Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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काम संयुक्त रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था (नहीं. 21676026), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2017YFD0201400), और चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन (नहीं. 2017M620643). UCLA उन्नति संस्थान (Suzhou) में काम करता है Jiangsu प्रांत और सूज़ौ औद्योगिक पार्क से आंतरिक अनुदान द्वारा समर्थित थे.

1. दुर्लभ-कोडोन समृद्ध मार्कर जीनों को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड का निर्माण
<ol><li>एक मार्कर जीन है कि लक्षित एमिनो एसिड के लिए आम codons की एक उचित संख्या में शामिल का चयन करें. नोट: एल-ल्यूसिन के लिए, कानामाइ?...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. 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मार्कर जीन और चयन या स्क्रीनिंग माध्यम में दुर्लभ codons की संख्या दुर्लभ codon संशोधित मार्कर जीन से प्रोटीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. यदि कोई महत्वपूर्ण अंतर जंगली प्रकार मार्कर जीन ?...

एमिनो एसिड की वर्तमान उत्पादन किण्वन पर काफी निर्भर करता है. हालांकि, सबसे एमिनो एसिड उत्पादन उपभेदों के लिए titers और पैदावार वैश्विक एमिनो एसिड बाजार है कि अरबों डॉलर1,2के लायक है की बढ़ती मांग से नीचे हैं. उच्च प्रदर्शन एमिनो एसिड overproducers प्राप्त एमिनो एसिड उद्योग के उन्नयन के लिए महत्वपूर्ण हैं.
एमिनो एसिड ओवरप्रोड्यूसर की पहचान करने की पारंपरिक रणनीति एमिनो एसिड और प्रोटीन संश्लेषण3,4में उनके एनालॉग के बीच की प्रतियोगिताओं का फायदा उठाती है . इन एनालॉग tRNAs कि इसी अमीनो एसिड पहचान और इस तरह पेप्टाइड चेन की दीर्घों को बाधित चार्ज करने में सक्षम हैं, गिरफ्तार विकास या सेल मौत5के लिए अग्रणी . एनालॉग तनाव का विरोध करने के लिए एक तरीका intracellular एमिनो एसिड की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए है. समृद्ध एमिनो एसिड सीमित tRNAs के लिए एनालॉग बाहर प्रतिस्पर्धा और कार्यात्मक प्रोटीन का सही संश्लेषण सुनिश्चित करेगा. इसलिए, उपभेदों कि एनालॉग जीवित चयनित किया जा सकता है और संभावना इसी अमीनो एसिड के overproducers हैं.
हालांकि इस तरह के एल-ल्यूसिन6के रूप में एमिनो एसिड के लिए overproducers के चयन में सफल साबित कर दिया, अनुरूप आधारित रणनीति गंभीर कमियों से ग्रस्त है. एक प्रमुख चिंता का विषय अनुरूप प्रतिरोध mutagenesis की प्रक्रिया से या सहज उत्परिवर्तनों के माध्यम से उत्पन्न है. प्रतिरोध के साथ तनाव अवरुद्ध, निर्यात, या एनालॉग5अपमानजनक द्वारा चयन से बच सकते हैं। एक अन्य चिंता का विषय अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं7पर एनालॉग के विषाक्त दुष्प्रभाव है. एक परिणाम के रूप में, उपभेदों कि एनालॉग चयन जीवित अमीनो एसिड overproducers नहीं हो सकता है, जबकि वांछित overproducers झूठा नकारात्मक पक्ष प्रभाव के कारण समाप्त किया जा सकता है.
यहाँ, codon पूर्वाग्रह के कानून पर आधारित एक उपन्यास रणनीति के क्रम में एमिनो एसिड overproducers की सही और तेजी से पहचान प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया है. अधिकांश अमीनो अम्लों को एक से अधिक न्यूक्लिओटाइड त्रिक द्वारा एनकोडेड किया जाता है जो मेजबान जीवों8,9द्वारा अलग ढंग से अनुकूल होता है . कुछ codons शायद ही कभी कोडन दृश्यों में उपयोग किया जाता है और दुर्लभ codons के रूप में जाना जाता है. एमिनो एसिड में उनके अनुवाद cognate tRNAs कि इसी अमीनो एसिड ले पर भरोसा करते हैं. हालांकि, tRNAs कि दुर्लभ codons पहचान आम तौर पर आम codons10,11के tRNAs की तुलना में बहुत कम बहुतायत है. नतीजतन, इन दुर्लभ tRNAs कम अन्य isoacceptors के साथ प्रतियोगिताओं में मुक्त एमिनो एसिड पर कब्जा करने की संभावना है, और दुर्लभ codon अमीर दृश्यों के अनुवाद में कमी या यहां तक कि समाप्त कर रहे हैं जब एमिनो एसिड की मात्रा सीमित हैं शुरू 10. अनुवाद, सैद्धांतिक रूप से बहाल किया जा सकता है अगर वहाँ एक एमिनो एसिड अधिशेष है के बाद पर्याय आम tRNAs चार्ज करने के बाद overproductions या इसी एमिनो एसिड12के अतिरिक्त feedings . यदि दुर्लभ-कोडोन समृद्ध जीन एक चयन या स्क्रीनिंग मार्कर encodes, इसी phenotypes का प्रदर्शन उपभेदों तो आसानी से पहचान की जा सकती है और संभावना लक्षित एमिनो एसिड के overproducers हैं.
उपरोक्त रणनीति एक चयन और एमिनो एसिड overproducers की पहचान के लिए एक स्क्रीनिंग प्रणाली स्थापित करने के लिए लागू किया जाता है. चयन प्रणाली एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (जैसे, केएनआर) मार्कर के रूप में उपयोग करता है, जबकि स्क्रीनिंग सिस्टम फ्लोरोसेंट एन्कोडिंग जीन का उपयोग करता है (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]) या क्रोमोजेनिक (जैसे, PrancerPurple) प्रोटीन। दोनों प्रणालियों में मार्कर जीन अपने पर्यायन दुर्लभ विकल्प के साथ लक्षित एमिनो एसिड के लिए आम codons की परिभाषित संख्या की जगह द्वारा संशोधित कर रहे हैं. उत्परिवर्तन पुस्तकालय है कि दुर्लभ codon अमीर मार्कर जीन बंदरगाह में तनाव का चयन कर रहे हैं या उचित परिस्थितियों में जांच की, और लक्षित एमिनो एसिड के overproducers आसानी से पहचान की जा सकती है. कार्यप्रवाह दुर्लभ-कोडोन समृद्ध मार्कर जीन प्रणाली के निर्माण के साथ शुरू होता है, जिसके बाद काम की स्थिति के अनुकूलन, और फिर एमिनो एसिड overproducers की पहचान और सत्यापन. इस अनुरूप स्वतंत्र रणनीति प्रोटीन अनुवाद में हठधर्मिता पर आधारित है और व्यावहारिक रूप से एमिनो एसिड overproducers की सटीक और तेजी से पहचान सक्षम करने के लिए सत्यापित किया गया है. सैद्धांतिक रूप से, यह सीधे दुर्लभ codons के साथ और सभी सूक्ष्मजीवों के लिए एमिनो एसिड के लिए नियोजित किया जा सकता है. सभी में, दुर्लभ codon आधारित रणनीति पारंपरिक अनुरूप आधारित दृष्टिकोण के लिए एक कुशल विकल्प के रूप में काम करेंगे जब विशिष्ट एमिनो एसिड के लिए उचित एनालॉग उपलब्ध नहीं हैं, या जब एक उच्च झूठी सकारात्मक दर प्रमुख चिंता का विषय है. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में ल्यूकोइन दुर्लभ कोडोन का उपयोग करता है ताकि Escherichia कोलाई एल-ल्यूसिन ओवरप्रोड्यूसर की पहचान करने में इस रणनीति को प्रदर्शित किया जा सके।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

एमिनो एसिड के लिए बढ़ती बाजार को संतुष्ट करने के लिए, उच्च प्रदर्शन उत्पादन उपभेदों की जरूरत है. एमिनो एसिड overproducers पारंपरिक एमिनो एसिड और उनके एनालॉग के बीच प्रतियोगिताओं का दोहन द्वारा पहचान कर रहे हैं. हालांकि, इस एनालॉग आधारित विधि कम सटीकता की है, और विशिष्ट अमीनो एसिड के लिए उचित एनालॉग सीमित हैं. यहाँ, हम एक वैकल्पिक रणनीति है कि दुर्लभ codon अमीर मार्करों का उपयोग एमिनो एसिड overproducers के एक सटीक, संवेदनशील, और उच्च throughput स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है प्रस्तुत करते हैं. इस रणनीति प्रोटीन अनुवाद में codon उपयोग पूर्वाग्रह की घटना से प्रेरित है, जिसके लिए codons कोडिंग डीएनए में घटना की उनकी आवृत्तियों के आधार पर आम या दुर्लभ लोगों में वर्गीकृत कर रहे हैं. दुर्लभ codons का अनुवाद उनके इसी दुर्लभ हस्तांतरण RNAs (tRNAs), जो पूरी तरह से भुखमरी के तहत cognate अमीनो एसिड द्वारा चार्ज नहीं किया जा सकता पर निर्भर करता है. सैद्धांतिक रूप से, दुर्लभ tRNAs चार्ज किया जा सकता है अगर वहाँ पर्याय आम समग्राही चार्ज करने के बाद एमिनो एसिड का अधिशेष है. इसलिए, दुर्लभ codons की वजह से मंद अनुवाद खिला या इसी एमिनो एसिड के intracellular overproductions द्वारा बहाल किया जा सकता है. इस धारणा के तहत, एमिनो एसिड overproducers की पहचान करने के लिए एक चयन या स्क्रीनिंग प्रणाली एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन या जीन में अपने पर्याय का दुर्लभ विकल्प के साथ लक्षित एमिनो एसिड के आम codons की जगह द्वारा स्थापित किया गया है एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट या क्रोमोजेनिक प्रोटीन. हम बताते हैं कि प्रोटीन अभिव्यक्ति बहुत दुर्लभ codons के समावेश द्वारा बाधित किया जा सकता है और प्रोटीन के स्तर एमिनो एसिड सांद्रता के साथ सकारात्मक सहसंबंधित. इस प्रणाली का उपयोग करना, कई एमिनो एसिड के overproducers आसानी से उत्परिवर्तन पुस्तकालयों से बाहर जांच की जा सकती है. इस दुर्लभ-कोडोन आधारित रणनीति केवल एक संशोधित जीन की आवश्यकता है, और मेजबान कम अन्य तरीकों की तुलना में चयन से बचने की संभावना है. यह एमिनो एसिड overproducers प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

चयन प्रणाली के लिए, दुर्लभ codon अमीर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन शरण उपभेदों के लिए OD600 में एक तेज कमी जंगली प्रकार एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन शरण तनाव की तुलना में मनाया जाना चाहिए जब एक उपयु?...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

इस अध्ययन के दुर्लभ codon अमीर मार्करों का उपयोग करके एमिनो एसिड overproducers की पहचान करने में पारंपरिक विषाक्त अनुरूप आधारित विधि के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रस्तुत करता है सटीकता को प्राप्त करने के लिए, संवेदनशीलता, और उच्च throughput एक साथ.

दुर्लभ-कोडोन-रिच मार्करों का उपयोग कर एमिनो एसिड ओवरप्रोड्यूसर की पहचान करना

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Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

संभावित एपिजेनेटिक मार्कर के टॉप डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार लीफ टिश्यू से हिस्टोन का अलगाव

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

फैटी Acylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए Alkynyl फैटी एसिड Analogs के अनुकूलित निगमन क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...