Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第21676026号)、中国国家鍵研究開発プログラム(助成金第2017YFD0201400)、中国ポストドクター科学財団(助成第2017M620643号)が共同で支援した。UCLA進歩研究所(蘇州)の作品は、江蘇省と蘇州工業団地からの内部助成金によって支えられました。

1. 希少コドン豊富なマーカー遺伝子を発現するプラスミドの構築
<ol><li>標的アミノ酸に対する一般的なコドンの適切な数を含むマーカー遺伝子を選択します。 注:L-ロイシンの場合、29個のロイシンコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子カンRは、そのうち27個が一般的なコドンであり、選択システム13の構築に使用される。19個のロイシンコドンのうち17個の...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

マーカー遺伝子および選択またはスクリーニング媒体中の希少コドンの数は、希少コドン修飾マーカー遺伝子からのタンパク質発現を阻害するために重要である。野生型マーカー遺伝子とその誘導体からのタンパク質発現に有意な差が検出されない場合、希少なコドンの数を増やすか、または栄養制限培地を使用すると、その違いを増幅する可能性があります。しかしながら、阻害効果が強?...

アミノ酸の現在の生産は、発酵に大きく依存しています。しかし、ほとんどのアミノ酸産生株の力価および収量は、数十億ドルの価値がある世界的なアミノ酸市場の需要の高まりを下回っています1,2.アミノ酸産業のアップグレードには、高性能アミノ酸過剰生産者の獲得が重要です。
アミノ酸過剰生産者を同定する従来の戦略は、タンパク質合成におけるアミノ酸とその類似体との競争を利用する3,4.これらの類似体は、対応するアミノ酸を認識するtRNAを充電し、したがってペプチド鎖の伸びを阻害し、逮捕された増殖または細胞死5につながる。アナログストレスに抵抗する 1 つの方法は、細胞内アミノ酸の濃度を増加させます。.濃縮アミノ酸は、有限tRNAのアナログを上回り、機能性タンパク質の正しい合成を保証します。したがって、類似体を生き残る株は選択することができ、対応するアミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。
L-ロイシン6などのアミノ酸の過剰生産者の選択に成功したが、アナログベースの戦略は深刻な欠点に苦しんでいる。主な懸念の1つは、変異形成の過程または自発的な突然変異によって生じたアナログ抵抗である。抵抗を持つ株は、アナログ5を遮断、エクスポート、または劣化することによって選択を逃れることができます。もう一つの懸念は、他の細胞プロセス7にアナログの有毒な副作用です。その結果、アナログ選択を生き残る株はアミノ酸過剰生産者ではないかもしれませんが、所望の過剰生産者は負の副作用のために誤って根絶される可能性があります。
ここでは、アミノ酸過剰生産者の正確かつ迅速な同定を達成するために、コドンバイアスの法則に基づく新しい戦略を提示する。ほとんどのアミノ酸は、宿主生物8、9によって異なって好まれる複数のヌクレオチドトリプレットによってコードされる。一部のコドンはコーディングシーケンスではほとんど使用されず、希少なコドンと呼ばれています。アミノ酸への彼らの翻訳は、対応するアミノ酸を運ぶ認知tRNAに依存しています.しかし、希少なコドンを認識するtRNAは、通常、一般的なコドン10、11のtRNAよりもはるかに低い存在量を持っています。その結果、これらの希少なtRNAは、他のアイソセプターとの競争で遊びのアミノ酸を捕捉する可能性が低く、希少コドンリッチ配列の翻訳は、アミノ酸の量が限られているときに減速し始めるか、あるいは終了する10.翻訳は、理論的には、対応するアミノ酸12の過剰産生または余分な供給に起因する同義の一般的なtRNAを充電した後にアミノ酸の余剰がある場合に復元することができる。希少コドンリッチ遺伝子が選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードする場合、対応するフェノタイプを示す株を容易に同定することができ、標的アミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。
上記の戦略は、アミノ酸過剰生産者の同定のための選択およびスクリーニングシステムを確立するために適用される。選択システムは、抗生物質耐性遺伝子(例えば、カンR)をマーカーとして使用し、スクリーニングシステムは蛍光をコードする遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質[GFP])または発色性(例えば、PrancerPurple)タンパク質を使用する。両方のシステムのマーカー遺伝子は、標的アミノ酸の共通コドンの定義された数をその代名詞希少代替に置き換えることによって修飾される。希少コドンリッチマーカー遺伝子を保有する変異ライブラリー内の株は、適切な条件下で選択またはスクリーニングされ、標的アミノ酸の過剰生産者を容易に同定することができる。ワークフローは、希少コドンリッチマーカー遺伝子システムの構築から始まり、その後、労働条件の最適化、次にアミノ酸オーバープロデューサーの同定と検証が行われます。このアナログ非依存戦略は、タンパク質翻訳の教義に基づいており、アミノ酸オーバープロデューサーの正確かつ迅速な同定を可能にするために実質的に検証されています。理論的には、希少なコドンを含むアミノ酸やすべての微生物に直接使用することができます。全体として、希少コドンベースの戦略は、特定のアミノ酸に対する適切なアナログが利用できない場合、または高い偽陽性率が主な懸念事項である場合に、従来のアナログベースのアプローチに代わる効率的な代替手段として機能します。以下のプロトコルは、ロイシンレアコドンを使用して、エシェリヒア大腸菌L-ロイシンオーバープロデューサーを同定する際にこの戦略を実証します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

増え続けるアミノ酸市場を満たすためには、高性能な生産株が必要です。アミノ酸過剰生産者は、従来、アミノ酸とその類似体との競争を利用して同定される。しかし、このアナログベースの方法は精度が低く、特定のアミノ酸に対する適切なアナログは限られています。ここでは、希少コドンリッチマーカーを用いたアミノ酸オーバープロデューサーの正確で敏感でハイスループットのスクリーニングを可能にする代替戦略を紹介する。この戦略は、コードDNAにおける発生頻度に基づいてコドンが一般的または希少なものに分類されるタンパク質翻訳におけるコドン使用バイアスの現象に触発されています。希少コドンの翻訳は、飢餓下の歯車アミノ酸では完全に充電できない、対応する希少転写RNA(tRNA)に依存します。理論的には、同義の一般的な同化性等化剤を充電した後にアミノ酸の余剰がある場合、希少なtRNAを充電することができます。したがって、希少なコドンによって引き起こされる遅滞翻訳は、対応するアミノ酸の摂食または細胞内過剰産生によって回復することができる。この仮定の下で、標的アミノ酸の一般的なコドンを抗生物質耐性遺伝子または遺伝子の同義的希少な代替物に置き換えることによって、アミノ酸過剰生産者を同定するための選択またはスクリーニングシステムが確立される。蛍光または発色性タンパク質をコードする。我々は、タンパク質発現が希少なコドンの取り込みによって大きく妨げられ、タンパク質のレベルがアミノ酸濃度と正に相関することを示す。このシステムを使用して、複数のアミノ酸の過剰生産者は、変異ライブラリーから容易にスクリーニングすることができる。この希少コドンベースの戦略は、単一の改変遺伝子のみを必要とし、宿主は他の方法よりも選択を逃れる可能性が低い。これは、アミノ酸オーバープロデューサーを得るための代替アプローチを提供しています.

選択システムの場合、希少コドンが豊富な抗生物質耐性遺伝子を保有する菌株に対するOD600の急激な減少は、適当に培養した場合に野生型抗生物質耐性遺伝子を保有する株と比較して観察されるべきである。ミディアム(図1a)。同じ条件下で、抗生物質耐性遺伝子の希少なコドンの数が増加するにつれて、細胞OD600の減少がより明?...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

本研究では、希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定する従来の有毒アナログベースの方法に代わる戦略を提示し、精度、感度、高スループットを同時に達成する。

希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

この方法は、アミノ酸オーバープロデューサを得る際の従来のアナログベースアプローチに代わる効率的な代替手段を提供する。この手法は、精度、感度、高スループットを同時に提供することで、従来のアナログベースの手法と競合します。この方法は、アミノ酸の過剰生産強度の理解と希少なコドンの翻訳に新たな光を当て、理論的には、すべての微生物に適用することができます。このプロトコルは、主に従いやすいが、緊張糸の適切な選択を達成するために複数の試験を必要とする可能性がある基本的な分子実験操作に依存しています。この技術の視覚的なデモンストレーションは、選択のパフォーマンスとアミノ酸生産者を同定するスクリーニングシステムに直接感謝を提供する。この手順を開始するには、マーカーフラグメントの1〜1〜7ポイントのモル比で1〜1〜7ポイントのアセンブリミックスの5マイクロリットルを総体積10マイクロリットルに加えます。摂氏50度で1時間インキュベートします。アセンブリ製品の5マイクロリットルを摂氏42度で50マイクロリットルの構成部品セルに30秒間変換します。1時間の間、37°Cでカタボライト抑圧媒体で超最適なスープの細胞を回復します。その後、LB寒天培地にプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、好ましい市販キットを使用してプラスミドを分離する。まず、野生型KanRを運ぶプラスミドの1マイクロリットルで有能な細胞の50マイクロリットルを変換します。希少なコドンCTAに置換されたすべてのロイシンコドンを用いて、KanR RC 29を含むプラスミドを有するコンピテントセルの第2セットを変換する。プレートと、テキストプロトコルで概説されているように細胞培養をインキュベートする。次に、希少コドンが豊富な誘導体に野生型選択マーカー遺伝子を収容するコロニーを、1ミリリットル当たり50マイクログラムの濃度でカナマイシンを含む5倍希釈LB培地の5ミリリットルに個別に移す。250 rpmで振りながら、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。次に、各細胞培養物の200マイクロリットルを、定義された時点で3重に96ウェルプレートに移す。プレートリーダーを使用してOD600を測定します。カナマイシンを含む0.2 x LB培地の5ミリリットルの2組にKanR RC29マーカー遺伝子を含む染色を、L-ロイシンの供給の有無にかかわらず接種する。L-ロイシンを1リットル当たり1グラムの最終濃度に培地の1つに加えます。250 rpmで揺れ、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートし、定義された時点で各培養物のOD600を測定します。まず、野生型GFPまたは野生型PPGを運ぶプラスミドの1マイクロリットルで突然変異誘発に使用される親株の50マイクロリットルを変換します。プレートおよびテキストプロトコルで概説されているように細胞培養物をインキュベートする。次に、適切に希釈したLB培地の5ミリリットルにコロニーを個別に移す。250 rpmで振ると、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。蛍光マーカーの場合、細胞培養物200マイクロリットルを、定義された時点で3重に96の明確な底裏板に移します。蛍光でOD600を測定し、蛍光強度を計算します。発色マーカーの場合、細胞培養物の色の発達を測定する。前述のように給餌アッセイを行い、定義された時点で蛍光強度または色の発達を測定する。まず、選択マーカーKanR RC29、またはスクリーニングマーカーGFP RCまたはPPG RCを担うプラスミドの1マイクロリットルで変異細胞の50マイクロリットルを変換する。次に、5分間Gの4000倍の細胞培養物を遠心する。選択のために、上清を捨て、カナマイシンを含む0.2 x LB培地を5ミリリットル加えて、選択マーカーを運ぶ細胞に加えます。37°Cのシェーカーで一晩サンプルをインキュベートします。翌日、カナマイシンを含む0.2 x LB寒天培地に一晩培養し、摂氏37度で12時間培養します。スクリーニングのために、適切な数の細胞を適切な抗生物質を含むLB寒天培地上にスクリーニングマーカーを収容する。摂氏37度で8時間インキュベートします。この後、プレートから各単一コロニーに適切な抗生物質を含むLB培地を接種する。250 rpmで振りながら、37°Cのシェーカーでサンプルをインキュベートします。OD600と蛍光を測定し、GFP RCを使用する場合は蛍光強度を計算します。PPG RCを使用する場合、細胞培養物の色の発達を測定します。候補株のアミノ酸生産性を検証するには、候補株のそれぞれで5ミリリットルのLB培地を接種して種子培養を準備し、250rpmで摂氏37度でシェーカーで細胞を一晩成長させます。翌日、Gの4000倍で2分間遠心して細胞培養の1ミリリットルから細胞を収穫する。上清を捨て、1ミリリットルの滅菌水でパレットを再中断します。細胞懸濁液の200マイクロリットルで4パーセントのグルコースを含むM9培地の20ミリリットルを接種し、250rpmで250ミリリットルシェーカーでインキュベートし、24時間摂氏37度でインキュベートする。翌日、培養培地の1ミリリットルをGの4000倍で5分間遠心する。200マイクロリットルの上清をきれいな1.5ミリリットルの管に移す。ここに示す濃度でL-ロイシン標準溶液を調製する。ヒュームフードには、1ミリモルトリエチルアミン100マイクロリットルと1モルフェニルイソチオシアネート100マイクロリットルを上清と標準の両方に加えます。溶液を軽く混ぜ、室温で1時間インキュベートします。その後、同じチューブに400マイクロリットルのn-ヘキサンを加え、それを10秒間渦に入れます。下の相はアミノ酸誘導体を含み、HPLC分析に使用されます。0.2マイクロリットルのポリテトラフルオロエチレン膜を通して低相をフィルター処理します。この後、1マイクロリットルのサンプルを、1分あたり0.42ミリリットルの流量を有するC18カラムを装備した超HPLC上で、40°Cのカラム温度で実行します。ダイオードアレイ検出器を使用して、254ナノメートルで標的となるアミノ酸を検出し、標準曲線下のピーク領域をマッピングしてその濃度を計算します。本研究では、アミノ酸の過剰生産物を、希少なコドンを豊富に含むマーカーを使用して、精度、感度、高スループットを同時に達成することによって同定されています。選択システムでは、希少なコドンが豊富な抗生物質耐性遺伝子を含む株のOD600の急激な減少は、野生型を収容する株と比較して観察されるべきである。タンパク質表現に対する希少コドンの阻害は、主に飢えた状態下で行われます。対応するアミノ酸の余分な供給後、希少なコドンが豊富な抗生物質耐性遺伝子を収容する株用OD600が大幅に増加する。スクリーニングシステムの場合、蛍光細胞数の蛍光強度は、野生型遺伝子よりも希少なコドンリッチ遺伝子から蛍光タンパク質を発現する株に対して有意に低い。対応するアミノ酸の供給は、希少なコドンが豊富な遺伝子からタンパク質表現を回復する。紫色のタンパク質を使用する場合、希少なコドンが豊富なPPGから開発された色は、野生型遺伝子の色よりも軽い。希釈されていないLB培地は、細胞がペレット化されると、発現した紫色タンパク質中でL-ロイシンの供給なしに希少なコドンリッチPPGの遅い発現を可能にする。しかし、これは希少なコドンリッチPPGからの遺伝子発現がL-ロイシンの摂食によって増強されるという事実を隠さない。まれなコドンベースの戦略は、突然変異ライブラリーから標的アミノ酸の過剰生産者を同定することができ、これらの突然変異体は親株よりも高い量の標的アミノ酸を産生すべきである。この手順を試みる場合、野生型マーカーを含む細胞と希少コドンが豊富な誘導体を含む細胞間のODまたは色の明確な差別を達成するために、希少なコドン周波数を調整することが重要である。トランスクリプトーム解析とゲノムシーケンシングを、選択した株に適用して、アミノ酸産生に関連するメカニズムを調べることができました。この技術を用いて、アミノ酸の過剰生産者を効率的に同定することができ、その遺伝情報の分析は、アミノ酸過剰産生の背後にあるメカニズムに関する新しい洞察を提供するであろう。アミノ酸誘導体化は有害である可能性があります。.手袋と防護服を着用し、ヒュームフードでこれらの手順を実行することを確認してください。

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

生化学

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

核酸コンストラクトのフォールディングとプロービング

<meta charset="utf8"></head><body>タンパク質-タンパク質結合界面のアミノ酸選好の予測

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:多重特異性タンパク質間相互作用におけるアミノ酸選好を解読するための計算アプローチ

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.