Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Arbeidet ble i fellesskap støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 21676026), National Key R & D-programmet i Kina (Grant no. 2017YFD0201400), og Kina postdoktor Science Foundation (Grant no. 2017M620643). Arbeider i UCLA Institute of avansement (Suzhou) ble støttet av den interne tilskudd fra Jiangsu-provinsen og Suzhou Industrial Park.

1. byggingen av plasmider uttrykker den sjeldne Codon-rike markør gener
<ol><li>Velg et merke gen som inneholder et passende antall felles kodon for den målrettede aminosyren. Merk: for L-leucine, kanamycin motstands gen kanR, som inneholder 29 leucine kodon, hvorav 27 er felles kodon, brukes til bygging av utvalgs systemet13. Det gfp genet, som inneholder 17 vanlige kodon av 19 leucine kodon, eller den lilla protein-koding genet prancerpurple (PPG<...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Antallet sjeldne kodon i markør gener og valg eller screening medium er avgjørende for å hemme protein uttrykk fra sjeldne-Codon markør gener. Hvis det ikke oppdages signifikante forskjeller mellom protein uttrykk fra de ville-type markør gener og deres derivater, øke antall sjeldne kodon eller ved hjelp av et nærings begrenset medium kan forsterke forskjellene. Men hvis hemming effekten er for sterk, kan protein uttrykkene ikke gjenopprettes selv ved ekstra mating av de tilsvarende aminosyrer. I dette tilfellet b...

Den nåværende produksjon av aminosyrer avhenger svært mye av gjæring. Men titers og rentene for de fleste aminosyre produksjon stammer er under stigende krav til global amino acid markedet som er verdt milliarder av dollar1,2. Innhenting av høy ytelse aminosyre overproducers er avgjørende for oppgradering av aminosyren industrien.
Tradisjonell strategi for å identifisere aminosyre overproducers utnytter konkurranser mellom aminosyrer og deres analogs i protein syntese3,4. Disse analogs er i stand til å belaste tRNAs som anerkjenner den tilsvarende aminosyrer og dermed hemme forlengelser av peptid kjeder, fører til arrestert vekst eller celle død5. En måte å motstå de analoge påkjenninger er å øke konsentrasjonen av intracellulære aminosyrer. De beriket aminosyrer vil outcompete analogs for endelig tRNAs og sikre riktig syntese av funksjonelle proteiner. Derfor stammer som overlever analogs kan velges og er sannsynligvis overproducers av de tilsvarende aminosyrer.
Selv viste vellykket i å velge overproducers for aminosyrer som L-leucine6, den analoge-baserte strategien lider av alvorlige ulemper. En stor bekymring er den analoge motstanden stammer fra prosessen med mutagenese eller gjennom spontane mutasjoner. Stammer med motstand kan unnslippe utvalget ved å blokkere, eksportere, eller nedverdigende analogs5. En annen bekymring er de giftige bivirkningene av analogs på andre cellulære prosesser7. Som en konsekvens, stammer som overlever det analoge valget er kanskje ikke aminosyren overproducers, mens den ønskede overproducers kan bli feilaktig utryddet på grunn av negative bivirkninger.
Her er en roman strategi basert på loven om Codon bias presentert for å oppnå nøyaktige og raske IDer av aminosyre overproducers. De fleste aminosyrer er kodet av mer enn én nukleotid Triplet som foretrekkes annerledes av verten organismer8,9. Noen kodon er sjelden brukt i koding sekvenser og er referert til som den sjeldne kodon. Deres oversettelser til aminosyrer stole på beslektet tRNAs som bærer tilsvarende aminosyrer. Imidlertid, tRNAs det anerkjenne sjelden kodon vanligvis ha mange lavere forekomster enn tRNAs av det vanlig kodon10,11. Følgelig, disse sjeldne tRNAs er mindre sannsynlighet for å fange den frie aminosyrer i konkurranser med andre isoacceptors, og oversettelser av sjeldne-Codon-rike sekvenser begynner å avta eller til og med er avsluttet når mengder aminosyrer er begrenset 10. oversettelsene kan teoretisk bli gjenopprettet hvis det er en aminosyre overskudd etter å ha ladet den synonymt felles tRNAs grunn av overproductions eller ekstra feedings av de tilsvarende aminosyrer12. Hvis den sjeldne-Codon genet koder et utvalg eller screening markør, stammer viser tilsvarende fenotyper kan da være lett identifiseres og er sannsynligvis overproducers av målrettede aminosyrer.
Ovennevnte strategi er brukt for å etablere et utvalg og en screening system for identifisering av aminosyre overproducers. Utvalget systemet bruker antibiotikaresistens gener (f. eks kan R) som markører mens screening systemet bruker genene koding fluorescerende (f. eks, grønt fluorescerende protein [GFP]) eller kromogen (f. eks, PrancerPurple) proteiner. Markøren gener i begge systemene er endret ved å erstatte definerte tall av felles kodon for målrettet aminosyre med sin synonymt sjeldne alternativ. Stammene i mutasjonen biblioteket som havna i sjeldne-Codon-rik markør genet er valgt eller vist under riktige forhold, og overproducers av målrettede aminosyrer kan lett identifiseres. Arbeidsflyten begynner med byggingen av den sjeldne-Codon markør genet system, etterfulgt av optimalisering av arbeidsforholdene, og deretter identifisering og verifisering av aminosyren overproducers. Denne analoge-uavhengige strategien er basert på dogmer i protein oversettelse og har vært praktisk talt bekreftet for å muliggjøre nøyaktige og raske IDer av aminosyre overproducers. Teoretisk sett kan det være direkte ansatt til aminosyrer med sjeldne kodon og til alle mikroorganismer. I alt, den sjeldne-Codon-basert strategi vil tjene som et effektivt alternativ til den konvensjonelle analog-basert tilnærming når riktig analogs for bestemte aminosyrer er utilgjengelige, eller når en høy falsk positiv rate er den store bekymringen. Protokollen nedenfor bruker leucine sjeldne Codon til å demonstrere denne strategien for å identifisere Escherichia coli L-leucine overproducers.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

For å tilfredsstille det stadig voksende markedet for aminosyrer, er høy-ytelse produksjon belastninger nødvendig. Aminosyren overproducers er konvensjonelt identifisert ved å utnytte konkurransene mellom aminosyrer og deres analogs. Men, denne analoge-baserte metoden er av lav nøyaktighet, og riktig analogs for bestemte aminosyrer er begrenset. Her presenterer vi en alternativ strategi som muliggjør en nøyaktig, følsom og høy gjennomstrømming screening av aminosyre-overproducers ved hjelp av sjeldne-Codon markører. Denne strategien er inspirert av fenomenet Codon bruk bias i protein oversettelse, som kodon er kategorisert i vanlige eller sjeldne de basert på deres frekvenser av forekomst i kodingen DNA. Oversettelsen av sjeldne kodon avhenger av deres tilsvarende sjeldne overføring RNAs (tRNAs), som ikke kan være fullt ladet av beslektet aminosyrer under sult. Teoretisk sett kan den sjeldne tRNAs belastes hvis det er et overskudd av aminosyrer etter lading av synonymt felles isoacceptors. Derfor, tilbakestående oversettelser forårsaket av sjeldne kodon kan gjenopprettes ved fôring eller intracellulære overproductions av de tilsvarende aminosyrer. Under denne antakelsen, er et utvalg eller screening system for å identifisere aminosyre overproducers etablert ved å erstatte den felles kodon av målrettede aminosyrer med sine synonymt sjeldne alternativer i antibiotikaresistens gener eller gener av fluorescerende eller kromogen proteiner. Vi viser at protein uttrykkene kan bli sterkt hindret av innlemmelse av sjeldne kodon og at nivåene av proteiner samsvarer positivt med aminosyre-konsentrasjonene. Ved hjelp av dette systemet, overproducers av flere aminosyrer kan lett bli vist ut fra mutasjon biblioteker. Denne sjeldne-Codon strategien krever bare et enkelt modifisert gen, og verten er mindre tilbøyelige til å unnslippe utvalget enn i andre metoder. Det tilbyr en alternativ tilnærming for innhenting aminosyre overproducers.

For utvalgs systemet, en kraftig nedgang i OD600 for stammer harboring den sjeldne-Codon antibiotikaresistens genet bør observeres i forhold til belastningen harboring vill-type antibiotikaresistens genet når kultivert i en egnet medium (figur 1a). Under samme forhold blir nedgangen i celle OD600 mer opplagt ettersom antall sjeldne kodon i antibiotikaresistens genet øker (figur 1a). Det bør bemerkes at h...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Denne studien presenterer en alternativ strategi til konvensjonell giftig analog-basert metode for å identifisere aminosyre overproducers ved hjelp av sjeldne-Codon markører for å oppnå nøyaktighet, følsomhet, og høy gjennomstrømming samtidig.

Identifisere amino acid Overproducers bruke rare-Codon-Rich markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Denne metoden gir et effektivt alternativ til den konvensjonelle analoge tilnærmingen til å oppnå aminosyreoverprodusere. Denne teknikken utkonkurrerer den tradisjonelle analoge metoden ved å gi nøyaktighet, følsomhet og høy gjennomstrømning samtidig. Denne metoden kaster nytt lys over å forstå aminosyre overproduksjonsstyrker og oversettelse av sjeldne kodoner og kan teoretisk brukes på alle mikroorganismer.Denne protokollen er for det meste avhengig av grunnleggende molekylære eksperimentelle operasjoner som er enkle å følge, men kan kreve flere studier for å oppnå egnet valg av anstrengende stringencies. En visuell demonstrasjon av denne teknikken gir en direkte forståelse av ytelsen til utvalget og et screeningsystem for å identifisere aminosyreprodusenter. For å begynne denne prosedyren, legg vektoren i markørfragmentene, på is, i et molarforhold på en til en til syv punkt fem mikroliter monteringsblanding til et totalt volum på ti mikroliter.Inkuber ved 50 grader Celsius i en time. Forvandle fem mikroliter av monteringsproduktet til 50 mikroliter komponentceller ved 42 grader Celsius i 30 sekunder. Gjenopprett cellene i Super Optimal kjøttkraft med Catabolite undertrykkelse medium på 37 grader Celsius i en time.Deretter, plate dem på LB Agar medium og inkubere over natten på 37 grader Celsius. Neste dag, bruk et foretrukket kommersielt sett for å isolere plasmid. Først forvandle 50 mikroliter av de kompetente cellene med en mikroliter plasmid som bærer vill-type KanR.Forvandle et annet sett av de kompetente cellene med plasmid som inneholder KanR RC 29 med alle leucinkodoner erstattet av den sjeldne codon CTA. Plate og inkuber cellekulturen som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter overfører du koloniene som huser det ville utvalgsmarkørgenet i det sjeldne kodonrike derivatet individuelt til fem milliliter fem ganger fortynnet LB-medium som inneholder kanamycin ved en konsentrasjon på 50 mikrogram per milliliter.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius mens du rister på 250 rpm. Deretter overfører du 200 mikroliter av hver av cellekulturene til en 96 brønnplate i triplikate på definerte tidspunkter. Bruk en plateleser til å måle OD600.Inokuler flekkene som skjuler KanR RC 29-markørgenet i to sett med fem milliliter av 0,2 x LB-mediet som inneholder kanamycin, med eller uten tilførsel av L-leucin. Tilsett L-leucin til et av mediene til en endelig konsentrasjon på ett gram per liter. Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius med risting ved 250 rpm og mål OD600 for hver kultur på definerte tidspunkter.Til å begynne med kan du transformere 50 mikroliter av foreldrestammen som brukes til mutagenese med en mikroliter plasmid som bærer den ville GFP-en eller den ville PPG-typen. Plate og inkuber cellekulturene som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter overfører koloniene individuelt til fem milliliter av riktig fortynnet LB-medium.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius med risting ved 250 rpm. For fluorescensmarkører, overfør 200 mikroliter av cellekulturene til en 96 godt klar bunnplate i triplicate på definerte tidspunkter. Mål OD600 i fluorescensen og beregn fluorescensintensiteten.For kromogene markører, måle fargeutviklingen av cellekulturene. Utfør fôringsanalysen som beskrevet tidligere, og mål fluorescensintensiteten eller fargeutviklingen på definerte tidspunkter. Først forvandle 50 mikroliter av mutantcellene med en mikroliter av plasmid bærer valgmarkøren KanR RC 29, eller screening markører GFP RC eller PPG RC. Deretter sentrifuger cellekulturene på 4000 ganger G i fem minutter.For valg, kast supernatant og tilsett fem milliliter på 0,2 x LB medium som inneholder kanamycin til celler som bærer utvalgsmarkøren. Inkuber prøven over natten i en shaker ved 37 grader Celsius. Neste dag, plate over natten kultur på 0,2 x LB agar medium som inneholder kanamycin og inkubere på 37 grader Celsius i 12 timer.For screening, plate riktig antall celler som skjuler screening markør på LB agar medium som inneholder riktig antibiotika. Inkuber ved 37 grader Celsius i åtte timer. Etter dette inokulerer LB-mediet som inneholder riktig antibiotika med hver enkelt koloni fra platen.Inkuber prøvene i en shaker ved 37 grader Celsius mens du rister på 250 rpm. Mål OD600 og fluorescensen og beregn fluorescensintensiteten hvis GFP RC brukes. Mål fargeutviklingen av cellekulturene hvis PPG RC brukes.For å verifisere aminosyreproduktivitetene til kandidatstammene, forberede frøkulturen ved å vaksinere fem milliliter LB-medium med hver av kandidatstammene og la cellene vokse over natten i en shaker ved 250 rpm og ved 37 grader Celsius. Neste dag høster du cellene fra en milliliter cellekultur ved å sentrifugere ved 4000 ganger G i to minutter. Kast den overnaturlige og resuspend paletten med en milliliter sterilt vann.Inokuler 20 milliliter M9 medium som inneholder fire prosent glukose med 200 mikroliter av cellesuspensjonen og inkubere i en 250 milliliter shaker ved 250 rpm og ved 37 grader Celsius i 24 timer. Neste dag sentrifugerer en milliliter av kulturmediet ved 4000 ganger G i fem minutter. Overfør 200 mikroliter av supernatanten til et rent 1,5 milliliter rør.Forbered L-leucin standardløsninger ved konsentrasjonene som vises her. I en røykhette legger du til 100 mikroliter med en millimolar trietylamin og 100 mikroliter av en molarfenylisothiocyanat til både supernatant og standardene. Bland løsningene forsiktig og inkuber dem ved romtemperatur i en time.Deretter legger du til 400 mikroliter n-heksan til samme rør og virvler det i ti sekunder. Den nedre fasen inneholder aminosyrederivatene og brukes til HPLC-analyse. Filtrer den nedre fasen gjennom 0,2 mikroliterpolytetrafluoretylenmembraner.Etter dette kjører du en mikroliter av prøven på en ultra HPLC utstyrt med en C18-kolonne med en strømningshastighet på 0,42 milliliter per minutt og ved kolonnetemperatur i 40 grader Celsius. Bruk en diodearraydetektor til å oppdage de målrettede aminosyrene på 254 nanometer og beregne konsentrasjonene ved å kartlegge toppområdene under standardkurven. I denne studien identifiseres aminosyreoverprodusere ved hjelp av sjeldne kodonrike markører for samtidig å oppnå nøyaktighet, følsomhet og høy gjennomstrømning.For valgsystemet bør en kraftig reduksjon i OD600 for stammer som huser det sjeldne kodonrike antibiotikaresistensgenet observeres i forhold til belastningen som skjuler villtypen. Hemming av sjelden kodon på proteinuttrykk foregår for det meste under sultne forhold. Etter ekstra fôring av tilsvarende aminosyre øker OD600 for belastningen som skjuler det sjeldne kodonrike antibiotikaresistensgenet betydelig.For screeningsystemet er fluorescensintensiteten i antall fluorescerende celler betydelig lavere for belastningen som uttrykker det fluorescerende proteinet fra det sjeldne kodonrike genet enn fra det ville genet. Fôring av tilsvarende aminosyre vil gjenopprette proteinuttrykk fra de sjeldne kodonrike genene. Når du bruker det lilla proteinet, er fargen utviklet fra den sjeldne kodonrike PPG lettere enn fra det ville genet.Det ufortynnede LB-mediet tillater langsomt uttrykk for den sjeldne kodonrike PPG uten L-leucinfôring i det uttrykte lilla proteinet blir synlig når cellene er pelleted. Dette skjuler imidlertid ikke det faktum at genuttrykk fra den sjeldne kodonrike PPG forsterkes ved fôring av L-leucin. Den sjeldne kodonbaserte strategien kan identifisere overprodusere av de målrettede aminosyrene fra mutasjonsbiblioteket, og disse mutantene bør produsere høyere mengder av de målrettede aminosyrene enn de overordnede stammene.Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å justere sjelden kodonfrekvens for å oppnå en klar diskriminering i OD eller farge mellom celler som huser de ville markører og de sjeldne kodonrike derivatene. Transkripsjonsanalyse og genomsekvensering kan brukes på de valgte stammene for å undersøke mekanismen knyttet til aminosyreproduksjoner. Ved hjelp av denne teknikken, aminosyre overprodusere kan effektivt identifiseres og analyse av deres genetiske informasjon ville gi ny innsikt i sine mekanismer bak aminosyre overproduksjoner.Aminosyre derivatisering kan være skadelig. Pass på å bruke hansker og verneklær og utføre disse trinnene i en røykhette.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks ved hjelp av betingelser som er egnet for oppbevaring av syre-labil beskyttelsesgrupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Isolering av Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profilering av potensielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimalisert inkorporering av Alkynyl fettsyreanaloger for påvisning av fettakylerte proteiner ved hjelp av klikkkjemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Folding og sondering av nukleinsyrekonstruksjoner

<meta charset="utf8"></head><body>Forutsi aminosyrepreferanser for protein-proteinbindingsgrensesnitt

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Forfatter Spotlight: En beregningstilnærming for å tyde aminosyrepreferanser i multispesifikke protein-protein-interaksjoner

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.