Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 21676026), Национальной программой научных исследований и разработок Китая (грант No 2017YFD0201400) и Китайским фондом постдокторской науки (грант No 2017M620643). Работы в Институте развития UCLA (Сучжоу) были поддержаны внутренними грантами из провинции Цзянсу и индустриального парка Сучжоу.

1. Конструкция плазмидов, выражающих редко-кодон-богатые гены маркера
<ol><li>Выберите ген маркера, который содержит соответствующее количество общих кодонов для целевой аминокислоты. ПРИМЕЧАНИЕ: Для L-лейцина, ген резистентности канамицина kanR, который содержит 29 кодонов лей?...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Количество редких кодонов в генах маркеров и среда отбора или скрининга имеют решающее значение для ингибирования белковых выражений из редко-кодон-модифицированных генов маркера. Если не может быть обнаружено существенное различие между протеиновыми экспрессиями генов дикого типа ...

Нынешнее производство аминокислот в значительной степени зависит от брожения. Тем не менее, титры и дает для большинства штаммов производства аминокислот ниже растущих требований глобального рынка аминокислот, который стоит миллиарды долларов1,2. Получение высокопроизводительных аминокислотных производителей имеют решающее значение для модернизации аминокислотной промышленности.
Традиционная стратегия для выявления аминокислот overproducers использует конкуренции между аминокислотами и их аналогов в синтезе белка3,4. Эти аналоги способны заряжать tRNAs, которые распознают соответствующие аминокислоты и тем самым подавляют удлинение пептидных цепей, что приводит к арестованному росту или смерти клеток5. Одним из способов противостоять аналоговым стрессам является увеличение концентрации внутриклеточных аминокислот. Обогащенные аминокислоты превзойдят аналоги конечной тРНК и обеспечат правильный синтез функциональных белков. Таким образом, штаммы, которые выживают аналоги могут быть выбраны и, вероятно, overproducers соответствующих аминокислот.
Хотя оказался успешным в выборе overproducers для аминокислот, таких как L-лейцин6, аналоговая стратегия страдает от серьезных недостатков. Одной из основных проблем является аналоговое сопротивление, возникает из процесса мутагенеза или через спонтанные мутации. Штаммы с сопротивлением могут избежать выбора, блокируя, экспортируяили унижая аналоги 5. Еще одной проблемой является токсические побочные эффекты аналогов на другие клеточные процессы7. Как следствие, штаммы, которые выживают аналоговый выбор не может быть аминокислоты overproducers, в то время как желаемые overproducers могут быть ложно уничтожены из-за негативных побочных эффектов.
Здесь представлена новая стратегия, основанная на законе о предвзятом отношении кодона, с тем чтобы добиться точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Большинство аминокислот кодируются более чем одним нуклеотидным триплетом, которыйпо-разному благоприятствует организмам-хозяину 8,9. Некоторые кодоны редко используются в последовательности кодирования и называются редкими кодонами. Их переводы в аминокислоты опираются на коньяк tRNAs, которые несут соответствующие аминокислоты. Тем не менее, tRNAs, которые признают редкие кодоны обычно имеют гораздо меньше изобилия, чем tRNAs общих кодонов10,11. Следовательно, эти редкие tRNAs менее вероятно, чтобы захватить свободные аминокислоты в соревнованиях с другими изоастои, и переводы редких кодон-богатых последовательностей начинают замедляться или даже прекращаются, когда количество аминокислот ограничено 10. Переводы теоретически могут быть восстановлены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимных общих tRNAs из-за перепроизводства или дополнительных кормлений соответствующих аминокислот12. Если редкий богатый кодоном ген кодирует маркер выбора или скрининга, штаммы, демонстрирующие соответствующие фенотипы, могут быть легко идентифицированы и, вероятно, являются перепроизводителями целевых аминокислот.
Вышеупомянутая стратегия применяется для создания системы отбора и скрининга для идентификации производителей аминокислот. Система отбора использует гены устойчивости к антибиотикам (например, kanR) в качестве маркеров, в то время как система скрининга использует гены, кодирующие флуоресцентные (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хромагенные (например, PrancerPurple) белки. Гены маркеров в обеих системах модифицируются путем замены определенных чисел общих кодонов для целевой аминокислоты на ее синонимную редкую альтернативу. Штаммы в библиотеке мутаций, которые гавани редких кодон богатых маркер гена отбираются или скрининга при надлежащих условиях, и overproducers целевых аминокислот могут быть легко определены. Рабочий процесс начинается со построения редко-кодон-богатых маркера генной системы, а затем оптимизации условий труда, а затем выявление и проверка аминокислоты overproducers. Эта аналогово-независимая стратегия основана на догме в переводе белков и была практически проверена для точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Теоретически, он может быть непосредственно использован для аминокислот с редкими кодонами и для всех микроорганизмов. В целом стратегия на основе редкого кодона послужит эффективной альтернативой традиционному аналоговому подходу, когда отсутствуют надлежащие аналоги конкретных аминокислот или когда главной проблемой является высокая уровень ложного положительного уровня. Протокол ниже использует лейцин редкий кодон, чтобы продемонстрировать эту стратегию в выявлении Escherichia coli L-leucine overproducers.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Для удовлетворения постоянно растущего рынка аминокислот необходимы высокопроизводительные производственные штаммы. Аминокислоты overproducers условно определены путем использования конкуренции между аминокислотами и их аналогов. Однако этот аналоговый метод имеет низкую точность, а надлежащие аналоги для конкретных аминокислот ограничены. Здесь мы представляем альтернативную стратегию, которая позволяет точно, чувствительный и высокопроизводительный скрининг аминокислот с использованием редких кодон богатых маркеров. Эта стратегия вдохновлена феноменом смещения использования кодона в переводе белков, для которого кодоны классифицируются на общие или редкие на основе их частот возникновения в кодирующей ДНК. Перевод редких кодонов зависит от их соответствующих редких переносных РНК (tRNAs), которые не могут быть полностью заряжены аминокислотами cognate под голодом. Теоретически, редкие tRNAs могут быть заряжены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимов общих изоастежителей. Поэтому отсталые переводы, вызванные редкими кодонами, могут быть восстановлены путем кормления или внутриклеточного перепроизводства соответствующих аминокислот. Согласно этому предположению, система отбора или скрининга для выявления аминокислотных производителей устанавливается путем замены общих кодонов целевых аминокислот их синонимами редких альтернатив в генах устойчивости к антибиотикам или генах кодирование флуоресцентных или хромогенных белков. Мы показываем, что протеиновые экспрессии могут быть значительно затруднены включением редких кодонов и что уровни белков положительно коррелируют с аминокислотными концентрациями. Используя эту систему, перепроизводители нескольких аминокислот можно легко отсеивать из библиотек мутаций. Эта стратегия на основе редкого кодона требует только одного модифицированного гена, и усев с меньшей вероятностью избежит выделения, чем в других методах. Он предлагает альтернативный подход для получения аминокислотных производителей.

Для системы отбора, резкое снижение OD600 для штаммов укрывательство редких кодон-богатых антибиотиков устойчивость гена должны наблюдаться по сравнению с штаммом укрывательство дикого типа гена устойчивости к антибиотикам, когда культивируется в подходящих ср?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Это исследование представляет собой альтернативную стратегию к обычным токсичным аналоговым методом в выявлении аминокислотных сверхпроизводителей с помощью редких богатых кодон маркерами для достижения точности, чувствительности и высокой пропускной силы одновременно.

Выявление аминокислотных перепроизводителей с использованием редких Кодон-богатых маркеров

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Этот метод обеспечивает эффективную альтернативу традиционному аналоговому подходу в получении аминокислотных перепроизводов. Этот метод выходит из традиционного аналогового метода, обеспечивая точность, чувствительность и высокую пропускную способность одновременно. Этот метод проливает новый свет на понимание сильных сторон перепроизводства аминокислот и перевод редких кодонов и теоретически может быть применен ко всем микроорганизмам.Этот протокол опирается главным образом на основные молекулярно-экспериментальные операции, которые легко следовать, но может потребовать нескольких испытаний для того, чтобы достичь подходящего выбора напрягающих строк. Визуальная демонстрация этого метода дает прямую оценку эффективности отбора и системы скрининга при выявлении производителей аминокислот. Чтобы начать эту процедуру, добавьте вектор в фрагменты маркера, на льду, в молярном соотношении от одного до одного-семи тока пять микролитров сборки смешиваются с общим объемом десять микролитров.Инкубировать при 50 градусах по Цельсию в течение одного часа. Превратите пять микролитров сборочного продукта в 50 микролитров компонентных ячеек при 42 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Восстановление клеток в супер оптимальный бульон с Катаболит репрессии среды при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.Затем, пластины их на LB Агар среднего и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию. На следующий день используйте предпочтительный коммерческий комплект, чтобы изолировать плазмиду. Во-первых, трансформировать 50 микролитров компетентных клеток с одним микролитером плазмиды, которая несет дикий тип KanR.Преобразуй второй набор компетентных клеток с плазмидой, содержащей KanR RC 29 со всеми кодонами лейцина, замененными редким кодоном CTA. Плита и инкубация клеточной культуры, как указано в текстовом протоколе. Затем перенесите колонии, в которых находится ген маркера отбора дикого типа в богатой редким кодоном производные по отдельности, в пять миллилитров пятикратной разбавленной среды LB, содержащей канамицин при концентрации 50 микрограмм на миллилитр.Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Затем перенесите 200 микролитров каждой из клеточных культур в 96 хорошо пластины в тройной в определенных точках времени. Используйте считыватель пластин для измерения OD600.Прививка пятна укрывательство KanR RC 29 маркер гена в двух наборах из пяти миллилитров 0,2 х LB среды, которая содержит канамицин, с или без поставки L-лейцина. Добавьте L-лейцин в один из средств массовой информации к конечной концентрации одного грамма на литр. Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин и измерить OD600 для каждой культуры в определенных точках времени.Для начала преобразуй 50 микролитров родительского штамма, используемого для мутагенеза, с помощью одного микролитера плазмиды, который несет в себе GFP дикого типа или PPG дикого типа. Плита и инкубация клеточных культур, изложенных в текстовом протоколе. Затем перенесите колонии индивидуально на пять миллилитров правильно разбавленной среды LB.Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Для маркеров флуоресценции, передача 200 микролитров клеточных культур в 96 хорошо ясно нижней задней пластины в тройной в определенные точки времени. Измерьте OD600 при флуоресценции и рассчитайте интенсивность флуоресценции.Для хромогенных маркеров, измерить цвет развития клеточных культур. Выполните анализ кормления, как описано ранее, и измерьте интенсивность флуоресценции или развитие цвета в определенных точках времени. Во-первых, трансформировать 50 микролитров мутантных клеток с одним микролитером плазмиды с маркером отбора KanR RC 29, или скрининговые маркеры GFP RC или PPG RC. Далее центрифуга клеточных культур в 4000 раз G в течение пяти минут.Для выбора отбросьте супернатант и добавьте пять миллилитров среды 0,2 х LB, содержащей канамицин, в клетки с маркером отбора. Инкубировать образец на ночь в шейкере при 37 градусах по Цельсию. На следующий день, пластины ночной культуры на 0,2 х LB агар среды, содержащей канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 12 часов.Для скрининга, пластины соответствующее количество клеток укрывательство скрининг маркер на LB агар среды, содержащей соответствующий антибиотик. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение восьми часов. После этого, привить LB среды, содержащие соответствующие антибиотики с каждой отдельной колонии от пластины.Инкубировать образцы в шейкере при 37 градусах по Цельсию при тряске при 250 об/мин. Измерьте OD600 и флуоресценцию и рассчитайте интенсивность флуоресценции при использовании GFP RC. Измерьте развитие цвета клеточных культур, если используется PPG RC.Чтобы проверить аминокислоты производительности штаммов кандидата, подготовить семена культуры путем инокуляции пять миллилитров LB среды с каждым из кандидатов штаммов и пусть клетки растут на ночь в шейкере при 250 об / мин и при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, урожай клеток из одного миллилитра клеточной культуры путем центрифугирования в 4000 раз G в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте палитру одним миллилитром стерильной воды.Прививка 20 миллилитров M9 среды, содержащей четыре процента глюкозы с 200 микролитров клеточной подвески и инкубировать в 250 миллилитров шейкер при 250 об / мин и при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день центрифуга один миллилитр среды культуры на 4000 раз G в течение пяти минут. Перенесите 200 микролитров супернатанта в чистую 1,5 миллилитровую трубку.Подготовье стандартных решений L-лейцина в концентрациях, показанных здесь. В дымовой капот добавьте 100 микролитров одного миллимоляра триэтиламина и 100 микролитров одного моларного фенила изотиоцианата как к супернатанту, так и к стандартам. Смешайте растворы осторожно и инкубировать их при комнатной температуре в течение одного часа.Затем добавьте 400 микролитров n-hexane в ту же трубку и вихрем его в течение десяти секунд. Нижняя фаза содержит аминокислотные производные и используется для анализа HPLC. Фильтр нижней фазы через 0,2 микролитровых полиэтиленовых мембран.После этого запустите один микролитр образца на ультра HPLC, оснащенном колонкой C18 со скоростью потока 0,42 миллилитров в минуту и при температуре колонки 40 градусов по Цельсию. Используйте детектор диодного массива для обнаружения целевых аминокислот на 254 нанометров и расчета их концентраций путем картирования пиковых областей в соответствии со стандартной кривой. В этом исследовании, аминокислоты overproducers определены с помощью редких кодон богатых маркеров одновременно достичь точности, чувствительности и высокой пропускной способности.Для системы отбора следует наблюдать резкое снижение OD600 для штаммов, питающих редкий ген устойчивости к антибиотикам, богатый кодоном, по сравнению с штаммом, укрывавным дикий тип. Ингибирование редкого кодона на белковых выражениях в основном происходит в голодных условиях. После дополнительного кормления соответствующей аминокислоты, OD600 для штамма укрывательство редких кодон богатых антибиотиков устойчивость гена значительно возрастает.Для системы скрининга интенсивность флуоресценции в количестве флуоресцентных клеток значительно ниже для штамма, который выражает флуоресцентный белок из редкого гена, богатого кодоном, чем из гена дикого типа. Кормление соответствующей аминокислоты восстановит белковые выражения из редких генов, богатых кодоном. При использовании фиолетового белка цвет, разработанный из редкой PPG, богатой кодоном, легче, чем у гена дикого типа.Неразбавленная среда LB позволяет медленное выражение редкой PPG, богатой кодоном, без L-лейцинового кормления в выраженном фиолетовом белке становится видимым после того, как клетки гранулированы. Тем не менее, это не скрывает того факта, что экспрессия генов из редких кодон богатых PPG усиливается путем кормления L-лейцина. Редкая стратегия на основе кодона может выявить перепроизводов целевых аминокислот из библиотеки мутаций, и эти мутанты должны производить большее количество целевых аминокислот, чем родительские штаммы.При попытке этой процедуры, важно настроить частоту редкого кодона для достижения четкой дискриминации в OD или цвет между клетками укрывательство диких маркеров типа и редких codon богатых производных. Транскриптомный анализ и секвенирование генома могут быть применены к выбранным штаммам для исследования механизма, связанного с аминокислотными производствами. Используя этот метод, аминокислоты overproducers могут быть эффективно определены и анализ их генетической информации будет предлагать новые идеи в свои механизмы за аминокислоты перепроизводства.Аминокислотная производная может быть вредной. Убедитесь в том, чтобы носить перчатки и защитную одежду и выполнять эти шаги в дым капот.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

подготовки и<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование тестовое активность на основе для<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Кислота амидазные

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Используя Этилен-рилизинг-соединение, 2-Chloroethylphosphonic кислота, в качестве инструмента для изучения Этилен ответа бактерий

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Флуорометрия с фиксацией напряжения в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Гидролиз Ni-Шифф-Base комплекс Использование Условия Пригодные для удержания кислотно-лабильных защитных групп

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Изоляция гистона от ткани листьев сорго для Top Down Масс Спектрометрия Профилирование потенциальных эпигенетических маркеров

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...