzame codonrijke antibioticaresistentiegen herbergt aanzienlijk toe.Voor het screeningssysteem is de fluorescentieintensiteit in het aantal fluorescerende cellen aanzienlijk lager voor de stam die het fluorescerende eiwit uit het zeldzame codon-rijke gen uitdrukt dan van het wild-achtige gen. Het voeden van het overeenkomstige aminozuur zal eiwituitdrukkingen van de zeldzame codon-rijke genen herstellen. Bij het gebruik van het paarse eiwit, de kleur ontwikkeld uit de zeldzame codon-rijke PPG is lichter dan die van het wild-type gen.Het onverdunde LB-medium maakt langzame expressie van de zeldzame codon-rijke PPG mogelijk zonder L-leucine voeding in het uitgedrukte paarse eiwit wordt zichtbaar zodra de cellen worden gepeld. Dit verhult echter niet het feit dat genexpressie van de zeldzame codon-rijke PPG wordt versterkt door het voeden van de L-leucine. De zeldzame codon-gebaseerde strategie kan overproduceren van de beoogde aminozuren uit de mutatiebibliotheek identificeren en deze mutanten zouden hogere hoeveelheden van de beoogde aminozuren moeten produceren dan de ouderstammen.Bij een poging tot deze procedure is het belangrijk om zeldzame codonfrequentie aan te passen om een duidelijke discriminatie in de OD of kleur te bereiken tussen cellen die de wild-type markers en de zeldzame codon-rijke derivaten herbergen. Transcriptome analyse en de genoom sequencing kan worden toegepast op de geselecteerde stammen om het mechanisme in verband met aminozuur producties te onderzoeken. Met behulp van deze techniek kunnen aminozuuroverproducers efficiënt worden geïdentificeerd en zou de analyse van hun genetische informatie nieuwe inzichten bieden in hun mechanismen achter overproducties van aminozuur.Aminozuurafleiding kan schadelijk zijn. Zorg ervoor dat u handschoenen en de beschermende kleding te dragen en deze stappen uit te voeren in een rookkap.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse van een Ni-Schiff Base-complex onder omstandigheden geschikt voor het bewaren van zuur-labiele Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Schatting van het ligninegehalte van plantaardige biomassa met thioglycolzuur (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...