Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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O trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 21676026), a chave nacional R & D programa da China (Grant no. 2017YFD0201400), e da China pós-doutorado Science Foundation (Grant no. 2017M620643). Obras no Instituto de avanço da UCLA (Suzhou) foram apoiadas pelas subvenções internas da província de Jiangsu e parque industrial de Suzhou.

1. construção dos plasmís expressando os genes raros-Codon-ricos do marcador
<ol><li>Selecione um gene de marcador que contenha um número apropriado de códons comuns para o aminoácido alvo. Nota: para a L-leucina, o gene de resistência à kanamicina KanR, que contém 29 códons de leucina, dos quais 27 são códons comuns, é utilizado para a construção do sistema de seleção13. O gene GFP , que contém 17 códons comuns de 19 códons de leucina, ou o ge...

<ol>
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O número de códons raros nos genes do marcador e o meio de seleção ou de triagem são críticos para inibir as expressões protéicas dos genes marcadores raros-Codon-modificados. Se não for detectada diferença significativa entre as expressões protéicas dos genes marcadores do tipo selvagem e seus derivados, aumentar o número de códons raros ou usar um meio limitado de nutrientes pode amplificar as diferenças. No entanto, se o efeito de inibição é muito forte, as expressões de proteínas não podem ser re...

A produção atual de aminoácidos depende muito da fermentação. No entanto, os títulos e rendimentos para a maioria das cepas de produção de aminoácidos estão abaixo das demandas crescentes do mercado global de aminoácidos que vale bilhões de dólares1,2. A obtenção de superprodutores de aminoácidos de alto desempenho é fundamental para a atualização da indústria de aminoácidos.
Estratégia tradicional para identificar produtores de aminoácidos explora as competições entre os aminoácidos e seus análogos na síntese protéica3,4. Estes análogos são capazes de carregar os tRNAs que reconhecem os aminoácidos correspondentes e, assim, inibir os alongamentos das cadeias peptídicas, levando ao crescimento preso ou morte celular5. Uma maneira de resistir às tensões analógicas é aumentar as concentrações de aminoácidos intracelulares. Os aminoácidos enriquecidos irão superar os análogos para os tRNAs finitos e garantir a correta síntese de proteínas funcionais. Conseqüentemente, as tensões que sobrevivem aos análogos podem ser selecionadas e são prováveis os overprodutores dos aminoácidos correspondentes.
Embora tenha sido bem sucedido na seleção de superprodutores de aminoácidos como L-leucina6, a estratégia baseada em analógico sofre de inconvenientes graves. Uma grande preocupação é a resistência analógica originada do processo de mutagenese ou através de mutações espontâneas. As cepas com resistência podem escapar da seleção bloqueando, exportando ou degradando os análogos5. Outra preocupação é os efeitos colaterais tóxicos dos análogos em outros processos celulares7. Como consequência, as cepas que sobrevivem à seleção analógica podem não ser os superprodutores de aminoácidos, enquanto os superprodutores desejados podem ser falsamente exterminados devido aos efeitos colaterais negativos.
Aqui, uma nova estratégia baseada na lei do viés de Codon é apresentada a fim de obter identificações precisas e rápidas de produtores de aminoácidos. A maioria de ácidos aminados são codificados por mais de um Triplet do nucleotide que seja favorecido diferentemente pelos organismos do anfitrião8,9. Alguns códons raramente são usados nas sequências de codificação e são referidos como os raros códons. Suas traduções em aminoácidos dependem dos tRNAs cognatos que carregam os aminoácidos correspondentes. Entretanto, os tRNAs que reconhecem os códons raros têm geralmente muito mais baixas abundâncias do que os tRNAs dos códons comuns10,11. Conseqüentemente, estes tRNAs raros são menos prováveis capturar os ácidos aminados livres nas competições com outros isoacceptors, e as traduções das seqüências raro-Codon-ricas começam a desacelerar ou mesmo são terminadas quando as quantidades de ácidos aminados são limitadas 10. as traduções poderiam, teoricamente, ser restauradas se houver um excedente de aminoácidos após o carregamento dos sinónimo comuns de tRNAs devido a superproduções ou a alimentações extras dos aminoácidos correspondentes12. Se o gene raro-Codon-rico codifica um marcador de seleção ou de triagem, as cepas que exibem os fenótipos correspondentes podem ser prontamente identificadas e são prováveis os superprodutores dos aminoácidos alvo.
A estratégia acima é aplicada para estabelecer uma seleção e um sistema de triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos. O sistema de seleção usa genes de resistência a antibióticos (por exemplo, KanR) como marcadores enquanto o sistema de triagem usa os genes que codificam as proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente [GFP]) ou cromogênica (por exemplo, prancerpurple). Os genes do marcador em ambos os sistemas são modificados substituindo números definidos dos códons comuns para o aminoácido alvejado com sua alternativa rara sinônimo. As tensões na biblioteca da mutação que abrigam o gene raro-Codon-rico do marcador são selecionadas ou examinadas circunstâncias apropriadas, e os overprodutores dos aminoácidos alvejados podem prontamente ser identificados. O fluxo de trabalho começa com a construção do raro-Codon-rico sistema de genes marcador, seguido pela otimização das condições de trabalho, e, em seguida, a identificação e verificação do aminoácido superprodutores. Esta estratégia analógico-independente é baseada no dogma na tradução da proteína e foi verificada praticamente para permitir identificações exatas e rápidas de overprodutores do ácido aminado. Teoricamente, poderia ser diretamente empregado para aminoácidos com códons raros e para todos os microrganismos. Ao todo, a estratégia rara-baseada em Codon servirá como uma alternativa eficiente à abordagem analógica convencional, quando análogos adequados para aminoácidos específicos não estão disponíveis, ou quando uma alta taxa de falsos positivos é a maior preocupação. O protocolo abaixo usa o Codon raro da leucina para demonstrar esta estratégia em identificar os superprodutores de Escherichia coli L-leucina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Para satisfazer o mercado cada vez maior de aminoácidos, são necessárias cepas de produção de alto desempenho. Os produtores de aminoácidos são identificados convencionalmente, aproveitando as competições entre os aminoácidos e seus análogos. Entretanto, este método analógico-baseado é da baixa exatidão, e os análogos apropriados para ácidos aminados específicos são limitados. Aqui, apresentamos uma estratégia alternativa que possibilita uma triagem precisa, sensível e de alta produtividade de produtores de aminoácidos que usam marcadores raros e ricos em Codon. Esta estratégia é inspirada pelo fenômeno do viés de uso de Codon na tradução de proteínas, para o qual os códons são categorizados em comum ou raros com base em suas freqüências de ocorrência no DNA de codificação. A tradução de raros códons depende de suas RNAs de transferência raras correspondentes (tRNAs), que não podem ser totalmente carregadas pelos aminoácidos cognatos a fome. Teoricamente, os raros tRNAs podem ser cobrados se houver um excedente dos aminoácidos após o carregamento dos isoaceptores comuns sinônimos. Conseqüentemente, as traduções causadas por códons raros podiam ser restauradas alimentando ou superproduçoes intracelular dos aminoácidos correspondentes. esta suposição, um sistema de seleção ou triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos é estabelecido através da substituição dos códons comuns dos aminoácidos alvo com suas alternativas raras sinônimos nos genes de resistência a antibióticos ou os genes codificando proteínas fluorescentes ou cromogênicas. Nós mostramos que as expressões da proteína podem extremamente ser impedidas pela incorporação de códons raros e que os níveis de proteínas correlacionam positivamente com as concentrações do ácido aminado. Usando este sistema, superprodutores de múltiplos aminoácidos podem ser prontamente selecionados a partir de bibliotecas de mutação. Esta estratégia rara-baseada em Codon exige somente um único gene modificado, e o anfitrião é menos provável escapar da seleção do que em outros métodos. Ele oferece uma abordagem alternativa para a obtenção de superprodutores de aminoácidos.

Para o sistema de seleção, uma diminuição acentuada no OD600 para cepas que abrigando o gene de resistência a antibióticos raro-Codon-rico deve ser observada em comparação com a cepa que abrigando o gene de resistência a antibióticos do tipo selvagem quando cultivado em um adequado médio (Figura 1a). Nas mesmas condições, a diminuição da célula OD600 torna-se mais evidente, pois o número de raros códons no gene da resis...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Este estudo apresenta uma estratégia alternativa para o método convencional de base analógica tóxica na identificação de superprodutores de aminoácidos usando marcadores raros-Codon-ricos para alcançar precisão, sensibilidade e alta taxa de transferência simultaneamente.

Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Este método fornece uma alternativa eficiente à abordagem convencional baseada em analógico na obtenção de superprodutores de aminoácidos. Esta técnica compensa o método tradicional baseado em analógico, fornecendo precisão, sensibilidade e alto rendimento simultaneamente. Este método lança uma nova luz sobre a compreensão dos pontos fortes da superprodução de aminoácidos e a tradução de códons raros e poderia, teoricamente, ser aplicado a todos os microrganismos.Este protocolo se baseia principalmente em operações experimentais moleculares básicas que são fáceis de seguir, mas podem exigir vários ensaios para alcançar a seleção adequada de stringencies de esforço. Uma demonstração visual dessa técnica oferece uma apreciação direta sobre o desempenho da seleção e um sistema de triagem na identificação dos produtores de aminoácidos. Para iniciar este procedimento, adicione o vetor nos fragmentos marcadores, no gelo, em uma razão molar de um a sete pontos cinco microliters de mistura de montagem a um volume total de dez microliters.Incubar a 50 graus Celsius por uma hora. Transforme cinco microliters do produto de montagem em 50 microliters de células componentes a 42 graus Celsius por 30 segundos. Recupere as células no caldo Super Ideal com o meio de repressão catabólica a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, emplaque-os no meio LB Agar e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use um kit comercial preferido para isolar o plasmídeo. Primeiro, transforme 50 microliters das células competentes com um microlitr de plasmídeo que carrega o KanR tipo selvagem.Transforme um segundo conjunto de células competentes com o plasmídeo contendo KanR RC 29 com todos os códons leucino substituídos pelo raro codon CTA. Prato e incubar a cultura celular como descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias que abrigam o gene marcador de seleção do tipo selvagem no derivado rico em codons individualmente em cinco mililitros de cinco vezes diluídos meio LB contendo kanamicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Em seguida, transfira 200 microliters de cada uma das culturas celulares para uma placa de 96 poços em triplicado em pontos de tempo definidos. Use um leitor de placas para medir o OD600.Inocular as manchas que abrigam o gene marcador KanR RC 29 em dois conjuntos de cinco mililitros do meio 0,2 x LB que contém kanamicina, com ou sem um suprimento de L-leucina. Adicione L-leucina a uma das mídias a uma concentração final de um grama por litro. Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm e medir o OD600 para cada cultura em pontos de tempo definidos.Para começar, transforme 50 microliters da cepa dos pais usados para mutagênese com um microliter de plasmídeo que carrega o GFP do tipo selvagem ou o PPG do tipo selvagem. Prato e incubar as culturas celulares conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias individualmente para cinco mililitros do meio LB devidamente diluído.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm. Para marcadores de fluorescência, transfira 200 microlitadores das culturas celulares para uma placa traseira inferior bem clara em triplicado em pontos de tempo definidos. Meça o OD600 na fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência.Para marcadores cromogênicos, meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares. Realize o ensaio de alimentação como descrito anteriormente e meça a intensidade da fluorescência ou o desenvolvimento da cor em pontos de tempo definidos. Primeiro, transforme 50 microliters das células mutantes com um microliter do plasmídeo carregando o marcador de seleção KanR RC 29, ou os marcadores de triagem GFP RC ou PPG RC. Em seguida, centrifugar as culturas celulares a 4000 vezes G por cinco minutos.Para seleção, descarte o supernasciente e adicione cinco mililitros de 0,2 x LB médio contendo kanamicina às células que carregam o marcador de seleção. Incubar a amostra durante a noite em um agitador a 37 graus Celsius. No dia seguinte, emplaque a cultura da noite para o 0,2 x lb ágar médio contendo kanamycin e incubar a 37 graus Celsius por 12 horas.Para triagem, emplaque o número apropriado de células que abrigam o marcador de triagem no meio ágar LB contendo o antibiótico apropriado. Incubar a 37 graus Celsius por oito horas. Depois disso, inocular o meio LB contendo o antibiótico apropriado com cada colônia da placa.Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Meça o OD600 e a fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência se o GFP RC for usado. Meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares se o PPG RC for usado.Para verificar a produtividade do aminoácido das cepas candidatas, prepare a cultura das sementes inoculando cinco mililitros de meio LB com cada uma das cepas candidatas e deixe as células crescerem durante a noite em um shaker a 250 rpm e a 37 graus Celsius. No dia seguinte, colde as células de um mililitro da cultura celular centrifugando a 4000 vezes G por dois minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a paleta com um mililitro de água estéril.Inocular 20 mililitros de M9 médio contendo 4% de glicose com 200 microliters da suspensão celular e incubar em um shaker de 250 mililitros a 250 rpm e a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, centrífuga um mililitro do meio cultural a 4000 vezes G por cinco minutos. Transfira 200 microliters do supernatante para um tubo limpo de 1,5 mililitro.Prepare soluções padrão L-leucina nas concentrações aqui mostradas. Em um capô de fumaça, adicione 100 microlitadores de uma trietilamina milimillar e 100 microlitrais de um isothionato fenil molar tanto ao supernante quanto aos padrões. Misture as soluções suavemente e incuba-as à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, adicione 400 microliters de n-hexano ao mesmo tubo e vórtice por dez segundos. A fase inferior contém os derivados de aminoácidos e é usada para análise hplc. Filtre a fase inferior através de 0,2 microliter politetrafluoroetileno membranas.Depois disso, execute um microliter da amostra em um ultra HPLC equipado com uma coluna C18 com uma taxa de fluxo de 0,42 mililitros por minuto e à temperatura da coluna por 40 graus Celsius. Use um detector de matriz de diodo para detectar os aminoácidos direcionados a 254 nanômetros e calcular suas concentrações mapeando as áreas de pico sob a curva padrão. Neste estudo, os superprodutores de aminoácidos são identificados usando marcadores raros ricos em codon para alcançar simultaneamente precisão, sensibilidade e alto rendimento.Para o sistema de seleção, deve-se observar uma redução acentuada do OD600 para cepas que abrigam o raro gene de resistência a antibióticos rico em códons em comparação com a cepa que abriga o tipo selvagem. A inibição de códon raro em expressões proteicas ocorre principalmente sob condições de fome. Após alimentação extra do aminoácido correspondente, o OD600 para a cepa que abriga o raro gene de resistência a antibióticos rico em codon aumenta significativamente.Para o sistema de triagem, a intensidade da fluorescência no número de células fluorescentes é significativamente menor para a cepa que expressa a proteína fluorescente do raro gene rico em codon do que do gene do tipo selvagem. A alimentação do aminoácido correspondente restaurará expressões proteicas dos raros genes ricos em codon. Ao usar a proteína roxa, a cor desenvolvida a partir do raro PPG rico em códon é mais leve do que a do gene do tipo selvagem.O meio LB não diluído permite a expressão lenta do PPG raro rico em codon sem a alimentação L-leucina na proteína roxa expressa torna-se visível uma vez que as células são pelotas. No entanto, isso não esconde o fato de que a expressão genética do raro PPG rico em códons é reforçada pela alimentação da L-leucina. A rara estratégia baseada em codon poderia identificar superprodutores dos aminoácidos alvos da biblioteca de mutação e esses mutantes devem produzir quantidades maiores dos aminoácidos alvo do que as cepas dos pais.Ao tentar este procedimento, é importante ajustar a frequência rara de códon para obter uma clara discriminação no OD ou cor entre as células que abrigam os marcadores do tipo selvagem e os raros derivados ricos em codon. A análise de transcriptome e o sequenciamento do genoma poderiam ser aplicados às cepas selecionadas para investigar o mecanismo relacionado às produções de aminoácidos. Usando essa técnica, os superprodutores de aminoácidos poderiam ser identificados eficientemente e a análise de suas informações genéticas ofereceria novas percepções sobre seus mecanismos por trás das superproduções de aminoácidos.A derivatização de aminoácidos pode ser prejudicial. Certifique-se de usar luvas e roupas de proteção e realizar essas etapas em um capô de fumaça.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

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A hidrólise de um Ni-base de Schiff complexa usando condies adequadas para a retenção dos grupos protectores ácido-lábil

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Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

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Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimativa do Teor de Lignina de Biomassa Vegetal usando Ácido Tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...