Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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Les travaux ont été soutenus conjointement par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 21676026), le National Key R-D Program of China (grant no 2017YFD0201400) et la China Postdoctoral Science Foundation (subvention no 2017M620643). Les travaux de l'UCLA Institute of Advancement (Suzhou) ont été soutenus par les subventions internes de la province du Jiangsu et du parc industriel de Suzhou.

1. Construction des plasmides exprimant les gènes marqueurs rares-codon-riches
<ol><li>Sélectionnez un gène marqueur qui contient un nombre approprié de codons communs pour l'acide aminé ciblé. REMARQUE: Pour l'élucine, le gène de résistance à la kanamycine kanR, qui contient 29 codons de leucine, dont 27 sont des codons communs, est utilisé pour la construction du système de sélection13. Le gène gfp, qui contient 17 codons communs sur 19 codons de l...

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Le nombre de codons rares dans les gènes marqueurs et le milieu de sélection ou de dépistage sont essentiels pour inhiber les expressions protéiques des gènes marqueurs modifiés par le codon rare. Si aucune différence significative ne peut être détectée entre les expressions protéiques des gènes marqueurs de type sauvage et leurs dérivés, l'augmentation du nombre de codons rares ou l'utilisation d'un milieu à teneur en nutriments peut amplifier les différences. Cependant, si l'effet d'inhibition est trop ...

La production actuelle d'acides aminés repose fortement sur la fermentation. Cependant, les titers et les rendements de la plupart des souches de production d'acides aminés sont inférieurs à la demande croissante du marché mondial des acides aminés qui vaut des milliards de dollars1,2. L'obtention de surproducteurs d'acides aminés de haute performance est essentielle à la mise à niveau de l'industrie des acides aminés.
La stratégie traditionnelle pour identifier les surproducteurs d'acides aminés exploite les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues dans la synthèse des protéines3,4. Ces analogues sont capables de charger les ARNt qui reconnaissent les acides aminés correspondants et inhibent ainsi les allongements des chaînes peptidiques, conduisant à la croissance arrêtée ou la mort cellulaire5. Une façon de résister aux contraintes analogiques est d'augmenter les concentrations d'acides aminés intracellulaires. Les acides aminés enrichis surpasseront les analogues pour les tARN finis et assureront la synthèse correcte des protéines fonctionnelles. Par conséquent, les souches qui survivent aux analogues peuvent être sélectionnées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés correspondants.
Bien qu'elle ait réussi à sélectionner des surproducteurs pour des acides aminés tels que l'alucine6, la stratégie analogique souffre de graves inconvénients. Une préoccupation majeure est la résistance analogique provenant du processus de mutagénèse ou par des mutations spontanées. Les souches avec résistance peuvent échapper à la sélection en bloquant, en exportant ou en dégradant les analogues5. Une autre préoccupation est les effets secondaires toxiques des analogues sur d'autres processus cellulaires7. En conséquence, les souches qui survivent à la sélection analogique peuvent ne pas être les surproducteurs d'acides aminés, tandis que les surproducteurs désirés pourraient être faussement exterminés en raison des effets secondaires négatifs.
Ici, une nouvelle stratégie basée sur la loi du biais de codon est présentée afin d'obtenir des identifications précises et rapides des surproducteurs d'acides aminés. La plupart des acides aminés sont codés par plus d'un triplet nucléotide qui est favorisé différemment par les organismes hôtes8,9. Certains codons sont rarement utilisés dans les séquences de codage et sont appelés les codons rares. Leurs traductions en acides aminés s'appuient sur les tARN cognate qui portent les acides aminés correspondants. Cependant, les ARTN qui reconnaissent les codons rares ont généralement des abondances beaucoup plus faibles que les ARNt des codons communs10,11. Par conséquent, ces ARN rares sont moins susceptibles de capturer les acides aminés libres dans les compétitions avec d'autres isoacceptateurs, et les traductions des séquences rares-codon-riches commencent à décélérer ou même sont terminées lorsque les quantités d'acides aminés sont limitées 10. Les traductions pourraient, théoriquement, être restaurées s'il y a un excédent d'acide aminé après avoir chargé les ARTN communes synonymes en raison de surproductions ou d'alimentations supplémentaires des acides aminés correspondants12. Si le gène rare-codon-riche code un marqueur de sélection ou de criblage, les souches présentant les phénotypes correspondants peuvent alors être facilement identifiées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés visés.
La stratégie ci-dessus est appliquée pour établir une sélection et un système de dépistage pour l'identification des surproducteurs d'acides aminés. Le système de sélection utilise des gènes de résistance aux antibiotiques (p. ex., kanR) comme marqueurs tandis que le système de dépistage utilise les gènes codant les protéines fluorescentes vertes (p. ex. protéines fluorescentes vertes [GFP]) ou chromogéniques (p. ex., PrancerPurple). Les gènes marqueurs dans les deux systèmes sont modifiés en remplaçant les nombres définis des codons communs pour l'acide aminé ciblé avec son alternative rare synonyme. Les souches de la bibliothèque de mutation qui abritent le gène marqueur rare-codon-riche sont sélectionnées ou examinées dans des conditions appropriées, et les surproducteurs des acides aminés ciblés peuvent être facilement identifiés. Le flux de travail commence par la construction du système génétique marqueur rare-codon-riche, suivi par l'optimisation des conditions de travail, puis l'identification et la vérification des surproducteurs d'acide aminé. Cette stratégie analogue-indépendante est basée sur le dogme dans la traduction de protéine et a été pratiquement vérifiée pour permettre l'identification précise et rapide des surproducteurs d'acide aminé. Théoriquement, il pourrait être directement utilisé pour les acides aminés avec des codons rares et à tous les micro-organismes. Dans l'ensemble, la stratégie basée sur le codon rare servira de solution de rechange efficace à l'approche analogique conventionnelle lorsque les analogues appropriés pour des acides aminés spécifiques ne sont pas disponibles, ou lorsqu'un taux de faux positifs élevé est la principale préoccupation. Le protocole ci-dessous utilise le codon rare de leucine pour démontrer cette stratégie en identifiant les surproducteurs de L-leucine d'Escherichia coli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Pour satisfaire le marché toujours croissant des acides aminés, des souches de production de haute performance sont nécessaires. Les surproducteurs d'acides aminés sont identifiés de façon conventionnelle en exploitant les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues. Cependant, cette méthode à base analogique est de faible précision, et les analogues appropriés pour les acides aminés spécifiques sont limités. Ici, nous présentons une stratégie alternative qui permet un criblage précis, sensible, et à haut débit des surproducteurs d'acide aminé utilisant des marqueurs rares-codon-riches. Cette stratégie s'inspire du phénomène du biais d'utilisation du codon dans la traduction des protéines, pour lequel les codons sont classés en codons communs ou rares en fonction de leurs fréquences d'occurrence dans l'ADN codant. La traduction des codons rares dépend de leur ARN de transfert rare correspondant (TRNAs), qui ne peuvent pas être entièrement chargés par les acides aminés cognés sous la famine. Théoriquement, les ARNt rares peuvent être facturés s'il y a un surplus des acides aminés après avoir chargé les isoaccepteurs communs synonymes. Par conséquent, les traductions retardées causées par des codons rares pourraient être restaurées par l'alimentation ou la surproduction intracellulaire des acides aminés correspondants. Selon cette hypothèse, un système de sélection ou de dépistage pour identifier les surproducteurs d'acides aminés est établi en remplaçant les codons communs des acides aminés ciblés par leurs alternatives rares synonymes dans les gènes de résistance aux antibiotiques ou les gènes codage des protéines fluorescentes ou chromogéniques. Nous montrons que les expressions protéiques peuvent être grandement entravées par l'incorporation de codons rares et que les niveaux de protéines sont en corrélation positive avec les concentrations d'acides aminés. Grâce à ce système, les surproducteurs d'acides aminés multiples peuvent être facilement éliminés des bibliothèques de mutation. Cette stratégie à base de codon rare ne nécessite qu'un seul gène modifié, et l'hôte est moins susceptible d'échapper à la sélection que dans d'autres méthodes. Il offre une approche alternative pour obtenir des surproducteurs d'acides aminés.

Pour le système de sélection, une forte diminution de l'OD600 pour les souches abritant le gène de résistance aux antibiotiques rare-codon-riche devrait être observée par rapport à la souche hébergeant le gène de résistance aux antibiotiques de type sauvage lorsqu'il est cultivé dans un approprié moyen (Figure 1a). Dans les mêmes conditions, la diminution de la cellule OD600 devient plus évidente à mesure que le nombre de ...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Cette étude présente une stratégie alternative à la méthode analogique toxique conventionnelle en identifiant les surproducteurs d'acides aminés en utilisant des marqueurs rares-codon-riches pour atteindre la précision, la sensibilité, et le haut débit simultanément.

Identifier les surproducteurs d'acides aminés à l'aide de marqueurs rares-codon-riches

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Cette méthode offre une alternative efficace à l’approche analogique conventionnelle dans l’obtention de surproducteurs d’acides aminés. Cette technique surcompétent la méthode analogique traditionnelle en fournissant la précision, la sensibilité et le débit élevé simultanément. Cette méthode jette un nouvel éclairage sur la compréhension des forces de surproduction d’acides aminés et la traduction de codons rares et pourrait, théoriquement, être appliquée à tous les micro-organismes.Ce protocole repose principalement sur des opérations expérimentales moléculaires de base faciles à suivre, mais qui peuvent nécessiter de multiples essais afin d’obtenir la sélection appropriée des cordes de contrainte. Une démonstration visuelle de cette technique offre une appréciation directe de la performance de la sélection et un système de dépistage dans l’identification des producteurs d’acides aminés. Pour commencer cette procédure, ajouter le vecteur dans les fragments marqueurs, sur la glace, dans un rapport molaire de un à un à sept points cinq microlitres de mélange d’assemblage à un volume total de dix microlitres.Incuber à 50 degrés Celsius pendant une heure. Transformez cinq microlitres du produit d’assemblage en 50 microlitres de cellules composants à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Récupérer les cellules dans le bouillon Super Optimal avec catabolite moyen de répression à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, plaquez-les sur LB Agar moyen et couvez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez un kit commercial préféré pour isoler le plasmide. Tout d’abord, transformer 50 microlitres des cellules compétentes avec un microlitre de plasmide qui porte le kanr de type sauvage.Transformez un deuxième ensemble des cellules compétentes avec le plasmide contenant KanR RC 29 avec tous les codons de leucine remplacés par le CTA codon rare. Plaquez et incubez la culture cellulaire tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Ensuite, transférez les colonies qui abritent le gène marqueur de sélection de type sauvage dans le dérivé rare riche en codon individuellement en cinq millilitres de milieu LB dilué quintuple contenant de la kanamycine à une concentration de 50 microgrammes par millilitre.Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Ensuite, transférez 200 microlitres de chacune des cultures cellulaires dans une plaque de puits de 96 en triplicate à des points de temps définis. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’OD600.Inoculer les taches abritant le gène marqueur KanR RC 29 en deux ensembles de cinq millilitres du milieu de 0,2 x LB qui contient de la kanamycine, avec ou sans approvisionnement en L-leucine. Ajouter la L-leucine à l’un des supports à une concentration finale d’un gramme par litre. Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm et mesurer l’OD600 pour chaque culture à des moments définis.Pour commencer, transformez 50 microlitres de la souche mère utilisée pour la mutagenèse avec un microlitre de plasmide qui transporte le GFP de type sauvage ou le PPG de type sauvage. Plaquez et incubez les cultures cellulaires telles qu’décrites dans le protocole textuel. Ensuite, transférez les colonies individuellement à cinq millilitres du milieu LB correctement dilué.Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 rpm. Pour les marqueurs de fluorescence, transférer 200 microlitres des cultures cellulaires dans une plaque arrière inférieure bien claire de 96 dans le triplicate à des points de temps définis. Mesurez l’OD600 dans la fluorescence et calculez l’intensité de fluorescence.Pour les marqueurs chromogènes, mesurer le développement des couleurs des cultures cellulaires. Effectuez l’analyse d’alimentation comme décrit précédemment et mesurez l’intensité de fluorescence ou le développement des couleurs à des points de temps définis. Tout d’abord, transformer 50 microlitres des cellules mutantes avec un microlitre du plasmide portant le marqueur de sélection KanR RC 29, ou les marqueurs de criblage GFP RC ou PPG RC. Ensuite, centrifuger les cultures cellulaires à 4000 fois G pendant cinq minutes.Pour la sélection, jetez le supernatant et ajoutez cinq millilitres de 0,2 x LB moyen contenant de la kanamycine aux cellules portant le marqueur de sélection. Incuber l’échantillon toute la nuit dans un shaker à 37 degrés Celsius. Le lendemain, plaquez la culture de nuit sur le milieu d’agar de 0,2 x LB contenant de la kanamycine et incubez à 37 degrés Celsius pendant 12 heures.Pour le dépistage, plaquez le nombre approprié de cellules abritant le marqueur de criblage sur le milieu de l’agar LB contenant l’antibiotique approprié. Incuber à 37 degrés Celsius pendant huit heures. Après cela, inoculer le milieu LB contenant l’antibiotique approprié avec chaque colonie unique de la plaque.Incuber les échantillons dans un shaker à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Mesurez l’OD600 et la fluorescence et calculez l’intensité de fluorescence si gfp RC est utilisé. Mesurer le développement des couleurs des cultures cellulaires si PPG RC est utilisé.Pour vérifier les produits aux acides aminés des souches candidats, préparez la culture des graines en inoculant cinq millilitres de lb moyen avec chacune des souches candidats et laissez les cellules se développer pendant la nuit dans un shaker à 250 rpm et à 37 degrés Celsius. Le lendemain, récoltez les cellules à partir d’un millilitre de la culture cellulaire en centrifugant à 4000 fois G pendant deux minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la palette avec un millilitre d’eau stérile.Inoculer 20 millilitres de M9 moyen contenant quatre pour cent de glucose avec 200 microlitres de la suspension cellulaire et incuber dans un shaker de 250 millilitres à 250 tours et à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, centrifugeuse d’un millilitre du milieu culturel à 4000 fois G pendant cinq minutes. Transférer 200 microlitres du supernatant dans un tube propre de 1,5 millilitre.Préparez des solutions standard L-leucine aux concentrations indiquées ici. Dans une hotte de fumée, ajouter 100 microlitres d’une triethylamine millimolaire et 100 microlitres d’un isothiocyanate de phényl molaire au supernatant et aux normes. Mélanger les solutions en douceur et les incuber à température ambiante pendant une heure.Ensuite, ajoutez 400 microlitres de n-hexane au même tube et vortex pendant dix secondes. La phase inférieure contient les dérivés d’acides aminés et est utilisée pour l’analyse HPLC. Filtrer la phase inférieure à travers les membranes de polytétrafluoroéthylène de 0,2 microlitre.Après cela, exécutez un microlitre de l’échantillon sur un ultra HPLC équipé d’une colonne C18 avec un débit de 0,42 millilitres par minute et à la température de la colonne pour 40 degrés Celsius. Utilisez un détecteur de réseau de diodes pour détecter les acides aminés ciblés à 254 nanomètres et calculer leurs concentrations en cartographiant les zones de pointe sous la courbe standard. Dans cette étude, les surproducteurs d’acides aminés sont identifiés en utilisant des marqueurs rares riches en codon pour atteindre simultanément la précision, la sensibilité et le haut débit.Pour le système de sélection, une forte diminution de l’OD600 pour les souches abritant le gène rare de résistance aux antibiotiques riche en codon doit être observée par rapport à la souche abritant le type sauvage. L’inhibition du codon rare sur les expressions protéiques se fait principalement dans des conditions de faim. Après l’alimentation supplémentaire de l’acide aminé correspondant, l’OD600 pour la souche abritant le gène rare de résistance aux antibiotiques codon-riche augmente de manière significative.Pour le système de criblage, l’intensité de fluorescence dans le nombre de cellules fluorescentes est sensiblement inférieure pour la souche qui exprime la protéine fluorescente du gène codon-riche rare que du gène sauvage-type. L’alimentation de l’acide aminé correspondant restaurera les expressions protéiques des rares gènes riches en codon. Lors de l’utilisation de la protéine pourpre, la couleur développée à partir du PPG rare riche en codon est plus léger que celui du gène de type sauvage.Le milieu LB non dilué permet l’expression lente du PPG rare codon-riche sans alimentation de L-leucine dans la protéine pourpre exprimée devient visible une fois que les cellules sont granulées. Cependant, ceci ne cache pas le fait que l’expression de gène du PPG codon-riche rare est augmentée par l’alimentation de la L-leucine. La stratégie rare basée sur le codon pourrait identifier les surproducteurs des acides aminés ciblés de la bibliothèque de mutation et ces mutants devraient produire des quantités plus élevées des acides aminés ciblés que les souches parentes.Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’ajuster la fréquence rare codon pour atteindre une discrimination claire dans l’OD ou la couleur entre les cellules hébergeant les marqueurs de type sauvage et les dérivés rares codon riche. L’analyse transcriptome et le séquençage du génome pourraient être appliqués aux souches sélectionnées pour étudier le mécanisme lié aux productions d’acides aminés. En utilisant cette technique, les surproducteurs d’acides aminés pourraient être identifiés efficacement et l’analyse de leurs informations génétiques offrirait de nouvelles perspectives sur leurs mécanismes derrière les surproductions d’acides aminés.La dérivation des acides aminés pourrait être nocive. Assurez-vous de porter des gants et des vêtements de protection et d’effectuer ces étapes dans une hotte de fumée.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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