Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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Il lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (n. 21676026), dal National Key R&D Program of China (grant n. 2017YFD0201400) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2017M620643). I lavori dell'UCLA Institute of Advancement (Suzhou) sono stati sostenuti dalle sovvenzioni interne della provincia di Jiangsu e del Parco Industriale di Suzhou.

1. Costruzione dei plasmidi che esprimono i geni marcatori rari-codoni-ricchi
<ol><li>Selezionare un gene marcatore contenente un numero appropriato di codoni comuni per l'amminoacido mirato. NOTA: Per L-leucine, il gene di resistenza alla kanamicina kanR, che contiene 29 codoni di leucina, di cui 27 sono codoni comuni, viene utilizzato per la costruzione del sistema di selezione13. Il gene gfp, che contiene 17 codoni comuni su 19 codoni leule, o il gene di codifi...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Il numero di codoni rari nei geni marcatori e nel mezzo di selezione o screening è fondamentale per inibire le espressioni proteiche dai geni marcatori raramente-modificato codoni. Se non è possibile rilevare alcuna differenza significativa tra le espressioni proteiche dei geni marcatori di tipo selvatico e i loro derivati, l'aumento del numero di codoni rari o l'utilizzo di un mezzo limitato dai nutrienti può amplificare le differenze. Tuttavia, se l'effetto di inibizione è troppo forte, le espressioni proteiche non...

L'attuale produzione di amminoacidi dipende fortemente dalla fermentazione. Tuttavia, i titoli e le rese per la maggior parte dei ceppi di produzione di amminoacidi sono al di sotto delle crescenti richieste del mercato globale degli amminoacidi che vale miliardi di dollari1,2. Ottenere prodotti aminoacidi ad alte prestazioni sono fondamentali per l'aggiornamento dell'industria degli amminoacidi.
La strategia tradizionale per identificare i sovraproduttori di amminoacidi sfrutta i concorsi tra aminoacidi e i loro analoghi nella sintesi proteica3,4. Questi analoghi sono in grado di caricare i tRNA che riconoscono gli aminoacidi corrispondenti e quindi inibiscono gli allungamenti delle catene di peptidi, portando alla crescita arrestata o alla morte cellulare5. Un modo per resistere alle sollecitazioni analogiche è quello di aumentare le concentrazioni di aminoacidi intracellulari. Gli amminoacidi arricchiti supereranno gli analoghi per i tRNA finiti e garantiranno la corretta sintesi delle proteine funzionali. Pertanto, i ceppi che sopravvivono agli analoghi possono essere selezionati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi corrispondenti.
Sebbene si sia dimostrata efficace nella selezione di sovraproduttori di amminoacidi come L-leucina6, la strategia analogica soffre di gravi inconvenienti. Una delle principali preoccupazioni è la resistenza analogica originatadal processo di mutagenesi o attraverso mutazioni spontanee. I ceppi di resistenza possono sfuggire alla selezione bloccando, esportando o degradando gli analoghi5. Un'altra preoccupazione sono gli effetti collaterali tossici degli analoghi su altri processi cellulari7. Di conseguenza, i ceppi che sopravvivono alla selezione analogica potrebbero non essere i sovraproduttori di amminoacidi, mentre gli overproduttori desiderati potrebbero essere falsamente sterminati a causa degli effetti collaterali negativi.
Qui viene presentata una nuova strategia basata sulla legge del pregiudizio del codone al fine di ottenere identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. La maggior parte degli amminoacidi sono codificati da più di una tripletta nucleotide che è favorita in modo diverso dagli organismi ospiti8,9. Alcuni codoni sono raramente utilizzati nelle sequenze di codifica e sono indicati come i codoni rari. Le loro traduzioni in amminoacidi si basano sui tRNA cognati che trasportano gli aminoacidi corrispondenti. Tuttavia, i tRNA che riconoscono codoni rari di solito hanno abbondanza molto più basse rispetto ai tRNA dei codoni comuni10,11. Di conseguenza, questi rari tRNA hanno meno probabilità di catturare gli amminoacidi liberi nei concorsi con altri isoaccettatori, e le traduzioni delle sequenze rare ricche di codoni iniziano a rallentare o addirittura vengono terminate quando le quantità di aminoacidi sono limitate 10. Le traduzioni potrebbero, teoricamente, essere ripristinate se c'è un surplus di amminoacidi dopo aver caricato i sinonimi tRNA comuni a causa di sovraproduzioni o alimentamenti supplementari degli amminoacidi corrispondenti12. Se il gene raro ricco di codone codifica un marcatore di selezione o di screening, i ceppi che esibiscono i fenotipi corrispondenti possono essere facilmente identificati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi mirati.
La strategia di cui sopra viene applicata per stabilire una selezione e un sistema di screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi. Il sistema di selezione utilizza come marcatori i geni di resistenza agli antibiotici (ad esempio, kanR),mentre il sistema di screening utilizza le proteine fluorescenti di codifica dei geni (ad esempio, proteine fluorescenti verdi [GFP]) o cromogeniche (ad esempio, PrancerPurple). I geni marcatori in entrambi i sistemi vengono modificati sostituendo il numero definito dei codoni comuni per l'amminoacido mirato con la sua rara alternativa sinonimo. I ceppi nella libreria di mutazioni che ospitano il gene marcatore raro-codon-ricco sono selezionati o sottoposti a screening in condizioni adeguate, e gli overproduttori degli amminoacidi mirati possono essere facilmente identificati. Il flusso di lavoro inizia con la costruzione del sistema genetico marcatore raro-codon-ricco, seguita dall'ottimizzazione delle condizioni di lavoro, e quindi con l'identificazione e la verifica degli amminoacidi sovraproduttori. Questa strategia analogico-indipendente si basa sul dogma nella traduzione delle proteine ed è stata praticamente verificata per consentire identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. Teoricamente, potrebbe essere impiegato direttamente agli amminoacidi con codoni rari e a tutti i microrganismi. In tutto, la strategia basata su codone raro servirà come un'alternativa efficiente all'approccio analogico convenzionale quando non sono disponibili analoghi appropriati per specifici amminoacidi, o quando un alto tasso di falsi positivi è la preoccupazione principale. Il protocollo seguente utilizza codone raro leucina per dimostrare questa strategia nell'identificazione di Escherichia coli L-leucine iperproduttori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Per soddisfare il mercato in continua crescita per gli amminoacidi, sono necessari ceppi di produzione ad alte prestazioni. I prodotti non amnopesonoari sono convenzionalmente identificati sfruttando i concorsi tra gli amminoacidi e i loro analoghi. Tuttavia, questo metodo basato su analogico è di bassa precisione e gli analoghi appropriati per gli amminoacidi specifici sono limitati. Qui, presentiamo una strategia alternativa che consente uno screening accurato, sensibile e ad alta velocità di produzione di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni. Questa strategia è ispirata al fenomeno della distorsione dell'uso del codone nella traduzione delle proteine, per la quale i codoni sono classificati in comuni o rari in base alle loro frequenze di occorrenza nel DNA codificante. La traduzione di codoni rari dipende dai corrispondenti RNA di trasferimento rari (tRNA), che non possono essere completamente addebitati dagli amminoacidi cognati in condizioni di fame. Teoricamente, i tRNA rari possono essere addebitati se c'è un surplus di aminoacidi dopo aver caricato i sinonimi isoacceptors comuni. Pertanto, le traduzioni ritardate causate da codoni rari potrebbero essere ripristinate alimentando o sovrapproduzione intracellulari degli amminoacidi corrispondenti. In base a questa ipotesi, viene istituito un sistema di selezione o screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi sostituendo i codoni comuni degli amminoacidi mirati con le loro alternative rare sinonimi nei geni di resistenza agli antibiotici o nei geni codificare proteine fluorescenti o cromogene. Dimostriamo che le espressioni proteiche possono essere notevolmente ostacolate dall'incorporazione di codoni rari e che i livelli di proteine sono correlati positivamente con le concentrazioni di amminoacidi. Utilizzando questo sistema, gli sovraproduttori di aminoacidi multipli possono essere facilmente esaminati dalle librerie di mutazioni. Questa strategia basata su codone rara richiede solo un singolo gene modificato, e l'ospite è meno probabile che sfuggirà alla selezione rispetto ad altri metodi. Offre un approccio alternativo per ottenere i non amminoacidi sovraproduttori.

Per il sistema di selezione, si osserva una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il gene di resistenza agli antibiotici, ricco di codoni rari, rispetto al ceppo che ospita il gene di resistenza agli antibiotici di tipo selvatico quando viene coltivato in un medio(Figura 1a). Nelle stesse condizioni, la diminuzione della cellula OD600 diventa più evidente con l'aumentare del numero di codoni rari nel gene di resistenza a...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Questo studio presenta una strategia alternativa al metodo tradizionale basato sull'analogico tossico nell'identificazione di sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.

Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Questo metodo fornisce un'alternativa efficiente all'approccio convenzionale basato sull'analogico nell'ottenere sovraproduttori di amminoacidi. Questa tecnica sovracompia il metodo tradizionale basato sull'analogico fornendo precisione, sensibilità e alta produttività contemporaneamente. Questo metodo getta nuova luce sulla comprensione dei punti di forza della sovrapproduzione degli amminoacidi e sulla traduzione di codoni rari e potrebbe, teoricamente, essere applicato a tutti i microrganismi.Questo protocollo si basa principalmente su operazioni sperimentali molecolari di base che sono facili da seguire, ma possono richiedere più prove al fine di ottenere l'adeguata selezione di stringenze di sforzo. Una dimostrazione visiva di questa tecnica offre un apprezzamento diretto sulle prestazioni della selezione e un sistema di screening nell'identificazione dei produttori di amminoacidi. Per iniziare questa procedura, aggiungere il vettore nei frammenti marcatori, sul ghiaccio, in un rapporto molare da uno a uno a sette punti cinque microlitri di mix di assemblaggio a un volume totale di dieci microlitri.Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Trasforma cinque microlitri del prodotto di assemblaggio in 50 microlitri di cellule componenti a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Recupera le cellule in brodo Super Optimal con mezzo di repressione catabolita a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, placcarli sul mezzo LB Agar e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, usa un kit commerciale preferito per isolare il plasmide. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule competenti con un microlitro di plasmide che trasporta il KanR di tipo selvaggio.Trasformare un secondo set di cellule competenti con il plasmide contenente KanR RC 29 con tutti i codoni leucina sostituiti dal raro codone CTA. Placcare e incubare la coltura cellulare come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie che ospitano il gene marcatore di selezione di tipo selvatico nella derivata ricca di codone raro individualmente in cinque millilitri di mezzo LB diluito cinque volte contenente kanamicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascuna delle colture cellulari in una piastra di 96 pozzi in triplice copia in punti di tempo definiti. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'OD600.Inoculare le macchie che ospitano il gene marcatore KanR RC 29 in due insiemi di cinque millilitri del mezzo 0,2 x LB che contiene kanamicina, con o senza una fornitura di L-leucina. Aggiungere L-leucina a uno dei supporti a una concentrazione finale di un grammo per litro. Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con scuotimento a 250 giri/min e misurare l'OD600 per ogni coltura in punti di tempo definiti.Per iniziare, trasformare 50 microlitri del ceppo genitore utilizzato per la mutagenesi con un microlitro di plasmide che trasporta la GFP di tipo selvatico o il PPG di tipo selvatico. Placcare e incubare le impostazioni cultura delle celle come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie singolarmente a cinque millilitri del mezzo LB correttamente diluito.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min. Per i marcatori di fluorescenza, trasferire 200 microlitri delle colture cellulari in una piastra posteriore inferiore ben chiara in triplice copia in punti di tempo definiti. Misurare l'OD600 nella fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza.Per i marcatori cromogenici, misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari. Eseguire il saggio di alimentazione come descritto in precedenza e misurare l'intensità della fluorescenza o lo sviluppo del colore in punti di tempo definiti. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule mutanti con un microlitro del plasmide che trasporta il marcatore di selezione KanR RC 29, o i marcatori di screening GFP RC o PPG RC. Quindi, centrifugare le colture cellulari a 4000 volte G per cinque minuti.Per la selezione, scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di mezzo 0,2 x LB contenente kanamicina alle celle che trasportano il marcatore di selezione. Incubare il campione durante la notte in uno shaker a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, placcare la coltura notturna su un supporto di agar 0,2 x LB contenente kanamicina e incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore.Per lo screening, placcare il numero appropriato di cellule che ospitano il marcatore di screening sul mezzo agar LB contenente l'antibiotico appropriato. Incubare a 37 gradi Celsius per otto ore. Successivamente, inoculare il mezzo LB contenente l'antibiotico appropriato con ogni singola colonia dalla piastra.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Misurare l'OD600 e la fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza se si utilizza GFP RC. Misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari se viene utilizzato PPG RC.Per verificare le produttività degli amminoacidi dei ceppi candidati, preparare la coltura del seme inoculando cinque millilitri di mezzo LB con ciascuno dei ceppi candidati e lasciare che le cellule crescano durante la notte in uno shaker a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, raccogliere le cellule da un millilitro della coltura cellulare centrifugando a 4000 volte G per due minuti. Scartare il supernatante e rimescolare la tavolozza con un millilitro di acqua sterile.Inoculare 20 millilitri di mezzo M9 contenenti il quattro per cento di glucosio con 200 microlitri della sospensione cellulare e incubare in uno shaker da 250 millilitri a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo, centrifuga un millilitro del mezzo di coltura a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire 200 microlitri del supernatante in un tubo pulito da 1,5 millilitri.Preparare soluzioni standard L-leucine alle concentrazioni qui indicate. In una cappa aspirante aggiungere 100 microlitri di una trietilammina millimolare e 100 microlitri di un isotiocianato di fenile molare sia al supernatante che agli standard. Mescolare delicatamente le soluzioni e incubarle a temperatura ambiente per un'ora.Quindi, aggiungere 400 microlitri di n-esano allo stesso tubo e vortice per dieci secondi. La fase inferiore contiene i derivati amminoacidi ed è utilizzata per l'analisi HPLC. Filtrare la fase inferiore attraverso membrane in politetrafluoroetilene a 0,2 microliter.Successivamente, eseguire un microlitri del campione su un ultra HPLC dotato di una colonna C18 con una portata di 0,42 millilitri al minuto e alla temperatura della colonna per 40 gradi Celsius. Utilizzare un rivelatore array di diodi per rilevare gli amminoacidi mirati a 254 nanometri e calcolarne le concentrazioni mappando le aree di picco sotto la curva standard. In questo studio, i sovraproduttori di amminoacidi sono identificati utilizzando rari marcatori ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.Per il sistema di selezione, si dovrebbe osservare una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni rispetto al ceppo che ospita il tipo selvatico. L'inibizione del codone raro sulle espressioni proteiche avviene principalmente in condizioni di fame. Dopo l'alimentazione extra dell'amminoacido corrispondente, l'OD600 per il ceppo che ospita il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni aumenta significativamente.Per il sistema di screening, l'intensità della fluorescenza nel numero di cellule fluorescenti è significativamente inferiore per il ceppo che esprime la proteina fluorescente dal raro gene ricco di codoni rispetto al gene di tipo selvatico. L'alimentazione dell'amminoacido corrispondente ripristinerà le espressioni proteiche dai rari geni ricchi di codoni. Quando si utilizza la proteina viola, il colore sviluppato dal raro PPG ricco di codoni è più leggero di quello del gene di tipo selvatico.Il mezzo LB non diluito consente una lenta espressione del raro PPG ricco di codoni senza che l'alimentazione dell'L-leucina nella proteina viola espressa diventi visibile una volta che le cellule sono state pellettate. Tuttavia, questo non nasconde il fatto che l'espressione genica dal raro PPG ricco di codoni è migliorata dall'alimentazione della L-leucina. La rara strategia basata sul codone potrebbe identificare i sovraproduttori degli amminoacidi mirati dalla libreria di mutazioni e questi mutanti dovrebbero produrre quantità più elevate degli amminoacidi mirati rispetto ai ceppi genitori.Quando si tenta questa procedura, è importante regolare la rara frequenza del codone per ottenere una chiara discriminazione nell'OD o nel colore tra le cellule che ospitano i marcatori di tipo selvaggio e le rare derivate ricche di codone. L'analisi del trascritoma e il sequenziamento del genoma potrebbero essere applicati ai ceppi selezionati per indagare il meccanismo relativo alle produzioni di amminoacidi. Utilizzando questa tecnica, i sovraproduttori di amminoacidi potrebbero essere identificati in modo efficiente e l'analisi delle loro informazioni genetiche offrirebbe nuove informazioni sui loro meccanismi alla base delle sovrapproduzioni di amminoacidi.La derivazione degli amminoacidi potrebbe essere dannosa. Assicurarsi di indossare guanti e indumenti protettivi ed eseguire questi passaggi in un cappuccio per fumi.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Ricerca

Biochimica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Idrolisi di un Ni-Schiff-Base complessi utilizzando le condizioni adatte per la conservazione di acido-labile gruppi protettori

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Isolamento dell'istono dal tessuto fogliare di sorgo per la profilazione della spettrometria di massa dall'alto verso il basso dei potenziali marcatori epigenetici

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Stima del contenuto di Lignina da biomassa vegetale mediante acido tioglicolico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Folding e sondaggio di costrutti di acidi nucleici

<meta charset="utf8"></head><body>Previsione delle preferenze aminoacidiche delle interfacce di legame proteina-proteina

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Un approccio computazionale per decifrare le preferenze degli amminoacidi nelle interazioni multispecifiche proteina-proteina

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche di domini di legame peptidico potenzialmente multispecifici coinvolti nelle interazioni proteina-proteina