Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

O trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 21676026), a chave nacional R & D programa da China (Grant no. 2017YFD0201400), e da China pós-doutorado Science Foundation (Grant no. 2017M620643). Obras no Instituto de avanço da UCLA (Suzhou) foram apoiadas pelas subvenções internas da província de Jiangsu e parque industrial de Suzhou.

1. construção dos plasmís expressando os genes raros-Codon-ricos do marcador
<ol><li>Selecione um gene de marcador que contenha um número apropriado de códons comuns para o aminoácido alvo. Nota: para a L-leucina, o gene de resistência à kanamicina KanR, que contém 29 códons de leucina, dos quais 27 são códons comuns, é utilizado para a construção do sistema de seleção13. O gene GFP , que contém 17 códons comuns de 19 códons de leucina, ou o ge...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

O número de códons raros nos genes do marcador e o meio de seleção ou de triagem são críticos para inibir as expressões protéicas dos genes marcadores raros-Codon-modificados. Se não for detectada diferença significativa entre as expressões protéicas dos genes marcadores do tipo selvagem e seus derivados, aumentar o número de códons raros ou usar um meio limitado de nutrientes pode amplificar as diferenças. No entanto, se o efeito de inibição é muito forte, as expressões de proteínas não podem ser re...

A produção atual de aminoácidos depende muito da fermentação. No entanto, os títulos e rendimentos para a maioria das cepas de produção de aminoácidos estão abaixo das demandas crescentes do mercado global de aminoácidos que vale bilhões de dólares1,2. A obtenção de superprodutores de aminoácidos de alto desempenho é fundamental para a atualização da indústria de aminoácidos.
Estratégia tradicional para identificar produtores de aminoácidos explora as competições entre os aminoácidos e seus análogos na síntese protéica3,4. Estes análogos são capazes de carregar os tRNAs que reconhecem os aminoácidos correspondentes e, assim, inibir os alongamentos das cadeias peptídicas, levando ao crescimento preso ou morte celular5. Uma maneira de resistir às tensões analógicas é aumentar as concentrações de aminoácidos intracelulares. Os aminoácidos enriquecidos irão superar os análogos para os tRNAs finitos e garantir a correta síntese de proteínas funcionais. Conseqüentemente, as tensões que sobrevivem aos análogos podem ser selecionadas e são prováveis os overprodutores dos aminoácidos correspondentes.
Embora tenha sido bem sucedido na seleção de superprodutores de aminoácidos como L-leucina6, a estratégia baseada em analógico sofre de inconvenientes graves. Uma grande preocupação é a resistência analógica originada do processo de mutagenese ou através de mutações espontâneas. As cepas com resistência podem escapar da seleção bloqueando, exportando ou degradando os análogos5. Outra preocupação é os efeitos colaterais tóxicos dos análogos em outros processos celulares7. Como consequência, as cepas que sobrevivem à seleção analógica podem não ser os superprodutores de aminoácidos, enquanto os superprodutores desejados podem ser falsamente exterminados devido aos efeitos colaterais negativos.
Aqui, uma nova estratégia baseada na lei do viés de Codon é apresentada a fim de obter identificações precisas e rápidas de produtores de aminoácidos. A maioria de ácidos aminados são codificados por mais de um Triplet do nucleotide que seja favorecido diferentemente pelos organismos do anfitrião8,9. Alguns códons raramente são usados nas sequências de codificação e são referidos como os raros códons. Suas traduções em aminoácidos dependem dos tRNAs cognatos que carregam os aminoácidos correspondentes. Entretanto, os tRNAs que reconhecem os códons raros têm geralmente muito mais baixas abundâncias do que os tRNAs dos códons comuns10,11. Conseqüentemente, estes tRNAs raros são menos prováveis capturar os ácidos aminados livres nas competições com outros isoacceptors, e as traduções das seqüências raro-Codon-ricas começam a desacelerar ou mesmo são terminadas quando as quantidades de ácidos aminados são limitadas 10. as traduções poderiam, teoricamente, ser restauradas se houver um excedente de aminoácidos após o carregamento dos sinónimo comuns de tRNAs devido a superproduções ou a alimentações extras dos aminoácidos correspondentes12. Se o gene raro-Codon-rico codifica um marcador de seleção ou de triagem, as cepas que exibem os fenótipos correspondentes podem ser prontamente identificadas e são prováveis os superprodutores dos aminoácidos alvo.
A estratégia acima é aplicada para estabelecer uma seleção e um sistema de triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos. O sistema de seleção usa genes de resistência a antibióticos (por exemplo, KanR) como marcadores enquanto o sistema de triagem usa os genes que codificam as proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente [GFP]) ou cromogênica (por exemplo, prancerpurple). Os genes do marcador em ambos os sistemas são modificados substituindo números definidos dos códons comuns para o aminoácido alvejado com sua alternativa rara sinônimo. As tensões na biblioteca da mutação que abrigam o gene raro-Codon-rico do marcador são selecionadas ou examinadas circunstâncias apropriadas, e os overprodutores dos aminoácidos alvejados podem prontamente ser identificados. O fluxo de trabalho começa com a construção do raro-Codon-rico sistema de genes marcador, seguido pela otimização das condições de trabalho, e, em seguida, a identificação e verificação do aminoácido superprodutores. Esta estratégia analógico-independente é baseada no dogma na tradução da proteína e foi verificada praticamente para permitir identificações exatas e rápidas de overprodutores do ácido aminado. Teoricamente, poderia ser diretamente empregado para aminoácidos com códons raros e para todos os microrganismos. Ao todo, a estratégia rara-baseada em Codon servirá como uma alternativa eficiente à abordagem analógica convencional, quando análogos adequados para aminoácidos específicos não estão disponíveis, ou quando uma alta taxa de falsos positivos é a maior preocupação. O protocolo abaixo usa o Codon raro da leucina para demonstrar esta estratégia em identificar os superprodutores de Escherichia coli L-leucina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Para satisfazer o mercado cada vez maior de aminoácidos, são necessárias cepas de produção de alto desempenho. Os produtores de aminoácidos são identificados convencionalmente, aproveitando as competições entre os aminoácidos e seus análogos. Entretanto, este método analógico-baseado é da baixa exatidão, e os análogos apropriados para ácidos aminados específicos são limitados. Aqui, apresentamos uma estratégia alternativa que possibilita uma triagem precisa, sensível e de alta produtividade de produtores de aminoácidos que usam marcadores raros e ricos em Codon. Esta estratégia é inspirada pelo fenômeno do viés de uso de Codon na tradução de proteínas, para o qual os códons são categorizados em comum ou raros com base em suas freqüências de ocorrência no DNA de codificação. A tradução de raros códons depende de suas RNAs de transferência raras correspondentes (tRNAs), que não podem ser totalmente carregadas pelos aminoácidos cognatos a fome. Teoricamente, os raros tRNAs podem ser cobrados se houver um excedente dos aminoácidos após o carregamento dos isoaceptores comuns sinônimos. Conseqüentemente, as traduções causadas por códons raros podiam ser restauradas alimentando ou superproduçoes intracelular dos aminoácidos correspondentes. esta suposição, um sistema de seleção ou triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos é estabelecido através da substituição dos códons comuns dos aminoácidos alvo com suas alternativas raras sinônimos nos genes de resistência a antibióticos ou os genes codificando proteínas fluorescentes ou cromogênicas. Nós mostramos que as expressões da proteína podem extremamente ser impedidas pela incorporação de códons raros e que os níveis de proteínas correlacionam positivamente com as concentrações do ácido aminado. Usando este sistema, superprodutores de múltiplos aminoácidos podem ser prontamente selecionados a partir de bibliotecas de mutação. Esta estratégia rara-baseada em Codon exige somente um único gene modificado, e o anfitrião é menos provável escapar da seleção do que em outros métodos. Ele oferece uma abordagem alternativa para a obtenção de superprodutores de aminoácidos.

Para o sistema de seleção, uma diminuição acentuada no OD600 para cepas que abrigando o gene de resistência a antibióticos raro-Codon-rico deve ser observada em comparação com a cepa que abrigando o gene de resistência a antibióticos do tipo selvagem quando cultivado em um adequado médio (Figura 1a). Nas mesmas condições, a diminuição da célula OD600 torna-se mais evidente, pois o número de raros códons no gene da resis...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Este estudo apresenta uma estratégia alternativa para o método convencional de base analógica tóxica na identificação de superprodutores de aminoácidos usando marcadores raros-Codon-ricos para alcançar precisão, sensibilidade e alta taxa de transferência simultaneamente.

Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Este método fornece uma alternativa eficiente à abordagem convencional baseada em analógico na obtenção de superprodutores de aminoácidos. Esta técnica compensa o método tradicional baseado em analógico, fornecendo precisão, sensibilidade e alto rendimento simultaneamente. Este método lança uma nova luz sobre a compreensão dos pontos fortes da superprodução de aminoácidos e a tradução de códons raros e poderia, teoricamente, ser aplicado a todos os microrganismos.Este protocolo se baseia principalmente em operações experimentais moleculares básicas que são fáceis de seguir, mas podem exigir vários ensaios para alcançar a seleção adequada de stringencies de esforço. Uma demonstração visual dessa técnica oferece uma apreciação direta sobre o desempenho da seleção e um sistema de triagem na identificação dos produtores de aminoácidos. Para iniciar este procedimento, adicione o vetor nos fragmentos marcadores, no gelo, em uma razão molar de um a sete pontos cinco microliters de mistura de montagem a um volume total de dez microliters.Incubar a 50 graus Celsius por uma hora. Transforme cinco microliters do produto de montagem em 50 microliters de células componentes a 42 graus Celsius por 30 segundos. Recupere as células no caldo Super Ideal com o meio de repressão catabólica a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, emplaque-os no meio LB Agar e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use um kit comercial preferido para isolar o plasmídeo. Primeiro, transforme 50 microliters das células competentes com um microlitr de plasmídeo que carrega o KanR tipo selvagem.Transforme um segundo conjunto de células competentes com o plasmídeo contendo KanR RC 29 com todos os códons leucino substituídos pelo raro codon CTA. Prato e incubar a cultura celular como descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias que abrigam o gene marcador de seleção do tipo selvagem no derivado rico em codons individualmente em cinco mililitros de cinco vezes diluídos meio LB contendo kanamicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Em seguida, transfira 200 microliters de cada uma das culturas celulares para uma placa de 96 poços em triplicado em pontos de tempo definidos. Use um leitor de placas para medir o OD600.Inocular as manchas que abrigam o gene marcador KanR RC 29 em dois conjuntos de cinco mililitros do meio 0,2 x LB que contém kanamicina, com ou sem um suprimento de L-leucina. Adicione L-leucina a uma das mídias a uma concentração final de um grama por litro. Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm e medir o OD600 para cada cultura em pontos de tempo definidos.Para começar, transforme 50 microliters da cepa dos pais usados para mutagênese com um microliter de plasmídeo que carrega o GFP do tipo selvagem ou o PPG do tipo selvagem. Prato e incubar as culturas celulares conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias individualmente para cinco mililitros do meio LB devidamente diluído.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm. Para marcadores de fluorescência, transfira 200 microlitadores das culturas celulares para uma placa traseira inferior bem clara em triplicado em pontos de tempo definidos. Meça o OD600 na fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência.Para marcadores cromogênicos, meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares. Realize o ensaio de alimentação como descrito anteriormente e meça a intensidade da fluorescência ou o desenvolvimento da cor em pontos de tempo definidos. Primeiro, transforme 50 microliters das células mutantes com um microliter do plasmídeo carregando o marcador de seleção KanR RC 29, ou os marcadores de triagem GFP RC ou PPG RC. Em seguida, centrifugar as culturas celulares a 4000 vezes G por cinco minutos.Para seleção, descarte o supernasciente e adicione cinco mililitros de 0,2 x LB médio contendo kanamicina às células que carregam o marcador de seleção. Incubar a amostra durante a noite em um agitador a 37 graus Celsius. No dia seguinte, emplaque a cultura da noite para o 0,2 x lb ágar médio contendo kanamycin e incubar a 37 graus Celsius por 12 horas.Para triagem, emplaque o número apropriado de células que abrigam o marcador de triagem no meio ágar LB contendo o antibiótico apropriado. Incubar a 37 graus Celsius por oito horas. Depois disso, inocular o meio LB contendo o antibiótico apropriado com cada colônia da placa.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Meça o OD600 e a fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência se o GFP RC for usado. Meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares se o PPG RC for usado.Para verificar a produtividade do aminoácido das cepas candidatas, prepare a cultura das sementes inoculando cinco mililitros de meio LB com cada uma das cepas candidatas e deixe as células crescerem durante a noite em um shaker a 250 rpm e a 37 graus Celsius. No dia seguinte, colde as células de um mililitro da cultura celular centrifugando a 4000 vezes G por dois minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a paleta com um mililitro de água estéril.Inocular 20 mililitros de M9 médio contendo 4% de glicose com 200 microliters da suspensão celular e incubar em um shaker de 250 mililitros a 250 rpm e a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, centrífuga um mililitro do meio cultural a 4000 vezes G por cinco minutos. Transfira 200 microliters do supernatante para um tubo limpo de 1,5 mililitro.Prepare soluções padrão L-leucina nas concentrações aqui mostradas. Em um capô de fumaça, adicione 100 microlitadores de uma trietilamina milimillar e 100 microlitrais de um isothionato fenil molar tanto ao supernante quanto aos padrões. Misture as soluções suavemente e incuba-as à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, adicione 400 microliters de n-hexano ao mesmo tubo e vórtice por dez segundos. A fase inferior contém os derivados de aminoácidos e é usada para análise hplc. Filtre a fase inferior através de 0,2 microliter politetrafluoroetileno membranas.Depois disso, execute um microliter da amostra em um ultra HPLC equipado com uma coluna C18 com uma taxa de fluxo de 0,42 mililitros por minuto e à temperatura da coluna por 40 graus Celsius. Use um detector de matriz de diodo para detectar os aminoácidos direcionados a 254 nanômetros e calcular suas concentrações mapeando as áreas de pico sob a curva padrão. Neste estudo, os superprodutores de aminoácidos são identificados usando marcadores raros ricos em codon para alcançar simultaneamente precisão, sensibilidade e alto rendimento.Para o sistema de seleção, deve-se observar uma redução acentuada do OD600 para cepas que abrigam o raro gene de resistência a antibióticos rico em códons em comparação com a cepa que abriga o tipo selvagem. A inibição de códon raro em expressões proteicas ocorre principalmente sob condições de fome. Após alimentação extra do aminoácido correspondente, o OD600 para a cepa que abriga o raro gene de resistência a antibióticos rico em codon aumenta significativamente.Para o sistema de triagem, a intensidade da fluorescência no número de células fluorescentes é significativamente menor para a cepa que expressa a proteína fluorescente do raro gene rico em codon do que do gene do tipo selvagem. A alimentação do aminoácido correspondente restaurará expressões proteicas dos raros genes ricos em codon. Ao usar a proteína roxa, a cor desenvolvida a partir do raro PPG rico em códon é mais leve do que a do gene do tipo selvagem.O meio LB não diluído permite a expressão lenta do PPG raro rico em codon sem a alimentação L-leucina na proteína roxa expressa torna-se visível uma vez que as células são pelotas. No entanto, isso não esconde o fato de que a expressão genética do raro PPG rico em códons é reforçada pela alimentação da L-leucina. A rara estratégia baseada em codon poderia identificar superprodutores dos aminoácidos alvos da biblioteca de mutação e esses mutantes devem produzir quantidades maiores dos aminoácidos alvo do que as cepas dos pais.Ao tentar este procedimento, é importante ajustar a frequência rara de códon para obter uma clara discriminação no OD ou cor entre as células que abrigam os marcadores do tipo selvagem e os raros derivados ricos em codon. A análise de transcriptome e o sequenciamento do genoma poderiam ser aplicados às cepas selecionadas para investigar o mecanismo relacionado às produções de aminoácidos. Usando essa técnica, os superprodutores de aminoácidos poderiam ser identificados eficientemente e a análise de suas informações genéticas ofereceria novas percepções sobre seus mecanismos por trás das superproduções de aminoácidos.A derivatização de aminoácidos pode ser prejudicial. Certifique-se de usar luvas e roupas de proteção e realizar essas etapas em um capô de fumaça.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

A hidrólise de um Ni-base de Schiff complexa usando condies adequadas para a retenção dos grupos protectores ácido-lábil

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Estimativa do Teor de Lignina de Biomassa Vegetal usando Ácido Tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Dobramento e sondagem de construções de ácidos nucleicos

<meta charset="utf8"></head><body>Prevendo preferências de aminoácidos de interfaces de ligação proteína-proteína

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: uma abordagem computacional para decifrar preferências de aminoácidos em interações proteína-proteína multiespecíficas

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína