Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Verket stöddes gemensamt av Kinas National Natural Science Foundation (Grant nr 21676026), Kinas nationella nyckel R & D-program (Grant No. 2017YFD0201400), och China postdoc Science Foundation (Grant No. 2017M620643). Verk i UCLA Institute of avancemang (Suzhou) stöddes av de interna bidragen från Jiangsu-provinsen och Suzhou Industrial Park.

1. uppbyggnad av plasmiderna som uttrycker de sällsynta-kodon-rika markörgener
<ol><li>Välj en markörgen som innehåller ett lämpligt antal av de gemensamma kodons för den riktade aminosyran. Anmärkning: för L-leucin, kanamycin Resistance Gene kanR, som innehåller 29 leucin Codons, varav 27 är vanliga kodons, används för att bygga urvals systemet13. Den GFP -genen, som innehåller 17 vanliga kodons av 19 leucin kodon, eller den lila protein-kodning gen...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Antalet sällsynta kodons i markörgener och urvalet eller screening mediet är avgörande för att hämma proteinuttryck från de sällsynta-kodon-modifierade markörgener. Om ingen signifikant skillnad kan påvisas mellan proteinuttryck från Wild-typ markörerna gener och deras derivat, öka antalet sällsynta kodons eller använda ett näringsämne-begränsat medium kan förstärka skillnaderna. Men om hämnings effekten är för stark, kan proteinhalten inte återvinnas även genom extra matning av motsvarande amino...

Den nuvarande produktionen av aminosyror är starkt beroende av jäsning. Men de titrar och avkastningen för de flesta aminosyra produktions stammar är lägre än de stigande kraven på den globala aminosyran marknaden som är värd miljarder dollar1,2. Att få högpresterande aminosyra överproducenter är avgörande för uppgraderingen av aminosyran industrin.
Traditionell strategi för att identifiera aminosyran överproducenter utnyttjar tävlingar mellan aminosyror och deras analoger i proteinsyntes3,4. Dessa analoger kan ladda tRNAs som erkänner motsvarande aminosyror och därmed hämma förlängningen av peptidkedjor, vilket leder till arresterad tillväxt eller celldöd5. Ett sätt att motstå de analoga påfrestningarna är att öka koncentrationerna av intracellulära aminosyror. De berikade aminosyrorna kommer att konkurrera ut de analoger för den ändliga tRNAs och säkerställa en korrekt syntes av funktionella proteiner. Därför, stammar som överlever de analoger kan väljas och är sannolikt överproducenterna av motsvarande aminosyror.
Även visat sig vara framgångsrik i valet av överproducenter för aminosyror såsom L-leucine6, den analoga-baserade strategin lider av allvarliga nackdelar. Ett stort bekymmer är det analoga motståndet som härstammar från processen med mutagenes eller genom spontana mutationer. Stammar med resistens kan undgå urvalet genom att blockera, exportera eller försämra den analoger5. Ett annat bekymmer är de giftiga biverkningarna av analoger på andra cellulära processer7. Som en följd, stammar som överlever den analoga urvalet kan inte vara aminosyran överproducenter, medan de önskade överproducenterna kan vara falskt utrotade på grund av de negativa biverkningarna.
Här presenteras en ny strategi som bygger på lagen i kodon bias för att uppnå noggranna och snabba identifieringar av aminosyra överproducenter. Mest amino syror kodas av mer än en nukleotid tripleten som gynnas olikt av värdorganismerna8,9. Vissa kodons används sällan i kodning sekvenser och kallas sällsynta kodons. Deras översättningar till aminosyror förlitar sig på den besläktat tRNAs som bär motsvarande aminosyror. TRNAs som känner igen sällsynta kodon har dock vanligtvis mycket lägre abundans än tRNAs i den gemensamma kodons10,11. Följaktligen är dessa sällsynta tRNAs mindre benägna att fånga de fria aminosyrorna i tävlingarna med andra isoacceptorer, och översättningar av de sällsynta-Codon-rika sekvenserna börjar bromsa eller till och med avslutas när mängden aminosyror är begränsade 10. översättningarna kan, teoretiskt, återställas om det finns en aminosyra överskott efter laddning av synonyma gemensamma tRNAs på grund av overproductions eller extra matning av motsvarande aminosyror12. Om den sällsynta-kodon-rika genen kodar en urvals-eller screening markör, kan stammar som uppvisar motsvarande fenotyper sedan lätt identifieras och är sannolikt överproducenterna av de riktade aminosyrorna.
Strategin ovan tillämpas för att fastställa ett urval och ett screening system för identifiering av överproducenter av aminosyror. Urvals systemet använder gener för antibiotikaresistens (t. ex. kanR) som markörer medan screening systemet använder de gener som kodar för fluorescerande (t. ex. grönt fluorescerande protein [GFP]) eller kromogent (t. ex. prancerpurple) proteiner. Markörerna gener i båda systemen modifieras genom att ersätta definierade nummer av de gemensamma kodons för den riktade aminosyran med dess synonymt sällsynt alternativ. Stammar i Mutations biblioteket som hyser den sällsynta-kodon-rika markör genen väljs eller screenas under lämpliga förhållanden, och överproducenterna av de riktade aminosyrorna kan lätt identifieras. Arbetsflödet börjar med byggandet av sällsynta-Codon-rika markörgen systemet, följt av optimering av arbetsförhållanden, och sedan identifiering och verifiering av aminosyran överproducenter. Denna analoga-oberoende strategi är baserad på dogmen i protein översättning och har praktiskt taget verifierats för att möjliggöra noggranna och snabba identifieringar av aminosyra överproducenter. Teoretiskt, det kan vara direkt anställd till aminosyror med sällsynta kodons och till alla mikroorganismer. I alla, den sällsynta-kodon-baserade strategin kommer att fungera som ett effektivt alternativ till den konventionella analoga-baserade metoden när korrekt analoger för specifika aminosyror är otillgängliga, eller när en hög falsk positiv ränta är den stora oro. Protokollet nedan använder leucin sällsynt kodon att demonstrera denna strategi för att identifiera Escherichia coli L-leucin överproducenter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

För att tillfredsställa den ständigt växande marknaden för aminosyror, hög prestanda produktions stammar behövs. De Amino Acid överproducenterna identifieras konventionellt genom att utnyttja tävlingar mellan aminosyror och deras analoger. Emellertid, denna analoga-baserade metoden är av låg noggrannhet, och korrekt analoger för specifika aminosyror är begränsade. Här presenterar vi en alternativ strategi som möjliggör en noggrann, känslig och hög genomströmning screening av aminosyran överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer. Denna strategi är inspirerad av fenomenet kodon användning bias i protein översättning, som kodons kategoriseras i vanliga eller sällsynta sådana baserat på deras frekvenser av förekomst i kodning DNA. Översättningen av sällsynta kodons beror på deras motsvarande sällsynta överföring rnas (tRNAs), som inte kan laddas helt av den besläktat aminosyror under svält. Teoretiskt kan den sällsynta tRNAs laddas om det finns ett överskott av aminosyrorna efter laddning av synonyma vanliga isoacceptorer. Därför, fördröjda översättningar orsakade av sällsynta kodons kunde återställas genom utfodring eller intracellulära överproduktioner av motsvarande aminosyror. Enligt detta antagande, ett urvals-eller screening system för att identifiera aminosyra överproducenter fastställs genom att ersätta de gemensamma kodons av de riktade aminosyror med sina synonyma sällsynta alternativ i antibiotikaresistens gener eller gener kodning av fluorescerande eller kromogena proteiner. Vi visar att proteinhalten kan hindras kraftigt av införlivandet av sällsynta kodons och att nivåerna av proteiner korrelerar positivt med aminosyrekoncentrationerna. Med hjälp av detta system kan överproducenter av flera aminosyror lätt screenas ut från Mutations bibliotek. Denna sällsynta-kodon-baserade strategi kräver bara en enda modifierad gen, och värden är mindre benägna att undkomma urvalet än i andra metoder. Det erbjuder en alternativ metod för att få aminosyran överproducenter.

För urvals systemet, en kraftig minskning av OD600 för stammar härda den sällsynta-Codon-rika antibiotikaresistens genen bör observeras i jämförelse med stammen härbärgen den vildtyp antibiotikaresistens genen när odlade i en lämplig medium (figur 1a). Under samma förhållanden, minskningen i cell OD600 blir mer uppenbar eftersom antalet sällsynta kodons i antibiotikaresistensgen ökar (figur 1a...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Denna studie presenterar en alternativ strategi för konventionell toxisk analog-baserad metod för att identifiera aminosyra överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer för att uppnå noggrannhet, känslighet och hög genomströmning samtidigt.

Identifiera aminosyran Överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Denna metod ger ett effektivt alternativ till den konventionella analog-baserade metoden för att erhålla aminosyra överproducenter. Denna teknik konkurrerar ut den traditionella analog-baserade metoden genom att ge noggrannhet, känslighet och högt dataflöde samtidigt. Denna metod kastar nytt ljus på förståelse aminosyra överproduktion styrkor och översättning av sällsynta kodon och kunde, teoretiskt, tillämpas på alla mikroorganismer.Detta protokoll bygger främst på grundläggande molekylära experimentella operationer som är lätta att följa men kan kräva flera försök för att uppnå lämpligt urval av ansträngande stringenser. En visuell demonstration av denna teknik ger en direkt uppskattning på utförandet av urvalet och ett screeningsystem i att identifiera aminosyra producenter. För att börja detta förfarande, lägg till vektorn i markörfragmenten, på is, i ett molarförhållande av en till en till sju punkt fem mikroliter av monteringsmix till en total volym av tio mikroliter.Inkubera vid 50 grader Celsius i en timme. Omvandla fem mikroliter av monteringsprodukten till 50 mikroliter av komponentceller vid 42 grader Celsius i 30 sekunder. Återhämta cellerna i Super Optimal buljong med Katabolit förtryck medium vid 37 grader Celsius i en timme.Sedan, platta dem på LB Agar medium och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Nästa dag, använd en föredragen kommersiell kit för att isolera plasmid. Först omvandla 50 mikroliter av de behöriga cellerna med en mikroliter av plasmid som bär vild-typ KanR.Omvandla en andra uppsättning av de behöriga cellerna med plasmid som innehåller KanR RC 29 med alla leucin kodon ersatt av den sällsynta kodon CTA. Platta och inkubera cellkulturen som den skisseras i textprotokollet. Överför därefter kolonierna som hyser markörgenen för vildtyp i det sällsynta kodonrika derivatet individuellt i fem milliliter femfaldigt utspädd LB-medium som innehåller kanamycin i en koncentration av 50 mikrogram per milliliter.Inkubera proverna i en skakmaskin vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 250 rpm. Överför sedan 200 mikroliter av var och en av cellkulturerna till en 96 brunnsplatta i tre exemplar vid definierade tidpunkter. Använd en tallriksläsare för att mäta OD600.Inokulera fläckarna som hyser Markörgenen KanR RC 29 i två uppsättningar av fem milliliter av 0,2 x LB-mediet som innehåller kanamycin, med eller utan en leverans av L-leucin. Lägg till L-leucin till en av media till en slutlig koncentration av ett gram per liter. Inkubera proverna i en skakmaskin vid 37 grader Celsius med skakningar vid 250 rpm och mät OD600 för varje kultur vid definierade tidspunkter.Till att börja med omvandla 50 mikroliter av den förälder stam som används för mutagenes med en mikroliter av plasmid som bär den vilda typ GFP eller vild-typ PPG. Platta och inkubera cellkulturerna som de skisseras i textprotokollet. Därefter överför kolonierna individuellt till fem milliliter av det korrekt utspädda LB-mediet.Inkubera proverna i en skakmaskin vid 37 grader Celsius med skakningar vid 250 rpm. För fluorescensmarkörer överför du 200 mikroliter av cellkulturerna till en 96 väl klar bottenbakplatta i tre exemplar vid definierade tidspunkter. Mät OD600 i fluorescensen och beräkna fluorescensintensiteten.För kromogena markörer, mäta cellkulturers färgutveckling. Utför matningsanalysen enligt tidigare beskrivna och mät fluorescensintensiteten eller färgutvecklingen vid definierade tidspunkter. Först omvandla 50 mikroliter av de muterade cellerna med en mikroliter av plasmid bär markeringsmarkören KanR RC 29, eller screening markörer GFP RC eller PPG RC. Därefter centrifuger cellkulturerna vid 4000 gånger G i fem minuter.För urval, kassera supernatanten och tillsätt fem milliliter 0,2 x LB-medium som innehåller kanamycin till celler som bär markeringsmarkören. Inkubera provet över natten i en skakmaskin vid 37 grader Celsius. Nästa dag, platta natten kulturen på 0,2 x LB agar medium som innehåller kanamycin och inkubera vid 37 grader Celsius i 12 timmar.För screening, platta lämpligt antal celler som hyser screening markör på LB agar medium som innehåller lämplig antibiotika. Inkubera vid 37 grader Celsius i åtta timmar. Efter detta, inokulera LB-medium som innehåller lämplig antibiotika med varje enskild koloni från plattan.Inkubera proverna i en skakmaskin vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 250 rpm. Mät OD600 och fluorescensen och beräkna fluorescensintensiteten om GFP RC används. Mät cellkulturens färgutveckling om PPG RC används.För att verifiera aminosyrans produktiviteter, förbereda frökultur genom att inokubera fem milliliter LB-medium med var och en av kandidaterna stammar och låt cellerna växa över natten i en shaker på 250 rpm och vid 37 grader Celsius. Nästa dag skördar du cellerna från en milliliter av cellkulturen genom att centrifugera vid 4000 gånger G i två minuter. Kasta supernatanten och resuspend paletten med en milliliter sterilt vatten.Inokulera 20 milliliter M9-medium som innehåller fyra procent glukos med 200 mikroliter av cellupphängningen och inkubera i en 250 milliliterskask på 250 rpm och vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Nästa dag centrifug en milliliter av odlingsmediet vid 4000 gånger G i fem minuter. Överför 200 mikroliter av supernatanten till ett rent 1,5 milliliterrör.Förbered L-leucin standardlösningar vid de koncentrationer som visas här. I en fumuv, tillsätt 100 mikroliter av en millimolar trietylamin och 100 mikroliter av en molar fenyl isothiocyanate till både supernatant och normerna. Blanda lösningarna försiktigt och inkubera dem i rumstemperatur i en timme.Sedan, tillsätt 400 mikroliter av n-hexan till samma rör och virvel det i tio sekunder. Den lägre fasen innehåller aminosyraderivaten och används för HPLC-analys. Filtrera den nedre fasen genom 0,2 mikroliter polytetrafluoretenmembran.Efter detta kör du en mikroliter av provet på en ultra HPLC utrustad med en C18-kolumn med en flödeshastighet på 0,42 milliliter per minut och vid kolumntemperatur i 40 grader Celsius. Använd en diod array detektor för att upptäcka de riktade aminosyrorna vid 254 nanometer och beräkna deras koncentrationer genom att kartlägga toppområdena under standardkurvan. I denna studie, aminosyra överproducenter identifieras genom att använda sällsynta kodon-rika markörer för att samtidigt uppnå noggrannhet, känslighet, och hög genomströmning.För urvalssystemet bör en kraftig minskning av OD600 för stammar som hyser den sällsynta kodonrika antibiotikaresistensgenen observeras i jämförelse med den stam som hyser vildtyp. Hämningen av sällsynta kodon på proteinuttryck sker mestadels under utsvultna förhållanden. Efter extra utfodring av motsvarande aminosyra, OD600 för stammen hyser sällsynta kodon-rika antibiotikaresistens genen ökar avsevärt.För screeningsystemet är fluorescensintensiteten i antalet fluorescerande celler betydligt lägre för den stam som uttrycker det fluorescerande proteinet från den sällsynta kodonrika genen än från den vilda genen. Utfodring av motsvarande aminosyra kommer att återställa proteinuttryck från de sällsynta kodonrika generna. När du använder det lila proteinet är färgen som utvecklats från den sällsynta kodonrika PPG lättare än den från vildtypsgenen.Det outspädda LB-mediet tillåter långsamt uttryck av den sällsynta kodonrika PPG utan L-leucin utfodring i det uttryckta lila proteinet blir synlig när cellerna är pelleterade. Detta döljer dock inte det faktum att genuttryck från den sällsynta kodonrika PPG förstärks genom utfodring av L-leucin. Den sällsynta kodonbaserade strategin skulle kunna identifiera överproducenter av de riktade aminosyrorna från mutationsbiblioteket och dessa mutanter bör producera högre mängder av de riktade aminosyrorna än moderstammarna.När du försöker detta förfarande, är det viktigt att justera sällsynta kodon frekvens för att uppnå en tydlig diskriminering i OD eller färg mellan celler som hyser wild-typ markörer och de sällsynta kodonrika derivat. Transkriptomanalys och genomsekvensering kunde tillämpas på de valda stammarna för att undersöka mekanismen som är relaterad till aminosyraproduktioner. Med hjälp av denna teknik, aminosyra överproducenter kan identifieras effektivt och analys av deras genetiska information skulle erbjuda nya insikter i deras mekanismer bakom aminosyra överproduktioner.Aminosyra härledning kan vara skadligt. Se till att använda handskar och skyddskläderna och utför dessa steg i en draghuva.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Spänningsklämma Fluorometry in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyter Användande Fluorescerande Onaturliga Aminosyror

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hydrolys av en Ni-Schiff-Base Complex Använda betingelser som är lämpliga för Bibehållande av syralabil skydds Grupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Isolering av histon från Sorghum Leaf Tissue för top down masspektrometriprofilering av potentiella epigenetiska markörer

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimerad inkorporering av alkynylfettsyraanaloger för detektion av fettacylaterade proteiner med hjälp av klickkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Veckning och sondering av nukleinsyrakonstruktioner

<meta charset="utf8"></head><body>Förutsäga aminosyrapreferenser för protein-proteinbindande gränssnitt

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Författare Spotlight: En beräkningsmetod för att dechiffrera aminosyrapreferenser i multispecifika protein-proteininteraktioner

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Beräkningsbaserad prediktion av aminosyrapreferenser för potentiellt multispecifika peptidbindande domäner som är involverade i protein-proteininteraktioner