Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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El trabajo fue apoyado conjuntamente por la National Natural Science Foundation of China (subvención no 21676026), el Programa Nacional de I+D Clave de China (concesión no 2017YFD0201400) y la China Postdoctoral Science Foundation (concesión no 2017M620643). Las obras en el Instituto de Avance de la UCLA (Suzhou) fueron apoyadas por las subvenciones internas de la provincia de Jiangsu y el Parque Industrial de Suzhou.

1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros
<ol><li>Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido. NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kanR, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección13. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codon...

<ol>
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El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresione...

La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.
La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos y sus análogos en la síntesis de proteínas 3,4. Estos análogos son capaces de cargar los tRNA que reconocen los aminoácidos correspondientes y así inhibir las elongaciones de las cadenas de péptidos, lo que conduce a un crecimiento detenido o muerte celular5. Una manera de resistir las tensiones analógicas es aumentar las concentraciones de aminoácidos intracelulares. Los aminoácidos enriquecidos superarán a los análogos para los tRNA finitos y asegurarán la síntesis correcta de proteínas funcionales. Por lo tanto, las cepas que sobreviven a los análogos pueden ser seleccionados y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos correspondientes.
Aunque resultó exitoso en la selección de los sobreproductores para aminoácidos como L-leucina6, la estrategia basada en analógico sufren de graves inconvenientes. Una preocupación importante es la resistencia analógica originada por el proceso de mutagénesis o a través de mutaciones espontáneas. Las cepas con resistencia pueden escapar de la selección bloqueando, exportando o degradando los análogos5. Otra preocupación son los efectos secundarios tóxicos de los análogos en otros procesos celulares7. Como consecuencia, las cepas que sobreviven a la selección analógica pueden no ser los sobreproductores de aminoácidos, mientras que los sobreproductores deseados podrían ser falsamente exterminados debido a los efectos secundarios negativos.
Aquí, se presenta una estrategia novedosa basada en la ley del sesgo de codón con el fin de lograr identificaciones precisas y rápidas de los sobreproductores de aminoácidos. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un triplete de nucleótidos que es favorecido de manera diferente por los organismos huésped8,9. Algunos codones rara vez se utilizan en las secuencias de codificación y se conocen como los codones raros. Sus traducciones en aminoácidos se basan en los tRNAs cognados que llevan los aminoácidos correspondientes. Sin embargo, los arnms que reconocen codones raros suelen tener abundancias mucho más bajas que los arba de los codones comunes10,11. En consecuencia, estos raros tRNAs son menos propensos a capturar los aminoácidos libres en las competiciones con otros isoaceptadores, y las traducciones de las secuencias ricas en codón raro comienzan a desacelerar se o incluso se terminan cuando las cantidades de aminoácidos son limitadas 10. Las traducciones podrían, teóricamente, restaurarse si hay un excedente de aminoácidos después de cargar los TRNA comunes sinónimos debido a sobreproducciones o alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes12. Si el gen rico en codón raro codifica un marcador de selección o cribado, las cepas que presentan los fenotipos correspondientes pueden identificarse fácilmente y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos.
La estrategia anterior se aplica para establecer una selección y un sistema de cribado para la identificación de los sobreproductores de aminoácidos. El sistema de selección utiliza genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanR) como marcadores, mientras que el sistema de cribado utiliza los genes que codifican las proteínas fluorescentes fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes [GFP]) o cromogénicas (por ejemplo, PrancerPurple). Los genes marcadores en ambos sistemas se modifican reemplazando los números definidos de los codones comunes para el aminoácido dirigido por su rara alternativa sinónima. Las cepas de la biblioteca de mutaciones que albergan el gen marcador rico en codón raro se seleccionan o examinan en condiciones adecuadas, y los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos pueden ser fácilmente identificados. El flujo de trabajo comienza con la construcción del sistema genético marcador rico en codón poco raro, seguido de la optimización de las condiciones de trabajo, y luego la identificación y verificación de los aminoácidos sobreproductores. Esta estrategia independiente del análogo se basa en el dogma en la traducción de proteínas y se ha verificado prácticamente para permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Teóricamente, podría emplearse directamente a aminoácidos con codones raros y a todos los microorganismos. En total, la estrategia basada en codón raro servirá como una alternativa eficiente al enfoque convencional basado en analógico cuando los análogos adecuados para aminoácidos específicos no están disponibles, o cuando una alta tasa de falsos positivos es la principal preocupación. El siguiente protocolo utiliza leucina rara codón para demostrar esta estrategia en la identificación de los sobreproductores de Escherichia coli L-leucina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.

Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de600 OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD600 celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de cod...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.

Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Este método proporciona una alternativa eficiente al enfoque analógico convencional en la obtención de sobreproductores de aminoácidos. Esta técnica supera el método tradicional basado en analógico al proporcionar precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente. Este método arroja nueva luz sobre la comprensión de las fuerzas de sobreproducción de aminoácidos y la traducción de codones raros y podría, teóricamente, aplicarse a todos los microorganismos.Este protocolo se basa principalmente en operaciones experimentales moleculares básicas que son fáciles de seguir, pero pueden requerir múltiples ensayos para lograr la selección adecuada de cuerdas de esfuerzo. Una demostración visual de esta técnica ofrece una apreciación directa sobre el rendimiento de la selección y un sistema de cribado en la identificación de productores de aminoácidos. Para comenzar este procedimiento, agregue el vector en los fragmentos de marcador, sobre hielo, en una relación molar de uno a uno a siete microlitros de punto de mezcla de ensamblaje a un volumen total de diez microlitros.Incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Transforme cinco microlitros del producto de ensamblaje en 50 microlitros de células de componentes a 42 grados Celsius durante 30 segundos. Recupera las células en caldo Super Optimal con medio de represión catabolita a 37 grados centígrados durante una hora.Luego, platéalos en medio de agar LB e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice un kit comercial preferido para aislar el plásmido. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células competentes con un microlitro de plásmido que lleva el KanR de tipo salvaje.Transformar un segundo conjunto de las células competentes con el plásmido que contiene KanR RC 29 con todos los codones de leucina reemplazados por el raro codón CTA. Placa e incubar el cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias que albergan el gen marcador de selección de tipo salvaje en el derivado rico en codón raro individualmente en cinco mililitros de medio LB diluido cinco veces que contiene kanamicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Luego, transfiera 200 microlitros de cada uno de los cultivos celulares a una placa de 96 pozos en triplicado en puntos de tiempo definidos. Utilice un lector de placas para medir el OD600.Inocular las manchas que albergan el gen marcador KanR RC 29 en dos conjuntos de cinco mililitros del medio de 0,2 x LB que contiene kanamicina, con o sin suministro de L-leucina. Añadir L-leucina a uno de los medios a una concentración final de un gramo por litro. Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados celsius con agitación a 250 rpm y medir el OD600 para cada cultivo en puntos de tiempo definidos.Para empezar, transformar 50 microlitros de la cepa principal utilizada para la mutagénesis con un microlitro de plásmido que lleva el tipo salvaje GFP o el PPG de tipo salvaje. Placa e incubar los cultivos celulares como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias individualmente a cinco mililitros del medio LB correctamente diluido.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados con agitación a 250 rpm. Para marcadores de fluorescencia, transfiera 200 microlitros de los cultivos celulares a una placa posterior inferior de 96 bien clara en triplicado en puntos de tiempo definidos. Mida el OD600 en la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia.Para los marcadores cromogénicos, mida el desarrollo del color de los cultivos celulares. Realice el ensayo de alimentación como se describió anteriormente y mida la intensidad de fluorescencia o el desarrollo del color en puntos de tiempo definidos. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células mutantes con un microlitro del plásmido que lleva el marcador de selección KanR RC 29, o los marcadores de cribado GFP RC o PPG RC. A continuación, centrifugar los cultivos celulares a 4000 veces G durante cinco minutos.Para la selección, deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de 0,2 x medio LB que contengan kanamicina a las celdas que llevan el marcador de selección. Incubar la muestra durante la noche en una coctelera a 37 grados centígrados. Al día siguiente, plato el cultivo durante la noche en 0.2 x LB medio de agar que contiene kanamicina e incubar a 37 grados Celsius durante 12 horas.Para el cribado, plate el número adecuado de células que albergan el marcador de cribado en el medio de agar LB que contiene el antibiótico adecuado. Incubar a 37 grados centígrados durante ocho horas. Después de esto, inocular el medio LB que contiene el antibiótico apropiado con cada colonia de la placa.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de fluorescencia si se utiliza GFP RC. Mida el desarrollo del color de los cultivos celulares si se utiliza PPG RC.Para verificar las productividades de aminoácidos de las cepas candidatas, preparar el cultivo de semillas inoculando cinco mililitros de medio LB con cada una de las cepas candidatas y dejar que las células crezcan durante la noche en un agitador a 250 rpm y a 37 grados celsius. Al día siguiente, cosecha las células de un mililitro del cultivo celular centrifugando a 4000 veces G durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender la paleta con un mililitro de agua estéril.Inocular 20 mililitros de medio M9 que contienen un cuatro por ciento de glucosa con 200 microlitros de la suspensión celular e incubar en un agitador de 250 mililitros a 250 rpm y a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, centrifugar un mililitro del medio de cultivo a 4000 veces G durante cinco minutos. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros.Preparar soluciones estándar de L-leucina en las concentraciones mostradas aquí. En una campana de humo, agregue 100 microlitros de un trietilamina mililar y 100 microlitros de un isotiocianato de fenilo molar tanto al sobrenadante como a las normas. Mezclar las soluciones suavemente e incubarlas a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, añadir 400 microlitros de n-hexano al mismo tubo y vórtice durante diez segundos. La fase inferior contiene los derivados de aminoácidos y se utiliza para el análisis de HPLC. Filtrar la fase inferior a través de 0,2 membranas de politetrafluoroetileno microlitros.Después de esto, ejecute un microlitro de la muestra en un ultra HPLC equipado con una columna C18 con un caudal de 0,42 mililitros por minuto y a temperatura de columna para 40 grados centígrados. Utilice un detector de matriz de diodos para detectar los aminoácidos objetivo a 254 nanómetros y calcular sus concentraciones mapeando las áreas de pico debajo de la curva estándar. En este estudio, los sobreproductores de aminoácidos se identifican mediante el uso de marcadores raros ricos en codón para lograr simultáneamente precisión, sensibilidad y alto rendimiento.Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de OD600 para las cepas que albergan el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón en comparación con la cepa que alberga el tipo salvaje. La inhibición del codón raro en las expresiones proteicas se lleva a cabo principalmente en condiciones de hambre. Después de la alimentación adicional del aminoácido correspondiente, el OD600 para la cepa que alberga el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón aumenta significativamente.Para el sistema de cribado, la intensidad de la fluorescencia en el número de células fluorescentes es significativamente menor para la cepa que expresa la proteína fluorescente del gen rico en codón raro que del gen de tipo salvaje. La alimentación del aminoácido correspondiente restaurará las expresiones proteicas de los raros genes ricos en codón. Cuando se utiliza la proteína púrpura, el color desarrollado a partir del RARO PPG rico en codón es más ligero que el del gen de tipo salvaje.El medio LB sin diluir permite la expresión lenta del PPG raro rico en codón sin alimentación de L-leucina en la proteína púrpura expresada se hace visible una vez que las células se peleen. Sin embargo, esto no oculta el hecho de que la expresión génica del rara PPG rica en codón se mejora mediante la alimentación de la L-leucina. La rara estrategia basada en codón podría identificar los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos de la biblioteca de mutaciones y estos mutantes deben producir cantidades más altas de los aminoácidos dirigidos que las cepas madre.Al intentar este procedimiento, es importante ajustar la frecuencia rara del codón para lograr una clara discriminación en el OD o color entre las células que albergan los marcadores de tipo salvaje y los derivados raros ricos en codón. El análisis de transcriptoma y la secuenciación del genoma podrían aplicarse a las cepas seleccionadas para investigar el mecanismo relacionado con las producciones de aminoácidos. Usando esta técnica, los sobreproductores de aminoácidos podrían ser identificados eficientemente y el análisis de su información genética ofrecería nuevas perspectivas sobre sus mecanismos detrás de las sobreproducciones de aminoácidos.La derivación de aminoácidos podría ser perjudicial. Asegúrese de usar guantes y la ropa protectora y realice estos pasos en una campana de humos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hidrólisis de un Ni-Schiff-base compleja usando condiciones adecuadas para la retención de los grupos protectores lábiles en medio ácido

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

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Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Aislamiento de histone del tejido de la hoja de sorgo para la perfilación de espectrometría de masas de arriba hacia abajo de marcadores epigenéticos potenciales

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

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Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...