Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

העבודה היתה נתמכת במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט no. 21676026), המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין (להעניק no. 2017YFD0201400), ואת הקרן פוסט דוקטורט בסין (להעניק no. 2017M620643). עבודות במכון לקידום באוניברסיטת UCLA (סאזהאו) תמכו על ידי מענקים פנימיים מפרובינצית ג'יאנגסו ופארק התעשייה סאזהאו.

1. הקמת הפלמידים המבטאים את הגנים הנדירים של הסמן
<ol><li>בחרו גן סימון המכיל מספר מתאים של הקודונים המשותפים לחומצת האמינו הממוקדת. הערה: עבור L-לאוצין, הקנאמיצין התנגדות גן , אשר מכיל 29 לוקיונים, שמהם 27 הם משמשים משותפים, משמש לבניית מערכת הבחירה13. הגן gfp , אשר מכי...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

מספר המקורות הנדירים בגנים הסמן והבחירה או הסינון הם קריטיים לעכב את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים של הסמן השונה-codons. אם לא ניתן לזהות הבדל משמעותי בין ביטויי חלבון מן הגנים סמן פראי ונגזרות שלהם, הגדלת מספר החומרים הנדירים או שימוש במדיום מוגבלת מזינים עשוי להגביר את ההבדלים. עם זאת, אם אפ?...

הייצור הנוכחי של חומצות אמינו מסתמך בכבדות על תסיסה. עם זאת, מגדל ותשואות עבור רוב חומצות אמינו זנים הייצור הם מתחת הדרישות העולות של שוק חומצות אמינו גלובלי כי הוא שווה מיליארדי דולרים1,2. קבלת ביצועים גבוהים חומצת אמינו מפיקי הם קריטיים לשדרוג תעשיית חומצת האמינו.
אסטרטגיה מסורתית לזיהוי מפיקי חומצת אמינו מנצלת את התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם בסינתזה החלבונים3,4. אנלוגיות אלה מסוגלים לחייב את tRNAs כי להכיר את חומצות אמינו המקביל ובכך לעכב את elongations של רשתות פפטיד, המוביל הצמיחה נעצר או מוות התאים5. דרך אחת להתנגד הלחצים האנלוגיים היא להגביר את ריכוזי חומצות אמינו תאיים. חומצות האמינו המועשרת יתחרו את האנלוגיות עבור tRNAs הסופיים ויבטיחו את הסינתזה הנכונה של חלבונים פונקציונליים. לכן, זנים השורדים את האנלוגיות ניתן לבחור ונוטים להיות מפיקי היתר של חומצות האמינו המתאימות.
למרות שהוא הצליח להצליח בבחירת יצרני מיתר עבור חומצות אמינו כגון L-leucine6, האסטרטגיה מבוסס אנלוגי סובל מחסרונות חמורים. דאגה אחת גדולה היא ההתנגדות האנלוגית מקורו בתהליך של מוטגנזה או באמצעות מוטציות ספונטניות. זנים עם התנגדות יכול להימלט מהבחירה על ידי חסימת, ייצוא, או משפיל את האנלוגיות5. דאגה נוספת היא תופעות הלוואי הרעילות של האנלוגיות על תהליכים סלולריים אחרים7. כתוצאה מכך, זנים השורדים את הבחירה האנלוגית לא יכול להיות חומצות אמינו overproducers, בעוד מפיקי יתר הרצוי יכול להיות מושמד בטעות בשל תופעות לוואי שליליות.
כאן, אסטרטגיה הרומן המבוססת על החוק של קודון הטיה מוצגת על מנת להשיג זהויות מדויקות ומהירה של מפיקים יתר של חומצות אמינו. חומצות אמינו רוב מקודדים על ידי יותר מאשר שלישיה נוקלאוטיד אחד כי הוא המועדף באופן שונה על ידי אורגניזמים המארחים8,9. מספר משתמשים מסוימים משמשים לעתים רחוקות ברצפי הקידוד ומכונים הקודונים נדירים. התרגומים שלהם לתוך חומצות אמינו מסתמכים על trnas קנצוני לשאת את חומצות האמינו המתאימות. עם זאת, tRNAs המכירים בקודונים נדירים יש בדרך כלל הרבה יותר מחולות מאשר tRNAs של הקודונים המשותפים10,11. כתוצאה מכך, tRNAs נדירים אלה פחות סביר ללכוד את חומצות האמינו חינם בתחרויות עם איזוזמינים אחרים, ותרגומים של הרצפים נדיר-codon-עשיר מתחילים להאט או אפילו מסתיימים כאשר כמויות של חומצות אמינו מוגבלות 10. התרגומים יכולים, תיאורטית, להיות משוחזר אם יש עודף חומצת אמינו לאחר הטענת tRNAs משותף נרדף בשל הפקות יתר או ההאכלה נוספת של חומצות אמינו המקביל12. אם הגנטי נדיר-codon-עשיר מקודד בחירה או סמן ההקרנה, זנים המציגות פנוטיפים המתאימים יכול להיות מזוהה בקלות וכנראה המפיקים יתר של חומצות אמינו ממוקדות.
האסטרטגיה הנ ל מיושמת על מנת ליצור מבחר ומערכת הקרנה לזיהוי מפיקי יתר של חומצות אמינו. מערכת הבחירה משתמשת גנים עמידות לאנטיביוטיקה (g., KanR) כמו סמנים בעוד מערכת ההקרנה משתמשת הגנים הקידוד פלורסנט (למשל, חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) או כרומוגניים (למשל, פראנצרסגול) חלבונים. הגנים סמן בשתי המערכות משתנים על ידי החלפת מספרים מוגדרים של הקודונים המשותפים עבור חומצת האמינו הממוקדת עם חלופה נדירה נרדפת. זנים בספריית מוטציה כי הנמל הגן נדיר-codon-עשיר סמן בחרו או הוקרן בתנאים הנכונים, ואת מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות ניתן לזהות בקלות. זרימת העבודה מתחילה עם בניית מערכת גנטית נדיר codon-עשיר סמן, ואחריו אופטימיזציה של תנאי עבודה, ולאחר מכן זיהוי ואימות של חומצות אמינו מפיקים יתר. זו אסטרטגיה בלתי תלויה אנלוגי מבוסס על הדוגמה בתרגום חלבונים ומאומת למעשה כדי לאפשר זהויות מדויקות ומהירה של מפיקי חומצות אמינו. תיאורטית, זה יכול להיות מועסק ישירות עם חומצות אמינו עם מיקרודונים נדירים ועל כל המיקרואורגניזמים. בסך הכל, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס ישמש חלופה יעילה לגישה המקובלת מבוססי אנלוגי כאשר אנלוגי הנכון עבור חומצות אמינו ספציפיות אינן זמינות, או כאשר שיעור חיובי שווא גבוה הוא הדאגה העיקרית. הפרוטוקול שלהלן משתמש לאוצין נדיר קודון להפגין את האסטרטגיה הזאת בזיהוי es, coli קולי L-לאוצין מפיקי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

כדי לספק את השוק הצומח אי פעם עבור חומצות אמינו, זנים הייצור ביצועים גבוהים נחוצים. חומצות אמינו מפיקים מאוד מזוהים על ידי רתימת התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם. עם זאת, שיטה מבוססת-אנלוגי זו היא בדיוק נמוכה, והאנלוגי המתאים לחומצות אמינו ספציפיות מוגבל. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה חלופית המאפשרת הקרנת מדויק, רגיש, תפוקה גבוהה של יצרני מיתר חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-העשירים. אסטרטגיה זו היא בהשראת התופעה של הטיית השימוש של קודון בתרגום חלבונים, אשר מסווגים ביניהם לבין הנפוצים או נדירים מבוסס על התדרים שלהם של התרחשות ה-DNA קידוד. התרגום של מגנטים נדירים תלוי ב-rnas המקביל (trnas) נדיר שלהם, אשר לא ניתן לטעון במלואה על ידי חומצות אמינו קנצוני מתחת לרעב. באופן תיאורטי, tRNAs נדיר יכול להיות מחויב אם יש עודף של חומצות אמינו לאחר הטעינה של איזומקובלים משותפים נרדף. לכן, תרגומים מפגרים הנגרמים על ידי הקודונים נדירים יכולים להיות משוחזרים על ידי האכלה או הפקות יתר של חומצות האמינו המתאימות. תחת הנחה זו, מערכת בחירה או סינון לזיהוי מפיקי חומצות אמינו מוקמת על ידי החלפת הפחם המשותף של חומצות אמינו ממוקדות עם חלופות נדירות שלהם נרדף גנים עמידות לאנטיביוטיקה או את הגנים הצפנה או חלבונים כרומוגניים. אנו מראים כי ביטויי החלבון יכולים להיות מאוד מפריע בשילוב של הידרודונים נדירים וכי רמות החלבונים לתאם באופן חיובי עם ריכוזי חומצת אמינו. באמצעות מערכת זו, יצרני יתר של חומצות אמינו מרובות יכול להיות מוקרן בקלות מספריות מוטציה. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על המחשב מחייבת רק גן אחד שהשתנה, והמארח פחות סביר להימלט מהבחירה מאשר בשיטות אחרות. הוא מציע גישה חלופית להשגת מפיקי יתר של חומצות אמינו.

עבור מערכת הבחירה, ירידה חדה ב-OD600 עבור זנים מעניקה נדיר-codon-עשיר עמידות לאנטיביוטיקה הגן צריך להיות נצפתה בהשוואה למתח מחסה את הגן מסוג פראי התנגדות לאנטיביוטיקה כאשר תרבותי בצורה מתאימה בינונית (איור 1a). תחת אותם התנאים, הירידה בתא OD600 הופך לה?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

שיטה זו מספקת חלופה יעילה לגישה האנלוגית הקונבנציונלית בהשגת יתר של חומצות אמינו. טכניקה זו עולה על השיטה המסורתית המבוססת על אנלוגיה על-ידי מתן דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו-זמנית. שיטה זו שופכת אור חדש על הבנת חוזקות ייצור יתר של חומצות אמינו ותרגום של קודונים נדירים, תיאורטית, יכול להיות מיושם על כל מיקרואורגניזמים.פרוטוקול זה מסתמך בעיקר על פעולות ניסיוניות מולקולריות בסיסיות שקל לעקוב אחריהן, אך עשויות לדרוש ניסויים מרובים על מנת להשיג את הבחירה המתאימה של מחרוזות מאמץ. הדגמה חזותית של טכניקה זו מציעה הערכה ישירה על הביצועים של הבחירה מערכת הקרנה בזיהוי יצרני חומצות אמינו. כדי להתחיל בהליך זה, מוסיפים את הווקטור שברי הסמן, על הקרח, ביחס טוחנת של אחד עד שבע נקודות חמישה מיקרוליטרים של תערובת הרכבה לנפח כולל של עשרה מיקרוליטרים.דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הפוך חמישה מיקרוליטרים של מוצר ההרכבה ל-50 מיקרוליטרים של תאי רכיבים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לשחזר את התאים במרק סופר אופטימלי עם מדיום דיכוי קטבוליט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, צלחת אותם על LB אגר בינוני דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בערכה מסחרית מועדפת כדי לבודד את הפלסמיד. ראשית, להפוך 50 microliters של התאים המוסמכים עם מיקרוליטר אחד של פלסמיד שנושא את קאנר מסוג פראי.להפוך קבוצה שנייה של תאים מוכשרים עם פלסמיד המכיל KanR RC 29 עם כל קודונים לאוצין הוחלף על ידי CTA קודון נדיר. לוח ודגירה של תרבות התא כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות כי מחסה גן סמן הבחירה מסוג פראי הנגזרת נדירה-קודון עשיר בנפרד לתוך חמישה מיליליטר של חמש פעמים מדולל LB בינוני המכיל kanamycin בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר.הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל אחת מתרבות התא לתוך צלחת 96 גם ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את OD600.לחסן את הכתמים מחסה הגן סמן KanR RC 29 בשתי קבוצות של חמישה מיליליטר של 0.2 x LB בינוני המכיל kanamycin, עם או בלי אספקה של L-לאוצין. הוסף L-לאוצין לאחד המדיה לריכוז סופי של גרם אחד לליטר. הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד ולמדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות.כדי להתחיל, להפוך 50 microliters של זן האב המשמש mutagenesis עם microliter אחד של פלסמיד שנושאת GFP מסוג פראי או PPG מסוג פראי. לוח ודגירה של תרבות התאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות בנפרד לחמישה מיליליטר של מדיום LB מדולל כראוי.דגירה הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 250 סל"ד. עבור סמני פלואורסצנטיות, להעביר 200 microliters של תרבות התא לתוך 96 צלחת אחורית תחתונה ברורה היטב ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. למדוד את OD600 ב פלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות.עבור סמנים כרומוגניים, למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא. בצע את בדיקת ההזנה כפי שתואר בעבר ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות. ראשית, להפוך 50 microliters של תאים מוטנטים עם microliter אחד של פלסמיד נושאת את סמן הבחירה KanR RC 29, או סמני ההקרנה GFP RC או PPG RC. לאחר מכן, צנטריפוגה תרבות התא ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות.לבחירה, השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של מדיום 0.2 x LB המכיל קנאמיצין לתאים הנושאים את סמן הבחירה. דגירה המדגם לילה בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, צלחת תרבות הלילה על 0.2 x LB אגר בינוני המכיל קאנאמיצין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.להקרנה, צלחת המספר המתאים של תאים מחסה סמן ההקרנה על מדיום אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות. לאחר מכן, לחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה עם כל מושבה אחת מהצלחת.הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. למדוד את OD600 ואת הפלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות אם GFP RC משמש. למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא אם PPG RC משמש.כדי לאמת את המוצריות של חומצות האמינו של הזנים המועמדים, הכינו את תרבות הזרעים על ידי חיסון חמישה מיליליטר של מדיום LB עם כל אחד מהזנים המועמדים ותנו לתאים לגדול בן לילה בשייקר ב-250 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, לקצור את התאים ממיליליטר אחד של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4000 פעמים G במשך שתי דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הצבעים במיליליטר אחד של מים סטריליים.לחסן 20 מיליליטר של M9 בינוני המכיל ארבעה אחוז גלוקוז עם 200 microliters של ההשעיה התא דגירה בשייקר 250 מיליליטר ב 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של מדיום התרבות ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של העל-טבעי לצינור נקי של 1.5 מיליליטר.הכן פתרונות סטנדרטיים L-לאוצין בריכוזים המוצגים כאן. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של טריאתילאמין מילימולארי אחד ו-100 מיקרוליטרים של פניל דיסותיוצ'ינאט טוחן אחד הן לעל-טבעי והן לסטנדרטים. מערבבים את הפתרונות בעדינות ומדרגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של n-hexane לאותו צינור ומערבולת זה במשך עשר שניות. השלב התחתון מכיל את נגזרות חומצות האמינו והוא משמש לניתוח HPLC. סנן את השלב התחתון באמצעות 0.2 ממברנות פוליטרא-פוליאואורואתילן מיקרוליטר.לאחר מכן, הפעל מיקרוליטר אחד של המדגם על HPLC אולטרה מצויד בעמודה C18 עם קצב זרימה של 0.42 מיליליטר לדקה ו בטמפרטורת עמודה של 40 מעלות צלזיוס. השתמש בגלאי מערך דיודה כדי לזהות את חומצות האמינו הממוקדות ב-254 ננומטר ולחשב את הריכוזים שלהן על ידי מיפוי אזורי השיא מתחת לעקומה הסטנדרטית. במחקר זה, חומצות אמינו overproducers מזוהים באמצעות סמנים נדירים עשירים codon כדי להשיג בו זמנית דיוק, רגישות, ותפוקה גבוהה.עבור מערכת הבחירה, יש לראות ירידה חדה ב- OD600 עבור זנים המטפחים את גן עמידות לאנטיביוטיקה נדיר עשיר בקודון בהשוואה לזן המטפח את סוג הבר. העיכוב של קודון נדיר על ביטויי חלבון מתרחש בעיקר בתנאים מורעבים. לאחר האכלה נוספת של חומצת האמינו המתאימה, OD600 עבור המתח מחסה את הגן נדיר codon עשיר עמידות לאנטיביוטיקה עולה באופן משמעותי.עבור מערכת ההקרנה, עוצמת הפלואורסצנטיות במספר התאים הפלואורסצנטיים נמוכה משמעותית עבור הזן המבטא את החלבון הפלואורסצנטי מהגן הנדיר העשיר בקודון מאשר מהגן הפראי. האכלה של חומצת האמינו המתאימה תחזיר ביטויי חלבון מהגנים הנדירים העשירים בקודון. בעת שימוש בחלבון הסגול, הצבע שפותח מה-PPG הנדיר העשיר בקודון קל יותר מזה של הגן הפראי.מדיום LB לא מזוהה מאפשר ביטוי איטי של PPG נדיר עשיר codon ללא L-לאוצין האכלה בחלבון הסגול לידי ביטוי הופך גלוי פעם התאים הם גלולה. עם זאת, זה לא מסתיר את העובדה כי ביטוי גנים מן PPG נדיר עשיר codon משופרת על ידי האכלה של L-לאוצין. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על קודון יכולה לזהות את מייצרי יתר של חומצות האמינו הממוקדות מספריית המוטציות, ומוטנטים אלה צריכים לייצר כמויות גבוהות יותר של חומצות האמינו הממוקדות מאשר זני האב.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להתאים תדירות קודון נדירה כדי להשיג אפליה ברורה ב- OD או בצבע בין תאים המכילים את סמני סוג הבר והנגזרות הנדירות העשירות בקודון. ניתוח Transcriptome ואת רצף הגנום יכול להיות מיושם על הזנים שנבחרו כדי לחקור את המנגנון הקשורים לייצור חומצות אמינו. באמצעות טכניקה זו, חומצות אמינו overproducers יכול להיות מזוהה ביעילות וניתוח של המידע הגנטי שלהם יציע תובנות חדשות לתוך המנגנונים שלהם מאחורי חומצות אמינו overproductions.נגזרת חומצות אמינו עלולה להזיק. הקפידו ללבוש כפפות ובגדי מגן ולבצע את השלבים הבאים ברדס אדים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...