Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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Il lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (n. 21676026), dal National Key R&D Program of China (grant n. 2017YFD0201400) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2017M620643). I lavori dell'UCLA Institute of Advancement (Suzhou) sono stati sostenuti dalle sovvenzioni interne della provincia di Jiangsu e del Parco Industriale di Suzhou.

1. Costruzione dei plasmidi che esprimono i geni marcatori rari-codoni-ricchi
<ol><li>Selezionare un gene marcatore contenente un numero appropriato di codoni comuni per l'amminoacido mirato. NOTA: Per L-leucine, il gene di resistenza alla kanamicina kanR, che contiene 29 codoni di leucina, di cui 27 sono codoni comuni, viene utilizzato per la costruzione del sistema di selezione13. Il gene gfp, che contiene 17 codoni comuni su 19 codoni leule, o il gene di codifi...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Il numero di codoni rari nei geni marcatori e nel mezzo di selezione o screening è fondamentale per inibire le espressioni proteiche dai geni marcatori raramente-modificato codoni. Se non è possibile rilevare alcuna differenza significativa tra le espressioni proteiche dei geni marcatori di tipo selvatico e i loro derivati, l'aumento del numero di codoni rari o l'utilizzo di un mezzo limitato dai nutrienti può amplificare le differenze. Tuttavia, se l'effetto di inibizione è troppo forte, le espressioni proteiche non...

L'attuale produzione di amminoacidi dipende fortemente dalla fermentazione. Tuttavia, i titoli e le rese per la maggior parte dei ceppi di produzione di amminoacidi sono al di sotto delle crescenti richieste del mercato globale degli amminoacidi che vale miliardi di dollari1,2. Ottenere prodotti aminoacidi ad alte prestazioni sono fondamentali per l'aggiornamento dell'industria degli amminoacidi.
La strategia tradizionale per identificare i sovraproduttori di amminoacidi sfrutta i concorsi tra aminoacidi e i loro analoghi nella sintesi proteica3,4. Questi analoghi sono in grado di caricare i tRNA che riconoscono gli aminoacidi corrispondenti e quindi inibiscono gli allungamenti delle catene di peptidi, portando alla crescita arrestata o alla morte cellulare5. Un modo per resistere alle sollecitazioni analogiche è quello di aumentare le concentrazioni di aminoacidi intracellulari. Gli amminoacidi arricchiti supereranno gli analoghi per i tRNA finiti e garantiranno la corretta sintesi delle proteine funzionali. Pertanto, i ceppi che sopravvivono agli analoghi possono essere selezionati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi corrispondenti.
Sebbene si sia dimostrata efficace nella selezione di sovraproduttori di amminoacidi come L-leucina6, la strategia analogica soffre di gravi inconvenienti. Una delle principali preoccupazioni è la resistenza analogica originatadal processo di mutagenesi o attraverso mutazioni spontanee. I ceppi di resistenza possono sfuggire alla selezione bloccando, esportando o degradando gli analoghi5. Un'altra preoccupazione sono gli effetti collaterali tossici degli analoghi su altri processi cellulari7. Di conseguenza, i ceppi che sopravvivono alla selezione analogica potrebbero non essere i sovraproduttori di amminoacidi, mentre gli overproduttori desiderati potrebbero essere falsamente sterminati a causa degli effetti collaterali negativi.
Qui viene presentata una nuova strategia basata sulla legge del pregiudizio del codone al fine di ottenere identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. La maggior parte degli amminoacidi sono codificati da più di una tripletta nucleotide che è favorita in modo diverso dagli organismi ospiti8,9. Alcuni codoni sono raramente utilizzati nelle sequenze di codifica e sono indicati come i codoni rari. Le loro traduzioni in amminoacidi si basano sui tRNA cognati che trasportano gli aminoacidi corrispondenti. Tuttavia, i tRNA che riconoscono codoni rari di solito hanno abbondanza molto più basse rispetto ai tRNA dei codoni comuni10,11. Di conseguenza, questi rari tRNA hanno meno probabilità di catturare gli amminoacidi liberi nei concorsi con altri isoaccettatori, e le traduzioni delle sequenze rare ricche di codoni iniziano a rallentare o addirittura vengono terminate quando le quantità di aminoacidi sono limitate 10. Le traduzioni potrebbero, teoricamente, essere ripristinate se c'è un surplus di amminoacidi dopo aver caricato i sinonimi tRNA comuni a causa di sovraproduzioni o alimentamenti supplementari degli amminoacidi corrispondenti12. Se il gene raro ricco di codone codifica un marcatore di selezione o di screening, i ceppi che esibiscono i fenotipi corrispondenti possono essere facilmente identificati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi mirati.
La strategia di cui sopra viene applicata per stabilire una selezione e un sistema di screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi. Il sistema di selezione utilizza come marcatori i geni di resistenza agli antibiotici (ad esempio, kanR),mentre il sistema di screening utilizza le proteine fluorescenti di codifica dei geni (ad esempio, proteine fluorescenti verdi [GFP]) o cromogeniche (ad esempio, PrancerPurple). I geni marcatori in entrambi i sistemi vengono modificati sostituendo il numero definito dei codoni comuni per l'amminoacido mirato con la sua rara alternativa sinonimo. I ceppi nella libreria di mutazioni che ospitano il gene marcatore raro-codon-ricco sono selezionati o sottoposti a screening in condizioni adeguate, e gli overproduttori degli amminoacidi mirati possono essere facilmente identificati. Il flusso di lavoro inizia con la costruzione del sistema genetico marcatore raro-codon-ricco, seguita dall'ottimizzazione delle condizioni di lavoro, e quindi con l'identificazione e la verifica degli amminoacidi sovraproduttori. Questa strategia analogico-indipendente si basa sul dogma nella traduzione delle proteine ed è stata praticamente verificata per consentire identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. Teoricamente, potrebbe essere impiegato direttamente agli amminoacidi con codoni rari e a tutti i microrganismi. In tutto, la strategia basata su codone raro servirà come un'alternativa efficiente all'approccio analogico convenzionale quando non sono disponibili analoghi appropriati per specifici amminoacidi, o quando un alto tasso di falsi positivi è la preoccupazione principale. Il protocollo seguente utilizza codone raro leucina per dimostrare questa strategia nell'identificazione di Escherichia coli L-leucine iperproduttori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Per soddisfare il mercato in continua crescita per gli amminoacidi, sono necessari ceppi di produzione ad alte prestazioni. I prodotti non amnopesonoari sono convenzionalmente identificati sfruttando i concorsi tra gli amminoacidi e i loro analoghi. Tuttavia, questo metodo basato su analogico è di bassa precisione e gli analoghi appropriati per gli amminoacidi specifici sono limitati. Qui, presentiamo una strategia alternativa che consente uno screening accurato, sensibile e ad alta velocità di produzione di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni. Questa strategia è ispirata al fenomeno della distorsione dell'uso del codone nella traduzione delle proteine, per la quale i codoni sono classificati in comuni o rari in base alle loro frequenze di occorrenza nel DNA codificante. La traduzione di codoni rari dipende dai corrispondenti RNA di trasferimento rari (tRNA), che non possono essere completamente addebitati dagli amminoacidi cognati in condizioni di fame. Teoricamente, i tRNA rari possono essere addebitati se c'è un surplus di aminoacidi dopo aver caricato i sinonimi isoacceptors comuni. Pertanto, le traduzioni ritardate causate da codoni rari potrebbero essere ripristinate alimentando o sovrapproduzione intracellulari degli amminoacidi corrispondenti. In base a questa ipotesi, viene istituito un sistema di selezione o screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi sostituendo i codoni comuni degli amminoacidi mirati con le loro alternative rare sinonimi nei geni di resistenza agli antibiotici o nei geni codificare proteine fluorescenti o cromogene. Dimostriamo che le espressioni proteiche possono essere notevolmente ostacolate dall'incorporazione di codoni rari e che i livelli di proteine sono correlati positivamente con le concentrazioni di amminoacidi. Utilizzando questo sistema, gli sovraproduttori di aminoacidi multipli possono essere facilmente esaminati dalle librerie di mutazioni. Questa strategia basata su codone rara richiede solo un singolo gene modificato, e l'ospite è meno probabile che sfuggirà alla selezione rispetto ad altri metodi. Offre un approccio alternativo per ottenere i non amminoacidi sovraproduttori.

Per il sistema di selezione, si osserva una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il gene di resistenza agli antibiotici, ricco di codoni rari, rispetto al ceppo che ospita il gene di resistenza agli antibiotici di tipo selvatico quando viene coltivato in un medio(Figura 1a). Nelle stesse condizioni, la diminuzione della cellula OD600 diventa più evidente con l'aumentare del numero di codoni rari nel gene di resistenza a...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Questo studio presenta una strategia alternativa al metodo tradizionale basato sull'analogico tossico nell'identificazione di sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.

Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Questo metodo fornisce un'alternativa efficiente all'approccio convenzionale basato sull'analogico nell'ottenere sovraproduttori di amminoacidi. Questa tecnica sovracompia il metodo tradizionale basato sull'analogico fornendo precisione, sensibilità e alta produttività contemporaneamente. Questo metodo getta nuova luce sulla comprensione dei punti di forza della sovrapproduzione degli amminoacidi e sulla traduzione di codoni rari e potrebbe, teoricamente, essere applicato a tutti i microrganismi.Questo protocollo si basa principalmente su operazioni sperimentali molecolari di base che sono facili da seguire, ma possono richiedere più prove al fine di ottenere l'adeguata selezione di stringenze di sforzo. Una dimostrazione visiva di questa tecnica offre un apprezzamento diretto sulle prestazioni della selezione e un sistema di screening nell'identificazione dei produttori di amminoacidi. Per iniziare questa procedura, aggiungere il vettore nei frammenti marcatori, sul ghiaccio, in un rapporto molare da uno a uno a sette punti cinque microlitri di mix di assemblaggio a un volume totale di dieci microlitri.Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Trasforma cinque microlitri del prodotto di assemblaggio in 50 microlitri di cellule componenti a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Recupera le cellule in brodo Super Optimal con mezzo di repressione catabolita a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, placcarli sul mezzo LB Agar e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, usa un kit commerciale preferito per isolare il plasmide. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule competenti con un microlitro di plasmide che trasporta il KanR di tipo selvaggio.Trasformare un secondo set di cellule competenti con il plasmide contenente KanR RC 29 con tutti i codoni leucina sostituiti dal raro codone CTA. Placcare e incubare la coltura cellulare come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie che ospitano il gene marcatore di selezione di tipo selvatico nella derivata ricca di codone raro individualmente in cinque millilitri di mezzo LB diluito cinque volte contenente kanamicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascuna delle colture cellulari in una piastra di 96 pozzi in triplice copia in punti di tempo definiti. Utilizzare un lettore di lastre per misurare l'OD600.Inoculare le macchie che ospitano il gene marcatore KanR RC 29 in due insiemi di cinque millilitri del mezzo 0,2 x LB che contiene kanamicina, con o senza una fornitura di L-leucina. Aggiungere L-leucina a uno dei supporti a una concentrazione finale di un grammo per litro. Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con scuotimento a 250 giri/min e misurare l'OD600 per ogni coltura in punti di tempo definiti.Per iniziare, trasformare 50 microlitri del ceppo genitore utilizzato per la mutagenesi con un microlitro di plasmide che trasporta la GFP di tipo selvatico o il PPG di tipo selvatico. Placcare e incubare le impostazioni cultura delle celle come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire le colonie singolarmente a cinque millilitri del mezzo LB correttamente diluito.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min. Per i marcatori di fluorescenza, trasferire 200 microlitri delle colture cellulari in una piastra posteriore inferiore ben chiara in triplice copia in punti di tempo definiti. Misurare l'OD600 nella fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza.Per i marcatori cromogenici, misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari. Eseguire il saggio di alimentazione come descritto in precedenza e misurare l'intensità della fluorescenza o lo sviluppo del colore in punti di tempo definiti. In primo luogo, trasformare 50 microlitri delle cellule mutanti con un microlitro del plasmide che trasporta il marcatore di selezione KanR RC 29, o i marcatori di screening GFP RC o PPG RC. Quindi, centrifugare le colture cellulari a 4000 volte G per cinque minuti.Per la selezione, scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di mezzo 0,2 x LB contenente kanamicina alle celle che trasportano il marcatore di selezione. Incubare il campione durante la notte in uno shaker a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, placcare la coltura notturna su un supporto di agar 0,2 x LB contenente kanamicina e incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore.Per lo screening, placcare il numero appropriato di cellule che ospitano il marcatore di screening sul mezzo agar LB contenente l'antibiotico appropriato. Incubare a 37 gradi Celsius per otto ore. Successivamente, inoculare il mezzo LB contenente l'antibiotico appropriato con ogni singola colonia dalla piastra.Incubare i campioni in uno shaker a 37 gradi Celsius mentre si trema a 250 giri/min. Misurare l'OD600 e la fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza se si utilizza GFP RC. Misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari se viene utilizzato PPG RC.Per verificare le produttività degli amminoacidi dei ceppi candidati, preparare la coltura del seme inoculando cinque millilitri di mezzo LB con ciascuno dei ceppi candidati e lasciare che le cellule crescano durante la notte in uno shaker a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, raccogliere le cellule da un millilitro della coltura cellulare centrifugando a 4000 volte G per due minuti. Scartare il supernatante e rimescolare la tavolozza con un millilitro di acqua sterile.Inoculare 20 millilitri di mezzo M9 contenenti il quattro per cento di glucosio con 200 microlitri della sospensione cellulare e incubare in uno shaker da 250 millilitri a 250 giri/min e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo, centrifuga un millilitro del mezzo di coltura a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire 200 microlitri del supernatante in un tubo pulito da 1,5 millilitri.Preparare soluzioni standard L-leucine alle concentrazioni qui indicate. In una cappa aspirante aggiungere 100 microlitri di una trietilammina millimolare e 100 microlitri di un isotiocianato di fenile molare sia al supernatante che agli standard. Mescolare delicatamente le soluzioni e incubarle a temperatura ambiente per un'ora.Quindi, aggiungere 400 microlitri di n-esano allo stesso tubo e vortice per dieci secondi. La fase inferiore contiene i derivati amminoacidi ed è utilizzata per l'analisi HPLC. Filtrare la fase inferiore attraverso membrane in politetrafluoroetilene a 0,2 microliter.Successivamente, eseguire un microlitri del campione su un ultra HPLC dotato di una colonna C18 con una portata di 0,42 millilitri al minuto e alla temperatura della colonna per 40 gradi Celsius. Utilizzare un rivelatore array di diodi per rilevare gli amminoacidi mirati a 254 nanometri e calcolarne le concentrazioni mappando le aree di picco sotto la curva standard. In questo studio, i sovraproduttori di amminoacidi sono identificati utilizzando rari marcatori ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.Per il sistema di selezione, si dovrebbe osservare una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni rispetto al ceppo che ospita il tipo selvatico. L'inibizione del codone raro sulle espressioni proteiche avviene principalmente in condizioni di fame. Dopo l'alimentazione extra dell'amminoacido corrispondente, l'OD600 per il ceppo che ospita il raro gene di resistenza agli antibiotici ricco di codoni aumenta significativamente.Per il sistema di screening, l'intensità della fluorescenza nel numero di cellule fluorescenti è significativamente inferiore per il ceppo che esprime la proteina fluorescente dal raro gene ricco di codoni rispetto al gene di tipo selvatico. L'alimentazione dell'amminoacido corrispondente ripristinerà le espressioni proteiche dai rari geni ricchi di codoni. Quando si utilizza la proteina viola, il colore sviluppato dal raro PPG ricco di codoni è più leggero di quello del gene di tipo selvatico.Il mezzo LB non diluito consente una lenta espressione del raro PPG ricco di codoni senza che l'alimentazione dell'L-leucina nella proteina viola espressa diventi visibile una volta che le cellule sono state pellettate. Tuttavia, questo non nasconde il fatto che l'espressione genica dal raro PPG ricco di codoni è migliorata dall'alimentazione della L-leucina. La rara strategia basata sul codone potrebbe identificare i sovraproduttori degli amminoacidi mirati dalla libreria di mutazioni e questi mutanti dovrebbero produrre quantità più elevate degli amminoacidi mirati rispetto ai ceppi genitori.Quando si tenta questa procedura, è importante regolare la rara frequenza del codone per ottenere una chiara discriminazione nell'OD o nel colore tra le cellule che ospitano i marcatori di tipo selvaggio e le rare derivate ricche di codone. L'analisi del trascritoma e il sequenziamento del genoma potrebbero essere applicati ai ceppi selezionati per indagare il meccanismo relativo alle produzioni di amminoacidi. Utilizzando questa tecnica, i sovraproduttori di amminoacidi potrebbero essere identificati in modo efficiente e l'analisi delle loro informazioni genetiche offrirebbe nuove informazioni sui loro meccanismi alla base delle sovrapproduzioni di amminoacidi.La derivazione degli amminoacidi potrebbe essere dannosa. Assicurarsi di indossare guanti e indumenti protettivi ed eseguire questi passaggi in un cappuccio per fumi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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