Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
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El trabajo fue apoyado conjuntamente por la National Natural Science Foundation of China (subvención no 21676026), el Programa Nacional de I+D Clave de China (concesión no 2017YFD0201400) y la China Postdoctoral Science Foundation (concesión no 2017M620643). Las obras en el Instituto de Avance de la UCLA (Suzhou) fueron apoyadas por las subvenciones internas de la provincia de Jiangsu y el Parque Industrial de Suzhou.

1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros
<ol><li>Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido. NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kanR, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección13. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codon...

<ol>
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El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresione...

La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.
La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos y sus análogos en la síntesis de proteínas 3,4. Estos análogos son capaces de cargar los tRNA que reconocen los aminoácidos correspondientes y así inhibir las elongaciones de las cadenas de péptidos, lo que conduce a un crecimiento detenido o muerte celular5. Una manera de resistir las tensiones analógicas es aumentar las concentraciones de aminoácidos intracelulares. Los aminoácidos enriquecidos superarán a los análogos para los tRNA finitos y asegurarán la síntesis correcta de proteínas funcionales. Por lo tanto, las cepas que sobreviven a los análogos pueden ser seleccionados y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos correspondientes.
Aunque resultó exitoso en la selección de los sobreproductores para aminoácidos como L-leucina6, la estrategia basada en analógico sufren de graves inconvenientes. Una preocupación importante es la resistencia analógica originada por el proceso de mutagénesis o a través de mutaciones espontáneas. Las cepas con resistencia pueden escapar de la selección bloqueando, exportando o degradando los análogos5. Otra preocupación son los efectos secundarios tóxicos de los análogos en otros procesos celulares7. Como consecuencia, las cepas que sobreviven a la selección analógica pueden no ser los sobreproductores de aminoácidos, mientras que los sobreproductores deseados podrían ser falsamente exterminados debido a los efectos secundarios negativos.
Aquí, se presenta una estrategia novedosa basada en la ley del sesgo de codón con el fin de lograr identificaciones precisas y rápidas de los sobreproductores de aminoácidos. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un triplete de nucleótidos que es favorecido de manera diferente por los organismos huésped8,9. Algunos codones rara vez se utilizan en las secuencias de codificación y se conocen como los codones raros. Sus traducciones en aminoácidos se basan en los tRNAs cognados que llevan los aminoácidos correspondientes. Sin embargo, los arnms que reconocen codones raros suelen tener abundancias mucho más bajas que los arba de los codones comunes10,11. En consecuencia, estos raros tRNAs son menos propensos a capturar los aminoácidos libres en las competiciones con otros isoaceptadores, y las traducciones de las secuencias ricas en codón raro comienzan a desacelerar se o incluso se terminan cuando las cantidades de aminoácidos son limitadas 10. Las traducciones podrían, teóricamente, restaurarse si hay un excedente de aminoácidos después de cargar los TRNA comunes sinónimos debido a sobreproducciones o alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes12. Si el gen rico en codón raro codifica un marcador de selección o cribado, las cepas que presentan los fenotipos correspondientes pueden identificarse fácilmente y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos.
La estrategia anterior se aplica para establecer una selección y un sistema de cribado para la identificación de los sobreproductores de aminoácidos. El sistema de selección utiliza genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanR) como marcadores, mientras que el sistema de cribado utiliza los genes que codifican las proteínas fluorescentes fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes [GFP]) o cromogénicas (por ejemplo, PrancerPurple). Los genes marcadores en ambos sistemas se modifican reemplazando los números definidos de los codones comunes para el aminoácido dirigido por su rara alternativa sinónima. Las cepas de la biblioteca de mutaciones que albergan el gen marcador rico en codón raro se seleccionan o examinan en condiciones adecuadas, y los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos pueden ser fácilmente identificados. El flujo de trabajo comienza con la construcción del sistema genético marcador rico en codón poco raro, seguido de la optimización de las condiciones de trabajo, y luego la identificación y verificación de los aminoácidos sobreproductores. Esta estrategia independiente del análogo se basa en el dogma en la traducción de proteínas y se ha verificado prácticamente para permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Teóricamente, podría emplearse directamente a aminoácidos con codones raros y a todos los microorganismos. En total, la estrategia basada en codón raro servirá como una alternativa eficiente al enfoque convencional basado en analógico cuando los análogos adecuados para aminoácidos específicos no están disponibles, o cuando una alta tasa de falsos positivos es la principal preocupación. El siguiente protocolo utiliza leucina rara codón para demostrar esta estrategia en la identificación de los sobreproductores de Escherichia coli L-leucina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.

Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de600 OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD600 celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de cod...

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Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.

Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Este método proporciona una alternativa eficiente al enfoque analógico convencional en la obtención de sobreproductores de aminoácidos. Esta técnica supera el método tradicional basado en analógico al proporcionar precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente. Este método arroja nueva luz sobre la comprensión de las fuerzas de sobreproducción de aminoácidos y la traducción de codones raros y podría, teóricamente, aplicarse a todos los microorganismos.Este protocolo se basa principalmente en operaciones experimentales moleculares básicas que son fáciles de seguir, pero pueden requerir múltiples ensayos para lograr la selección adecuada de cuerdas de esfuerzo. Una demostración visual de esta técnica ofrece una apreciación directa sobre el rendimiento de la selección y un sistema de cribado en la identificación de productores de aminoácidos. Para comenzar este procedimiento, agregue el vector en los fragmentos de marcador, sobre hielo, en una relación molar de uno a uno a siete microlitros de punto de mezcla de ensamblaje a un volumen total de diez microlitros.Incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Transforme cinco microlitros del producto de ensamblaje en 50 microlitros de células de componentes a 42 grados Celsius durante 30 segundos. Recupera las células en caldo Super Optimal con medio de represión catabolita a 37 grados centígrados durante una hora.Luego, platéalos en medio de agar LB e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice un kit comercial preferido para aislar el plásmido. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células competentes con un microlitro de plásmido que lleva el KanR de tipo salvaje.Transformar un segundo conjunto de las células competentes con el plásmido que contiene KanR RC 29 con todos los codones de leucina reemplazados por el raro codón CTA. Placa e incubar el cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias que albergan el gen marcador de selección de tipo salvaje en el derivado rico en codón raro individualmente en cinco mililitros de medio LB diluido cinco veces que contiene kanamicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Luego, transfiera 200 microlitros de cada uno de los cultivos celulares a una placa de 96 pozos en triplicado en puntos de tiempo definidos. Utilice un lector de placas para medir el OD600.Inocular las manchas que albergan el gen marcador KanR RC 29 en dos conjuntos de cinco mililitros del medio de 0,2 x LB que contiene kanamicina, con o sin suministro de L-leucina. Añadir L-leucina a uno de los medios a una concentración final de un gramo por litro. Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados celsius con agitación a 250 rpm y medir el OD600 para cada cultivo en puntos de tiempo definidos.Para empezar, transformar 50 microlitros de la cepa principal utilizada para la mutagénesis con un microlitro de plásmido que lleva el tipo salvaje GFP o el PPG de tipo salvaje. Placa e incubar los cultivos celulares como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias individualmente a cinco mililitros del medio LB correctamente diluido.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados con agitación a 250 rpm. Para marcadores de fluorescencia, transfiera 200 microlitros de los cultivos celulares a una placa posterior inferior de 96 bien clara en triplicado en puntos de tiempo definidos. Mida el OD600 en la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia.Para los marcadores cromogénicos, mida el desarrollo del color de los cultivos celulares. Realice el ensayo de alimentación como se describió anteriormente y mida la intensidad de fluorescencia o el desarrollo del color en puntos de tiempo definidos. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células mutantes con un microlitro del plásmido que lleva el marcador de selección KanR RC 29, o los marcadores de cribado GFP RC o PPG RC. A continuación, centrifugar los cultivos celulares a 4000 veces G durante cinco minutos.Para la selección, deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de 0,2 x medio LB que contengan kanamicina a las celdas que llevan el marcador de selección. Incubar la muestra durante la noche en una coctelera a 37 grados centígrados. Al día siguiente, plato el cultivo durante la noche en 0.2 x LB medio de agar que contiene kanamicina e incubar a 37 grados Celsius durante 12 horas.Para el cribado, plate el número adecuado de células que albergan el marcador de cribado en el medio de agar LB que contiene el antibiótico adecuado. Incubar a 37 grados centígrados durante ocho horas. Después de esto, inocular el medio LB que contiene el antibiótico apropiado con cada colonia de la placa.Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de fluorescencia si se utiliza GFP RC. Mida el desarrollo del color de los cultivos celulares si se utiliza PPG RC.Para verificar las productividades de aminoácidos de las cepas candidatas, preparar el cultivo de semillas inoculando cinco mililitros de medio LB con cada una de las cepas candidatas y dejar que las células crezcan durante la noche en un agitador a 250 rpm y a 37 grados celsius. Al día siguiente, cosecha las células de un mililitro del cultivo celular centrifugando a 4000 veces G durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender la paleta con un mililitro de agua estéril.Inocular 20 mililitros de medio M9 que contienen un cuatro por ciento de glucosa con 200 microlitros de la suspensión celular e incubar en un agitador de 250 mililitros a 250 rpm y a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, centrifugar un mililitro del medio de cultivo a 4000 veces G durante cinco minutos. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros.Preparar soluciones estándar de L-leucina en las concentraciones mostradas aquí. En una campana de humo, agregue 100 microlitros de un trietilamina mililar y 100 microlitros de un isotiocianato de fenilo molar tanto al sobrenadante como a las normas. Mezclar las soluciones suavemente e incubarlas a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, añadir 400 microlitros de n-hexano al mismo tubo y vórtice durante diez segundos. La fase inferior contiene los derivados de aminoácidos y se utiliza para el análisis de HPLC. Filtrar la fase inferior a través de 0,2 membranas de politetrafluoroetileno microlitros.Después de esto, ejecute un microlitro de la muestra en un ultra HPLC equipado con una columna C18 con un caudal de 0,42 mililitros por minuto y a temperatura de columna para 40 grados centígrados. Utilice un detector de matriz de diodos para detectar los aminoácidos objetivo a 254 nanómetros y calcular sus concentraciones mapeando las áreas de pico debajo de la curva estándar. En este estudio, los sobreproductores de aminoácidos se identifican mediante el uso de marcadores raros ricos en codón para lograr simultáneamente precisión, sensibilidad y alto rendimiento.Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de OD600 para las cepas que albergan el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón en comparación con la cepa que alberga el tipo salvaje. La inhibición del codón raro en las expresiones proteicas se lleva a cabo principalmente en condiciones de hambre. Después de la alimentación adicional del aminoácido correspondiente, el OD600 para la cepa que alberga el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón aumenta significativamente.Para el sistema de cribado, la intensidad de la fluorescencia en el número de células fluorescentes es significativamente menor para la cepa que expresa la proteína fluorescente del gen rico en codón raro que del gen de tipo salvaje. La alimentación del aminoácido correspondiente restaurará las expresiones proteicas de los raros genes ricos en codón. Cuando se utiliza la proteína púrpura, el color desarrollado a partir del RARO PPG rico en codón es más ligero que el del gen de tipo salvaje.El medio LB sin diluir permite la expresión lenta del PPG raro rico en codón sin alimentación de L-leucina en la proteína púrpura expresada se hace visible una vez que las células se peleen. Sin embargo, esto no oculta el hecho de que la expresión génica del rara PPG rica en codón se mejora mediante la alimentación de la L-leucina. La rara estrategia basada en codón podría identificar los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos de la biblioteca de mutaciones y estos mutantes deben producir cantidades más altas de los aminoácidos dirigidos que las cepas madre.Al intentar este procedimiento, es importante ajustar la frecuencia rara del codón para lograr una clara discriminación en el OD o color entre las células que albergan los marcadores de tipo salvaje y los derivados raros ricos en codón. El análisis de transcriptoma y la secuenciación del genoma podrían aplicarse a las cepas seleccionadas para investigar el mecanismo relacionado con las producciones de aminoácidos. Usando esta técnica, los sobreproductores de aminoácidos podrían ser identificados eficientemente y el análisis de su información genética ofrecería nuevas perspectivas sobre sus mecanismos detrás de las sobreproducciones de aminoácidos.La derivación de aminoácidos podría ser perjudicial. Asegúrese de usar guantes y la ropa protectora y realice estos pasos en una campana de humos.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hidrólisis de un Ni-Schiff-base compleja usando condiciones adecuadas para la retención de los grupos protectores lábiles en medio ácido

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Aislamiento de histone del tejido de la hoja de sorgo para la perfilación de espectrometría de masas de arriba hacia abajo de marcadores epigenéticos potenciales

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Plegamiento y sondeo de construcciones de ácidos nucleicos

<meta charset="utf8"></head><body>Predicción de las preferencias de aminoácidos de las interfaces de unión proteína-proteína

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Un enfoque computacional para descifrar las preferencias de aminoácidos en interacciones multiespecíficas proteína-proteína

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Predicción computacional de las preferencias de aminoácidos de dominios de unión a péptidos potencialmente multiespecíficos implicados en las interacciones proteína-proteína