Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Arbeidet ble i fellesskap støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 21676026), National Key R & D-programmet i Kina (Grant no. 2017YFD0201400), og Kina postdoktor Science Foundation (Grant no. 2017M620643). Arbeider i UCLA Institute of avansement (Suzhou) ble støttet av den interne tilskudd fra Jiangsu-provinsen og Suzhou Industrial Park.

1. byggingen av plasmider uttrykker den sjeldne Codon-rike markør gener
<ol><li>Velg et merke gen som inneholder et passende antall felles kodon for den målrettede aminosyren. Merk: for L-leucine, kanamycin motstands gen kanR, som inneholder 29 leucine kodon, hvorav 27 er felles kodon, brukes til bygging av utvalgs systemet13. Det gfp genet, som inneholder 17 vanlige kodon av 19 leucine kodon, eller den lilla protein-koding genet prancerpurple (PPG<...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Antallet sjeldne kodon i markør gener og valg eller screening medium er avgjørende for å hemme protein uttrykk fra sjeldne-Codon markør gener. Hvis det ikke oppdages signifikante forskjeller mellom protein uttrykk fra de ville-type markør gener og deres derivater, øke antall sjeldne kodon eller ved hjelp av et nærings begrenset medium kan forsterke forskjellene. Men hvis hemming effekten er for sterk, kan protein uttrykkene ikke gjenopprettes selv ved ekstra mating av de tilsvarende aminosyrer. I dette tilfellet b...

Den nåværende produksjon av aminosyrer avhenger svært mye av gjæring. Men titers og rentene for de fleste aminosyre produksjon stammer er under stigende krav til global amino acid markedet som er verdt milliarder av dollar1,2. Innhenting av høy ytelse aminosyre overproducers er avgjørende for oppgradering av aminosyren industrien.
Tradisjonell strategi for å identifisere aminosyre overproducers utnytter konkurranser mellom aminosyrer og deres analogs i protein syntese3,4. Disse analogs er i stand til å belaste tRNAs som anerkjenner den tilsvarende aminosyrer og dermed hemme forlengelser av peptid kjeder, fører til arrestert vekst eller celle død5. En måte å motstå de analoge påkjenninger er å øke konsentrasjonen av intracellulære aminosyrer. De beriket aminosyrer vil outcompete analogs for endelig tRNAs og sikre riktig syntese av funksjonelle proteiner. Derfor stammer som overlever analogs kan velges og er sannsynligvis overproducers av de tilsvarende aminosyrer.
Selv viste vellykket i å velge overproducers for aminosyrer som L-leucine6, den analoge-baserte strategien lider av alvorlige ulemper. En stor bekymring er den analoge motstanden stammer fra prosessen med mutagenese eller gjennom spontane mutasjoner. Stammer med motstand kan unnslippe utvalget ved å blokkere, eksportere, eller nedverdigende analogs5. En annen bekymring er de giftige bivirkningene av analogs på andre cellulære prosesser7. Som en konsekvens, stammer som overlever det analoge valget er kanskje ikke aminosyren overproducers, mens den ønskede overproducers kan bli feilaktig utryddet på grunn av negative bivirkninger.
Her er en roman strategi basert på loven om Codon bias presentert for å oppnå nøyaktige og raske IDer av aminosyre overproducers. De fleste aminosyrer er kodet av mer enn én nukleotid Triplet som foretrekkes annerledes av verten organismer8,9. Noen kodon er sjelden brukt i koding sekvenser og er referert til som den sjeldne kodon. Deres oversettelser til aminosyrer stole på beslektet tRNAs som bærer tilsvarende aminosyrer. Imidlertid, tRNAs det anerkjenne sjelden kodon vanligvis ha mange lavere forekomster enn tRNAs av det vanlig kodon10,11. Følgelig, disse sjeldne tRNAs er mindre sannsynlighet for å fange den frie aminosyrer i konkurranser med andre isoacceptors, og oversettelser av sjeldne-Codon-rike sekvenser begynner å avta eller til og med er avsluttet når mengder aminosyrer er begrenset 10. oversettelsene kan teoretisk bli gjenopprettet hvis det er en aminosyre overskudd etter å ha ladet den synonymt felles tRNAs grunn av overproductions eller ekstra feedings av de tilsvarende aminosyrer12. Hvis den sjeldne-Codon genet koder et utvalg eller screening markør, stammer viser tilsvarende fenotyper kan da være lett identifiseres og er sannsynligvis overproducers av målrettede aminosyrer.
Ovennevnte strategi er brukt for å etablere et utvalg og en screening system for identifisering av aminosyre overproducers. Utvalget systemet bruker antibiotikaresistens gener (f. eks kan R) som markører mens screening systemet bruker genene koding fluorescerende (f. eks, grønt fluorescerende protein [GFP]) eller kromogen (f. eks, PrancerPurple) proteiner. Markøren gener i begge systemene er endret ved å erstatte definerte tall av felles kodon for målrettet aminosyre med sin synonymt sjeldne alternativ. Stammene i mutasjonen biblioteket som havna i sjeldne-Codon-rik markør genet er valgt eller vist under riktige forhold, og overproducers av målrettede aminosyrer kan lett identifiseres. Arbeidsflyten begynner med byggingen av den sjeldne-Codon markør genet system, etterfulgt av optimalisering av arbeidsforholdene, og deretter identifisering og verifisering av aminosyren overproducers. Denne analoge-uavhengige strategien er basert på dogmer i protein oversettelse og har vært praktisk talt bekreftet for å muliggjøre nøyaktige og raske IDer av aminosyre overproducers. Teoretisk sett kan det være direkte ansatt til aminosyrer med sjeldne kodon og til alle mikroorganismer. I alt, den sjeldne-Codon-basert strategi vil tjene som et effektivt alternativ til den konvensjonelle analog-basert tilnærming når riktig analogs for bestemte aminosyrer er utilgjengelige, eller når en høy falsk positiv rate er den store bekymringen. Protokollen nedenfor bruker leucine sjeldne Codon til å demonstrere denne strategien for å identifisere Escherichia coli L-leucine overproducers.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

For å tilfredsstille det stadig voksende markedet for aminosyrer, er høy-ytelse produksjon belastninger nødvendig. Aminosyren overproducers er konvensjonelt identifisert ved å utnytte konkurransene mellom aminosyrer og deres analogs. Men, denne analoge-baserte metoden er av lav nøyaktighet, og riktig analogs for bestemte aminosyrer er begrenset. Her presenterer vi en alternativ strategi som muliggjør en nøyaktig, følsom og høy gjennomstrømming screening av aminosyre-overproducers ved hjelp av sjeldne-Codon markører. Denne strategien er inspirert av fenomenet Codon bruk bias i protein oversettelse, som kodon er kategorisert i vanlige eller sjeldne de basert på deres frekvenser av forekomst i kodingen DNA. Oversettelsen av sjeldne kodon avhenger av deres tilsvarende sjeldne overføring RNAs (tRNAs), som ikke kan være fullt ladet av beslektet aminosyrer under sult. Teoretisk sett kan den sjeldne tRNAs belastes hvis det er et overskudd av aminosyrer etter lading av synonymt felles isoacceptors. Derfor, tilbakestående oversettelser forårsaket av sjeldne kodon kan gjenopprettes ved fôring eller intracellulære overproductions av de tilsvarende aminosyrer. Under denne antakelsen, er et utvalg eller screening system for å identifisere aminosyre overproducers etablert ved å erstatte den felles kodon av målrettede aminosyrer med sine synonymt sjeldne alternativer i antibiotikaresistens gener eller gener av fluorescerende eller kromogen proteiner. Vi viser at protein uttrykkene kan bli sterkt hindret av innlemmelse av sjeldne kodon og at nivåene av proteiner samsvarer positivt med aminosyre-konsentrasjonene. Ved hjelp av dette systemet, overproducers av flere aminosyrer kan lett bli vist ut fra mutasjon biblioteker. Denne sjeldne-Codon strategien krever bare et enkelt modifisert gen, og verten er mindre tilbøyelige til å unnslippe utvalget enn i andre metoder. Det tilbyr en alternativ tilnærming for innhenting aminosyre overproducers.

For utvalgs systemet, en kraftig nedgang i OD600 for stammer harboring den sjeldne-Codon antibiotikaresistens genet bør observeres i forhold til belastningen harboring vill-type antibiotikaresistens genet når kultivert i en egnet medium (figur 1a). Under samme forhold blir nedgangen i celle OD600 mer opplagt ettersom antall sjeldne kodon i antibiotikaresistens genet øker (figur 1a). Det bør bemerkes at h...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Denne studien presenterer en alternativ strategi til konvensjonell giftig analog-basert metode for å identifisere aminosyre overproducers ved hjelp av sjeldne-Codon markører for å oppnå nøyaktighet, følsomhet, og høy gjennomstrømming samtidig.

Identifisere amino acid Overproducers bruke rare-Codon-Rich markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Denne metoden gir et effektivt alternativ til den konvensjonelle analoge tilnærmingen til å oppnå aminosyreoverprodusere. Denne teknikken utkonkurrerer den tradisjonelle analoge metoden ved å gi nøyaktighet, følsomhet og høy gjennomstrømning samtidig. Denne metoden kaster nytt lys over å forstå aminosyre overproduksjonsstyrker og oversettelse av sjeldne kodoner og kan teoretisk brukes på alle mikroorganismer.Denne protokollen er for det meste avhengig av grunnleggende molekylære eksperimentelle operasjoner som er enkle å følge, men kan kreve flere studier for å oppnå egnet valg av anstrengende stringencies. En visuell demonstrasjon av denne teknikken gir en direkte forståelse av ytelsen til utvalget og et screeningsystem for å identifisere aminosyreprodusenter. For å begynne denne prosedyren, legg vektoren i markørfragmentene, på is, i et molarforhold på en til en til syv punkt fem mikroliter monteringsblanding til et totalt volum på ti mikroliter.Inkuber ved 50 grader Celsius i en time. Forvandle fem mikroliter av monteringsproduktet til 50 mikroliter komponentceller ved 42 grader Celsius i 30 sekunder. Gjenopprett cellene i Super Optimal kjøttkraft med Catabolite undertrykkelse medium på 37 grader Celsius i en time.Deretter, plate dem på LB Agar medium og inkubere over natten på 37 grader Celsius. Neste dag, bruk et foretrukket kommersielt sett for å isolere plasmid. Først forvandle 50 mikroliter av de kompetente cellene med en mikroliter plasmid som bærer vill-type KanR.Forvandle et annet sett av de kompetente cellene med plasmid som inneholder KanR RC 29 med alle leucinkodoner erstattet av den sjeldne codon CTA. Plate og inkuber cellekulturen som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter overfører du koloniene som huser det ville utvalgsmarkørgenet i det sjeldne kodonrike derivatet individuelt til fem milliliter fem ganger fortynnet LB-medium som inneholder kanamycin ved en konsentrasjon på 50 mikrogram per milliliter.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius mens du rister på 250 rpm. Deretter overfører du 200 mikroliter av hver av cellekulturene til en 96 brønnplate i triplikate på definerte tidspunkter. Bruk en plateleser til å måle OD600.Inokuler flekkene som skjuler KanR RC 29-markørgenet i to sett med fem milliliter av 0,2 x LB-mediet som inneholder kanamycin, med eller uten tilførsel av L-leucin. Tilsett L-leucin til et av mediene til en endelig konsentrasjon på ett gram per liter. Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius med risting ved 250 rpm og mål OD600 for hver kultur på definerte tidspunkter.Til å begynne med kan du transformere 50 mikroliter av foreldrestammen som brukes til mutagenese med en mikroliter plasmid som bærer den ville GFP-en eller den ville PPG-typen. Plate og inkuber cellekulturene som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter overfører koloniene individuelt til fem milliliter av riktig fortynnet LB-medium.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius med risting ved 250 rpm. For fluorescensmarkører, overfør 200 mikroliter av cellekulturene til en 96 godt klar bunnplate i triplicate på definerte tidspunkter. Mål OD600 i fluorescensen og beregn fluorescensintensiteten.For kromogene markører, måle fargeutviklingen av cellekulturene. Utfør fôringsanalysen som beskrevet tidligere, og mål fluorescensintensiteten eller fargeutviklingen på definerte tidspunkter. Først forvandle 50 mikroliter av mutantcellene med en mikroliter av plasmid bærer valgmarkøren KanR RC 29, eller screening markører GFP RC eller PPG RC. Deretter sentrifuger cellekulturene på 4000 ganger G i fem minutter.For valg, kast supernatant og tilsett fem milliliter på 0,2 x LB medium som inneholder kanamycin til celler som bærer utvalgsmarkøren. Inkuber prøven over natten i en shaker ved 37 grader Celsius. Neste dag, plate over natten kultur på 0,2 x LB agar medium som inneholder kanamycin og inkubere på 37 grader Celsius i 12 timer.For screening, plate riktig antall celler som skjuler screening markør på LB agar medium som inneholder riktig antibiotika. Inkuber ved 37 grader Celsius i åtte timer. Etter dette inokulerer LB-mediet som inneholder riktig antibiotika med hver enkelt koloni fra platen.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius mens du rister på 250 rpm. Mål OD600 og fluorescensen og beregn fluorescensintensiteten hvis GFP RC brukes. Mål fargeutviklingen av cellekulturene hvis PPG RC brukes.For å verifisere aminosyreproduktivitetene til kandidatstammene, forberede frøkulturen ved å vaksinere fem milliliter LB-medium med hver av kandidatstammene og la cellene vokse over natten i en shaker ved 250 rpm og ved 37 grader Celsius. Neste dag høster du cellene fra en milliliter cellekultur ved å sentrifugere ved 4000 ganger G i to minutter. Kast den overnaturlige og resuspend paletten med en milliliter sterilt vann.Inokuler 20 milliliter M9 medium som inneholder fire prosent glukose med 200 mikroliter av cellesuspensjonen og inkubere i en 250 milliliter shaker ved 250 rpm og ved 37 grader Celsius i 24 timer. Neste dag sentrifugerer en milliliter av kulturmediet ved 4000 ganger G i fem minutter. Overfør 200 mikroliter av supernatanten til et rent 1,5 milliliter rør.Forbered L-leucin standardløsninger ved konsentrasjonene som vises her. I en røykhette legger du til 100 mikroliter med en millimolar trietylamin og 100 mikroliter av en molarfenylisothiocyanat til både supernatant og standardene. Bland løsningene forsiktig og inkuber dem ved romtemperatur i en time.Deretter legger du til 400 mikroliter n-heksan til samme rør og virvler det i ti sekunder. Den nedre fasen inneholder aminosyrederivatene og brukes til HPLC-analyse. Filtrer den nedre fasen gjennom 0,2 mikroliterpolytetrafluoretylenmembraner.Etter dette kjører du en mikroliter av prøven på en ultra HPLC utstyrt med en C18-kolonne med en strømningshastighet på 0,42 milliliter per minutt og ved kolonnetemperatur i 40 grader Celsius. Bruk en diodearraydetektor til å oppdage de målrettede aminosyrene på 254 nanometer og beregne konsentrasjonene ved å kartlegge toppområdene under standardkurven. I denne studien identifiseres aminosyreoverprodusere ved hjelp av sjeldne kodonrike markører for samtidig å oppnå nøyaktighet, følsomhet og høy gjennomstrømning.For valgsystemet bør en kraftig reduksjon i OD600 for stammer som huser det sjeldne kodonrike antibiotikaresistensgenet observeres i forhold til belastningen som skjuler villtypen. Hemming av sjelden kodon på proteinuttrykk foregår for det meste under sultne forhold. Etter ekstra fôring av tilsvarende aminosyre øker OD600 for belastningen som skjuler det sjeldne kodonrike antibiotikaresistensgenet betydelig.For screeningsystemet er fluorescensintensiteten i antall fluorescerende celler betydelig lavere for belastningen som uttrykker det fluorescerende proteinet fra det sjeldne kodonrike genet enn fra det ville genet. Fôring av tilsvarende aminosyre vil gjenopprette proteinuttrykk fra de sjeldne kodonrike genene. Når du bruker det lilla proteinet, er fargen utviklet fra den sjeldne kodonrike PPG lettere enn fra det ville genet.Det ufortynnede LB-mediet tillater langsomt uttrykk for den sjeldne kodonrike PPG uten L-leucinfôring i det uttrykte lilla proteinet blir synlig når cellene er pelleted. Dette skjuler imidlertid ikke det faktum at genuttrykk fra den sjeldne kodonrike PPG forsterkes ved fôring av L-leucin. Den sjeldne kodonbaserte strategien kan identifisere overprodusere av de målrettede aminosyrene fra mutasjonsbiblioteket, og disse mutantene bør produsere høyere mengder av de målrettede aminosyrene enn de overordnede stammene.Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å justere sjelden kodonfrekvens for å oppnå en klar diskriminering i OD eller farge mellom celler som huser de ville markører og de sjeldne kodonrike derivatene. Transkripsjonsanalyse og genomsekvensering kan brukes på de valgte stammene for å undersøke mekanismen knyttet til aminosyreproduksjoner. Ved hjelp av denne teknikken, aminosyre overprodusere kan effektivt identifiseres og analyse av deres genetiske informasjon ville gi ny innsikt i sine mekanismer bak aminosyre overproduksjoner.Aminosyre derivatisering kan være skadelig. Pass på å bruke hansker og verneklær og utføre disse trinnene i en røykhette.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks ved hjelp av betingelser som er egnet for oppbevaring av syre-labil beskyttelsesgrupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering av Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profilering av potensielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimalisert inkorporering av Alkynyl fettsyreanaloger for påvisning av fettakylerte proteiner ved hjelp av klikkkjemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifisere bindingsproteiner av små ligander med differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...