Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(보조금 제21676026호), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0201400), 중국 박사후 과학 재단(2017M620643)이 공동으로 지원했습니다. UCLA 진보 연구소 (소주)의 작품은 장쑤성과 쑤저우 산업 단지의 내부 보조금에 의해 지원되었다.

1. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 발현하는 플라스미드의 구축
<ol><li>표적 아미노산에 대한 적절한 수의 공통 코돈이 포함된 마커 유전자를 선택한다. 참고: L-류신의 경우, 29개의 류신 코돈이 함유된 카나마이신 내성 유전자 kanR은 27개의 일반적인 코돈이며, 선택시스템(13)의시공에 사용된다. 19개의 류신 코돈 중 17개의 일반적인 코돈, 또는 보라색 단백질 ?...

<ol>
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마커 유전자및 선택 또는 스크리닝 배지에서 희귀 코돈의 수는 희귀 코돈 변형 마커 유전자로부터단백질 발현을 억제하는 데 중요하다. 야생형 마커 유전자와 이들의 유도체로부터의 단백질 발현 사이에 유의한 차이가 검출되지 않으면, 희귀 코돈의 수를 증가시키거나 영양분 제한 배지를 사용하여 차이를 증폭시킬 수 있다. 그러나, 억제 효과가 너무 강한 경우, 단백질 발현은 해당 아미노산의 ?...

아미노산의 현재 생산 발효에 크게 의존. 그러나, 대부분의 아미노산 생산 균주에 대한 적시및 수율은 수십억 달러의 가치가 있는 글로벌 아미노산 시장의 수요 증가에 미치지못하고1,2. 고성능 아미노산 과잉 생산자를 얻는 것은 아미노산 산업의 업그레이드에 매우 중요합니다.
아미노산 과잉 생산자를 식별하는 전통적인 전략은 단백질 합성에서 아미노산과 그유사체 사이의 경쟁을 악용 3,4. 이들 유사체는 상응하는 아미노산을 인식하고 펩티드 사슬의 연신을 억제하는 tRNAs를 충전할 수 있으며, 이는 체포된 성장 또는 세포 사멸을 초래한다5. 아날로그 응력에 저항하는 한 가지 방법은 세포 내 아미노산의 농도를 증가시키는 것입니다. 농축 된 아미노산은 유한 tRNAs에 대한 유사체를 능가하고 기능성 단백질의 올바른 합성을 보장합니다. 따라서, 유사체에서 살아남는 균주를 선택할 수 있고 상응하는 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 있다.
L-류신 6와 같은 아미노산에 대한 과잉 생산자를선택하는 데 성공했지만 아날로그 기반 전략은 심각한 단점을 겪고 있습니다. 한 가지 주요 관심사는 돌연변이 발생 의 과정에서 또는 자발적인 돌연변이를 통해 서 유래 아날로그 저항이다. 저항이있는 균주는 아날로그5를차단, 내보내기 또는 저하시켜 선택을 벗어날 수 있습니다. 또 다른 관심사는 다른 세포 과정에 아날로그의 독성 부작용7. 결과적으로, 아날로그 선택에서 살아남은 균주는 아미노산 과잉 생산자가 아닐 수 있으며, 원하는 과잉 생산자는 부정적인 부작용으로 인해 거짓으로 박멸 될 수 있습니다.
여기서, 코돈 편향의 법칙에 기초한 새로운 전략이 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 달성하기 위해 제시된다. 대부분의 아미노산은 숙주 유기체8,9에의해 다르게 선호되는 하나 이상의 뉴클레오티드 삼중항에 의해 인코딩된다. 몇몇 코돈은 코딩 순서에서 드물게 사용되지 않으며 희소한 코돈으로 불립니다. 아미노산으로의 그들의 번역은 해당 아미노산을 운반하는 코그네이트 tRNAs에 의존합니다. 그러나, 희귀 코돈 인식 하는 tRNAs는 일반적으로 일반적인 코돈10,11의tRNAs 보다 훨씬 낮은 풍부. 따라서, 이러한 희귀 한 tRNAs는 다른 이소 수용자와의 경쟁에서 자유 아미노산을 포착 할 가능성이 적으며, 희귀 코돈이 풍부한 서열의 번역은 감속하기 시작하거나 아미노산의 양이 제한될 때 종료됩니다. 10. 번역은, 이론적으로, 해당 아미노산의 과잉 생산 또는 추가 공급으로 인해 동의어 일반적인 tRNAs를 충전 한 후 아미노산 잉여가있는 경우 복원 될 수있다12. 희소코돈이 풍부한 유전자가 선택 또는 스크리닝 마커를 인코딩하는 경우, 상응하는 표현형을 나타내는 균주는 쉽게 식별될 수 있으며 표적 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 높습니다.
상기 전략은 아미노산 과잉 생산자의 식별을 위한 선택 및 스크리닝 시스템을 확립하기 위해 적용된다. 선택 시스템은 항생 저항 유전자(예를 들어, kan R)를 마커로서 사용하며, 스크리닝 시스템은 형광(예를 들어, 녹색 형광 단백질[GFP]) 또는 염색체성(예를 들어, PrancerPurple) 단백질을 인코딩하는 유전자를 사용한다. 두 시스템의 마커 유전자는 그것의 동의어 드문 대안으로 표적 아미노산에 대한 일반적인 코돈의 정의 된 숫자를 대체하여 수정됩니다. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 수용하는 돌연변이 라이브러리의 균주는 적절한 조건 하에서 선택되거나 스크리며, 표적 아미노산의 과잉 생산자는 쉽게 식별될 수 있다. 워크플로우는 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자 시스템의 구축으로 시작하여 작업 조건의 최적화를 거친 다음 아미노산 과잉 생산자의 식별 및 검증을 수행합니다. 이 아날로그 독립적 인 전략은 단백질 번역의 교리를 기반으로하며 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 가능하게하는 실질적으로 검증되었습니다. 이론적으로, 그것은 직접 희귀 코돈과 모든 미생물 아미노산에 고용 될 수 있습니다. 대체로, 희귀 코돈 기반 전략은 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체를 사용할 수 없거나 높은 거짓 긍정률이 주요 관심사인 경우 기존의 아날로그 기반 접근법에 대한 효율적인 대안으로 작용할 것입니다. 아래 프로토콜은 대장균 L-류신 과잉 생산자를 식별하는 이 전략을 입증하기 위해 류신 희귀 코동을 사용합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

아미노산에 대한 계속 성장하는 시장을 만족시키기 위해서는 고성능 생산 균주가 필요합니다. 아미노산 과잉 생산자는 아미노산과 그들의 유사체 사이 경쟁을 이용하 여 전통적으로 확인됩니다. 그러나, 이 아날로그 기반 방법은 낮은 정확도이며, 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체는 제한된다. 여기에서는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 민감하며 처리량이 높은 스크리닝을 가능하게 하는 대체 전략을 제시합니다. 이 전략은 코돈이 코딩 DNA에서 발생 빈도에 따라 일반적이거나 희귀 한 것으로 분류되는 단백질 번역에서 코돈 사용 편향현상에서 영감을 받습니다. 희귀 코돈의 번역은 기아하에 코그네이트 아미노산에 의해 완전히 충전 될 수없는 해당 희귀 전사 RNAs (tRNAs)에 달려 있습니다. 이론적으로, 희귀 한 tRNAs는 동의어 일반적인 이소 수용인을 충전 한 후 아미노산의 잉여가있는 경우 충전 될 수있다. 따라서, 희소한 코돈에 기인한 지체번역은 대응하는 아미노산의 공급 또는 세포내 과잉 생산에 의해 복원될 수 있었다. 이러한 가정하에, 표적 아미노산의 일반적인 코돈들을 항생제 내성 유전자 또는 유전자의 동의어드문 대안으로 대체함으로써 아미노산 과잉 생산자를 식별하기 위한 선택 또는 스크리닝 시스템이 확립된다. 형광 또는 발색성 단백질을 인코딩합니다. 우리는 단백질 발현이 희소한 코돈의 통합에 의해 크게 방해될 수 있고 단백질의 수준이 아미노산 농도와 긍정적으로 상관관계가 있다는 것을 보여줍니다. 이 시스템을 사용 하 여, 여러 아미노산의 과잉 생산자 돌연변이 라이브러리에서 쉽게 밖으로 선별 될 수 있습니다. 이 희소한 코돈 기지를 둔 전략은 단지 단 하나 수정한 유전자를 요구하고, 호스트는 그밖 방법에서 보다는 선택을 탈출하기 위하여 확률이 낮습니다. 그것은 아미노산 과잉 생산자를 얻기 위한 대체 접근 을 제안 합니다.

선택 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생 저항 유전자를 품고 있는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형 항생저항유전자를 배양할 때 균주에 비해 관찰되어야 한다. (그림1a)를참조하십시오. 동일한 조건하에서, 항생저항성 유전자에서 희귀 코돈의 수가 증가함에 따라 세포 OD600의 감소가 더욱 명백해진다(도...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

이 연구는 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성하기 위해 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 기존의 독성 아날로그 기반 방법에 대한 대체 전략을 제시합니다.

희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

이 방법은 아미노산 과잉 생산자를 얻기에 기존의 아날로그 기반 접근 방식에 효율적인 대안을 제공합니다. 이 기술은 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 제공함으로써 기존의 아날로그 기반 방법을 능가합니다. 이 방법은 아미노산 과잉 생산 강도와 희귀 코돈의 번역을 이해하는 새로운 빛을 발산하고, 이론적으로, 모든 미생물에 적용 할 수 있습니다.이 프로토콜은 주로 따르기 쉬운 기본 분자 실험 작업에 의존하지만 긴장 문자열의 적절한 선택을 달성하기 위해 여러 시험을 요구할 수 있습니다. 이 기술의 시각적 데모는 아미노산 생산자를 식별하는 선택 및 선별 시스템의 성능에 대한 직접적인 감사를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면, 마커 조각에 벡터를 추가, 얼음에, 1 ~ 7 점 조립 믹스의 어셈블리 믹스의 어셈블리 의 어퍼 비에 10 마이크로 리터의 총 부피에.1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 조립 제품의 5마이크로리터를 섭씨 42도에서 50마이크로리터로 30초 동안 변환합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 카타볼라이트 억압 배지로 슈퍼 최적 국물에 있는 세포를 복구하십시오.그런 다음 LB Agar 매체에 접시를 만들고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 플라스미드를 분리하기 위해 선호하는 상업용 키트를 사용합니다. 첫째, 야생형 KanR을 운반하는 플라스미드의 마이크로리터 1개로 유능한 세포의 50마이크로리터를 변환합니다.희귀 코돈 CTA로 대체된 모든 류신 코돈으로 KanR RC 29를 함유하는 플라스미드로 유능한 세포의 두 번째 세트를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 희귀 코돈이 풍부한 유도체에서 야생형 선택 마커 유전자를 개별적으로 5배 희석LB 배지의 5밀리리터로 밀리리터당 50마이크로그램의 농도로 이송한다.250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. 이어서, 정의된 시점에서 삼중판으로 각 세포 배양의 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 이송한다. 플레이트 판독기를 사용하여 OD600을 측정합니다.칸르신을 함유하고 있는 0.2 x LB 배지의 5밀리리터 2세트에서 KanR RC 29 마커 유전자를 수용하는 얼룩을 L-류신의 공급 유무에 관계없이 접종한다. 리터당 1그램의 최종 농도에 L-류신을 매체 중 하나에 추가합니다. 250 rpm에서 흔들림과 37섭씨37도에서 셰이커에 샘플을 배양하고 정의 된 시점의 각 문화에 대한 OD600을 측정합니다.시작하려면, 야생 형 GFP 또는 야생 형 PPG를 운반하는 플라스미드의 하나의 마이크로 리터로 돌연변이 발생에 사용되는 부모 균주의 50 마이크로 리터를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 제대로 희석된 LB 배지의 5밀리리터로 개별적으로 콜로니를 옮기.250 rpm에서 흔들어와 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양. 형광 마커의 경우, 정의된 시점의 트리플리케이트에서 세포 배양200 마이크로리터를 96개의 잘 맑은 바닥 백 플레이트로 옮기는다. 형광에서 OD600을 측정하고 형광 강도를 계산합니다.염색체 마커의 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다. 이전에 설명한 바와 같이 수유 분석서를 수행하고 정의된 시점의 형광 강도 또는 색상 개발을 측정합니다. 먼저, 선택 마커 KanR RC(29)를 운반하는 플라스미드의 1마이크로리터로 돌연변이 세포의 50마이크로리터를 변환하거나, 또는 선별 마커 GFP RC 또는 PPG RC를 변환한다. 다음으로, 세포 배양을 5분 동안 4000배 G로 원심분리합니다.선택을 위해, 상체를 버리고 선택 마커를 운반하는 세포에 카나마이신을 함유하는 0.2 x LB 배지의 5 밀리리터를 추가한다. 섭씨 37도에서 셰이커로 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화를 카나마이신을 함유한 0.2 x LB 천 배지에 접시를 달고 12시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.스크리닝을 위해, 적절한 항생제를 함유하는 LB 천 배지에 스크리닝 마커를 수용하는 적절한 수의 세포를 플레이트한다. 8시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. 그 후, 플레이트로부터 각 단일 콜로니와 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지를 접종한다.250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. GFP RC를 사용하는 경우 OD600 및 형광을 측정하고 형광 강도를 계산합니다. PPG RC를 사용하는 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다.후보균의 아미노산 생성성을 확인하기 위해, 각 응시자 균주와 LB 배지의 5밀리리터를 접종하여 종자 배양을 준비하고 세포가 250 rpm및 섭씨 37도에서 셰이커에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있도록 합니다. 다음 날, 세포 배양의 1 밀리리터에서 2 분 동안 4000 회 G에서 원심분리하여 세포를 수확하십시오. 상체를 버리고 1 밀리리터의 멸균물로 팔레트를 다시 분리합니다.20 밀리리터의 M9 배지는 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 함유하고 250 rpm에서 250 밀리리터 셰이커와 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 원심분리기 는 5 분 동안 4000 배 G에서 배양 배지의 1 밀리리터. 200 마이크로리터의 초미세먼지를 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮킨다.여기에 표시된 농도로 L-류신 표준 솔루션을 준비하십시오. 연기 후드에, 1 밀리머 트리에틸라민의 100 마이크로 리터와 1개의 어금니 페닐 이소티오카네이트의 마이크로리터를 슈퍼나틸트와 표준 모두에 추가합니다. 용액을 부드럽게 섞고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 동일한 튜브에 400 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 소용돌이를 피하십시오. 하부 상에는 아미노산 유도체가 포함되어 있으며 HPLC 분석에 사용됩니다. 0.2 마이크로리터 폴리테트라플루오로로틸렌 멤브레인을 통해 하부 위상을 필터링합니다.그런 다음 분당 0.42 밀리리터의 유속과 40°C의 열 온도가 있는 C18 컬럼을 장착한 초HPLC에서 샘플의 마이크로리터 1개를 실행합니다. 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 254 나노미터에서 표적 아미노산을 감지하고 표준 곡선 아래의 피크 영역을 매핑하여 농도를 계산합니다. 이 연구에서 아미노산 과잉 생산자는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성함으로써 식별됩니다.선발 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생저항 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형을 수용하는 균주에 비해 관찰되어야 한다. 단백질 발현에 희귀 코돈의 억제는 주로 굶주리고 있는 조건 하에서 일어난다. 해당 아미노산의 추가 공급 후, 희귀 코돈이 풍부한 항생제 내성 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600이 크게 증가한다.스크리닝 시스템의 경우, 형광 세포의 수에 있는 형광 강도는 야생형 유전자보다 희귀 코돈이 풍부한 유전자로부터 형광 단백질을 표현하는 균주에 대해 현저히 낮다. 해당 아미노산의 공급은 희귀 코돈이 풍부한 유전자에서 단백질 발현을 회복시킬 것이다. 보라색 단백질을 사용하는 경우, 희귀 코돈이 풍부한 PPG로부터 개발된 색상은 야생형 유전자보다 가볍다.희석되지 않은 LB 배지는 세포가 펠릿화되면 발현된 보라색 단백질에서 L-류신 공급없이 희귀 코돈이 풍부한 PPG의 느린 발현을 허용한다. 그러나, 이것은 희소한 코돈 이 풍부한 PPG에서 유전자 발현이 L-류신의 공급에 의해 강화된다는 사실을 은폐하지 않습니다. 희귀 코돈 기반 전략은 돌연변이 라이브러리에서 표적 아미노산의 과잉 생산자를 식별 할 수 있으며,이 돌연변이는 부모 균주보다 표적 아미노산의 높은 금액을 생산해야합니다.이 절차를 시도할 때, 희귀 코돈 주파수를 조정하여 야생형 마커와 희귀 코돈이 풍부한 유도체를 수용하는 세포 간의 OD 또는 색상에서 명확한 차별을 달성하는 것이 중요합니다. 전사 분석 및 게놈 시퀀싱은 아미노산 생산과 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 선택된 균주에 적용될 수 있다. 이 기술을 사용하여 아미노산 과잉 생산자는 효율적으로 식별 될 수 있으며 유전 정보의 분석은 아미노산 과잉 생산 뒤에 자신의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.아미노산 유도는 유해할 수 있습니다. 장갑과 보호복을 착용하고 연기 후드로 이러한 단계를 수행해야 합니다.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

핵산 구조체의 접힘 및 프로빙

<meta charset="utf8"></head><body>Predicting Amino Acid Preferences of Protein-Protein Binding Interface(단백질-단백질 결합 인터페이스의 아미노산 선호도 예측)

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 다중특이적 단백질-단백질 상호 작용에서 아미노산 선호도를 해독하기 위한 전산적 접근 방식

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

단백질-단백질 상호작용에 관여할 수 있는 다중특이적 펩타이드 결합 도메인의 아미노산 선호도에 대한 전산 예측(Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-binding domains involved in protein-protein interactions)