Name: identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

İş ortaklaşa Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 21676026), ulusal anahtar R & D programı Çin (Grant No. 2017YFD0201400) ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (Grant No. 2017M620643) tarafından desteklenmektedir. UCLA Gelişim Enstitüsü 'nde (Suzhou) çalışan Jiangsu Eyaleti ve Suzhou Industrial Park iç hibe tarafından desteklenmektedir.

1. nadir-Codon zengin Marker genler ifade plazmidler inşaatı
<ol><li>Hedeflenen amino asit için ortak codonlar uygun sayıda içeren bir işaret geni seçin. Not: L-lösin için, hangi 27 yaygın codons olan 29 lösin codons içeren kanamyisin direnç gen kanR, seçim sisteminin inşası için kullanılır13. 19 lösin codondan 17 ortak Codon içeren Gfp geni veya 14 lösin ortak codonların bulunduğu mor protein-kodlama geni prancerpurple (PPG</e...

<ol>
	<li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).</li><li>Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+global+situation+of+amino+acids+in+industry.">Present global situation of amino acids in industry.</a> Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).</li><li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production.">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li><li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies.">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li><li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids:+a+focus+on+metabolic+engineering.">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li><li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+metabolisms,+and+applications+of+L-proline+analogues.">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li><li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+genetic+code.">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li><li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+but+not+the+same:+the+causes+and+consequences+of+codon+bias.">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li><li>Dittmar, K. A., S&#248;rensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino&#8208;acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino&#8208;acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage.">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li><li>S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel++and+Rel&#8722;+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel&#8722; strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers.">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).</li><li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign:+rapid,+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes.">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li><li>Xiong, A. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences.">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis.">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li><li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability.">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li><li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering.">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li><li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria.">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li><li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharging+tRNAs:+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli.">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li><li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli.">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li><li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli:+an+analysis+of+three+mutants.">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li><li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change.">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li><li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G&#8226;+U+pair.">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G&#8226; U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507 (2014).</li><li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome.">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li><li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+on+codon+bias.">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li><li>Huo, Y. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux.">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).</li></ol>

Marker genler ve seçim veya tarama Orta nadir kodon sayısı nadir-Codon-modifiye Marker genler protein ifadeleri inhibe etmek için önemlidir. Vahşi tip Marker genler ve türevlerinden protein ifadeleri arasında önemli bir fark tespit edilemez, nadir codonlar sayısını artırarak veya bir besin sınırlı orta kullanarak farklılıkları güçlendirebilir. Ancak, inhibisyon etkisi çok güçlü ise, protein ifadeleri bile karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslenme tarafından kurtarılabilir olmayabilir. B...

Amino asitler mevcut üretim fermantasyon üzerinde ağır dayanır. Ancak, çoğu amino asit üretim suşları için yazılar ve verimler milyarlarca dolar değerinde küresel amino asit piyasasının yükselen taleplerinin altındadır1,2. Yüksek performanslı amino asit aşırı üreticileri elde etmek için amino asit endüstrisinin yükseltilmesi önemlidir.
Amino asit aşırı üreticileri tanımlamak için geleneksel strateji amino asitler ve protein sentezinde onların analogları arasındaki yarışmalar yararlanırlar3,4. Bu analoglar karşılık gelen amino asitler tanımak ve böylece peptid zincirleri uzaması inhibe tRNAs şarj edebiliyoruz, tutuklandı büyüme veya hücre ölümü5yol. Analog streslere karşı bir yol, hücre içi amino asitlerin konsantrasyonlarını artırmaktır. Zenginleştirilmiş amino asitler sonlu tRNAs için analogları aşacak ve fonksiyonel proteinlerin doğru sentezini sağlamaktır. Bu nedenle, analoglar hayatta suşları seçilebilir ve ilgili amino asitlerin overüreticiler muhtemeldir.
L-leucine6gibi amino asitler için overüreticiler seçiminde başarılı olmasına rağmen, analog tabanlı strateji ciddi dezavantajları muzdarip. Bir büyük endişe analog direnç mutagenez işleminden kaynaklanan veya spontan mutasyonlar yoluyla. Direnç ile suşları engelleme, ihracat veya analoglar5aşağılayıcı tarafından seçim kaçabilir. Başka bir endişe diğer hücresel süreçlerde analogların toksik yan etkileri7. Sonuç olarak, analog seçimden hayatta kalan suşlar amino asit overüreticileri olmayabilir, istenilen overüreticileri olumsuz yan etkileri nedeniyle yanlışlıkla imha olabilir iken.
Burada, kodon önyargı yasasına dayalı bir yeni strateji amino asit overüreticilerinin doğru ve hızlı kimliklere ulaşmak için sunulmuştur. Çoğu amino asitler, ev sahibi organizmaların8,9tarafından farklı bir şekilde tercih edilen birden fazla nükl üçlüsü tarafından kodlanmıştır. Bazı kodlar, kodlama dizilerinde nadiren kullanılır ve nadir kodlar olarak adlandırılır. Amino asitler içine çevirileri ilgili amino asitler taşıyan bilat tRNAs güveniyor. Ancak, nadir codonlar tanıyan trnas genellikle10,11ortak kodon trnas daha fazla düşük fazlalıkları vardır. Sonuç olarak, bu nadir tRNAs diğer isoacceptors ile yarışmalarda ücretsiz amino asitler yakalamak için daha az muhtemeldir, ve nadir-Codon zengin dizileri çevirileri yavaşlama başlar veya amino asitler miktarları sınırlı olduğunda bile sonlandırıldı 10. Çeviriler, teorik olarak, aşırı üretimler veya karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslemeleri nedeniyle eş anlamlı ortak tRNAs şarj ettikten sonra bir amino asit fazlaları geri yüklenebilir12. Nadir kodon zengin gen bir seçim veya tarama işaretçisi kodlarsa, karşılık gelen fenotürler sergileme suşları daha sonra kolayca tespit edilebilir ve muhtemelen hedeflenen amino asitlerin overüreticiler.
Yukarıdaki strateji, amino asit overüreticilerinin tanımlanması için bir seçim ve bir tarama sistemi kurmak için uygulanır. Seçim sistemi antibiyotik direnci genleri kullanır (örn., kanR) işaretleme sistemi, floresan (örneğin, yeşil floresan protein [Gfp]) veya kromojenik (örneğin, prancerpurple) proteinleri kodlama genler kullanır iken işaretçileri olarak. Her iki sistemde de Marker genler eş anlamlı nadir alternatif ile hedeflenen amino asit için ortak kodon tanımlanmış sayılar değiştirerek değiştirilir. Nadide-Codon zengin Marker geni limandaki mutasyon kütüphanesinde bulunan suşlar, uygun koşullar altında seçilir veya ekranlanır ve hedeflenen amino asitlerin overüreticileri kolayca tespit edilebilir. İş akışı ender-Codon zengin Marker gen sisteminin inşası ile başlar, çalışma koşullarının optimizasyonu ve ardından amino asit overüreticilerinin tanımlanması ve doğrulanması. Bu analog-bağımsız strateji protein çevirisi dogma dayanır ve pratikte amino asit overüreticisinin doğru ve hızlı tanımlamalarını sağlamak için doğrulanmıştır. Teorik olarak, nadir codonlar ve tüm mikroorganizmalar ile amino asitlere doğrudan istihdam edilebilir. Tüm, nadir-Codon tabanlı strateji, belirli amino asitler için uygun analogları kullanılamıyor, ya da yüksek bir yanlış pozitif oran büyük endişe olduğunda geleneksel analog tabanlı yaklaşımı için etkili bir alternatif olarak hizmet verecektir. Aşağıdaki protokol, Escherichia coli L-lösin overüreticileri tanımlamada bu stratejiyi göstermek için lösin nadir kodon kullanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EM111-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>EG101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly master mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>I8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>H3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrancerPurple CPB-37-441</td>
			<td>ATUM</td>
			<td>CPB-37-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransStar FastPfu Fly DNA polymerase</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AP231-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type C. glutamicum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>13032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold E. coli competent cell</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>959759-902K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers

Amino asitler için sürekli büyüyen pazar karşılamak için, yüksek performanslı üretim suşları gereklidir. Amino asit overüreticiler geleneksel olarak amino asitler ve onların analogları arasındaki yarışmalar harnessing tarafından tanımlanır. Ancak, bu analog tabanlı yöntem düşük doğruluk ve spesifik amino asitler için uygun analoglar sınırlıdır. Burada, nadir-Codon zengin işaretçileri kullanan amino asit overüreticilerinin doğru, hassas ve yüksek verim taramasına olanak tanıyan alternatif bir strateji sunuyoruz. Bu strateji, protein çevirisi içinde kodon kullanım önyargı fenomen esinlenerek, hangi kodon ortak veya nadir olanlar kodlama DNA oluşumu onların frekansları dayalı kategorilere ayrılır. Nadir bulunan kodların çevirisi, ilgili nadir transfer RNAs 'larına (tRNAs) bağlıdır ve bu da açlık altında bilat amino asitleri tarafından tam olarak şarj edilemez. Teorik olarak, aynı derecede ortak isoacceptors şarj ettikten sonra amino asitler fazlasının varsa nadir tRNAs şarj edilebilir. Bu nedenle, seyrek kodların neden olduğu geri zekalı Çeviriler, karşılık gelen amino asitlerin beslenme veya hücre içi aşırı üretimleri ile restore edilebilir. Bu varsayımı altında, amino asit overüreticileri tanımlamak için bir seçim veya tarama sistemi hedeflenen amino asitlerin ortak kodon antibiyotik direnci genler veya genler kendi eşanlamlı nadir alternatifleri ile değiştirerek kurulur Floresan veya kromojenik proteinleri kodlama. Biz protein ifadeleri büyük ölçüde nadir kodon birleşmesi ile engellenebilir ve proteinlerin düzeyleri amino asit konsantrasyonları ile olumlu ilişkilendirir gösterir. Bu sistemi kullanarak, birden fazla amino asitlerin overüreticiler kolayca mutasyon kütüphaneleri dışarı ekranlaştırılmış olabilir. Bu nadir kodon tabanlı strateji sadece tek bir değiştirilmiş gen gerektirir ve ev sahibi diğer yöntemlerden daha seçim kaçmak için daha az muhtemeldir. Amino asit overüreticileri elde etmek için alternatif bir yaklaşım sunar.

Seçim sistemi için, OD600 nadir-Codon zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşları için keskin bir düşüş, uygun bir kültürlü zaman vahşi tip antibiyotik direnci geni barındıran gerinme göre gözlenmelidir (Şekil 1a). Aynı koşullar altında, OD600 hücresindeki azalma, antibiyotik direnci geni içinde nadir bulunan kodların sayısı arttıkça daha belirgin hale gelir (Şekil 1a). ...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers at JoVE.com

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Bu çalışmada, aynı anda doğruluk, hassasiyet ve yüksek verim elde etmek için nadir kodon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticilerinin belirlenmesi geleneksel toksik analog tabanlı yöntem için alternatif bir strateji sunar.

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Bu yöntem, amino asit fazla üreticilerinin elde edilmesinde geleneksel analog temelli yaklaşıma etkili bir alternatif sağlar. Bu teknik, doğruluk, hassasiyet ve yüksek iş elde etme sağlayarak geleneksel analog tabanlı yöntemden daha iyi bir şekilde rekabet eder. Bu yöntem, amino asit aşırı üretim güçlü yönlerini anlama ve nadir kodon çeviri anlama yeni bir ışık tutuyor ve teorik olarak, tüm mikroorganizmalara uygulanabilir.Bu protokol çoğunlukla takip etmesi kolay olan ancak uygun gergin sicim seçimini elde etmek için birden fazla deneme gerektirebilecek temel moleküler deneysel operasyonlara dayanır. Bu tekniğin görsel bir gösteri seçim performansı ve amino asit üreticileri belirlenmesinde bir tarama sistemi doğrudan takdir sunuyor. Bu yordamı başlatmak için, işaretleyici parçaları vektör ekleyin, buz üzerinde, bir ila yedi nokta beş mikrolitre montaj karışımı bir molar oranı on mikrolitre toplam hacmine.Bir saat liğine 50 derecede kuluçkaya yat. Montaj ürününün beş mikrolitresini 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca 50 mikrolitre bileşen hücresine dönüştürün. Bir saat boyunca 37 santigrat derece Katabolit baskı ortamı ile Super Optimal suyu hücreleri kurtarmak.Sonra, LB Agar orta ve 37 santigrat derece gecede kuluçka onları plaka. Ertesi gün, plazmid izole etmek için tercih edilen bir ticari kiti kullanın. İlk olarak, yabani tip KanR taşıyan plazmid bir mikrolitre ile yetkili hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürün.KanR RC 29 içeren plazmid ile yetkin hücrelerin ikinci bir dizi dönüştürmek tüm lösin kodonları nadir kodon CTA ile değiştirilir. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürünü plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, nadir kodon açısından zengin türev yabani tip seçim marker geni barındıran koloniler mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda kanamisin içeren beş kat seyreltilmiş LB orta beş mililitre içine bireysel olarak aktarın.250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. Daha sonra, hücre kültürlerinin her birinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 kuyu plakasına aktarın. OD600 ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.KanR RC 29 marker genini barındıran lekeleri, L-lösin kaynağı olan veya olmayan kanamisin içeren 0,2 x LB ortamının beş mililitreiki setinde inoküle. Litre başına bir gram son konsantrasyoniçin medya birine L-lösin ekleyin. 250 rpm sallayarak 37 santigrat derecede bir shaker örnekleri kuluçka ve tanımlanan zaman noktalarında her kültür için OD600 ölçmek.Başlamak için, yabani tip GFP veya yabani tip PPG taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutagenez için kullanılan ebeveyn suşu 50 mikrolitre dönüştürmek. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürlerini plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kolonileri tek tek, düzgün seyreltilmiş LB ortamının beş mililitresine aktarın.Örnekleri 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 250 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Floresan belirteçleri için, hücre kültürlerinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 iyi temiz alt arka plakaya aktarın. Floresan OD600'i ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın.Kromojenik belirteçler için hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün. Daha önce açıklandığı gibi besleme tayini yapın ve floresan yoğunluğunu veya renk gelişimini tanımlanan zaman noktalarında ölçün. İlk olarak, seçim marker KanR RC 29 taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutant hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürmek, veya tarama işaretleri GFP RC veya PPG RC. Sonra, hücre kültürlerini 4000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.Seçim için, supernatant atın ve seçim işareti taşıyan hücrelere kanamisin içeren 0,2 x LB orta beş mililitre ekleyin. Numuneyi bir gecede 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 12 saat boyunca 37 santigrat derecede kanamisin ve kuluçka içeren 0.2 x LB agar orta üzerine gece kültürü plaka.Tarama için, uygun antibiyotik içeren LB agar orta üzerine tarama marker barındıran hücrelerin uygun sayıda plaka. 8 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bundan sonra, plaka her tek koloni ile uygun antibiyotik içeren LB orta inoculate.250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. GFP RC kullanılırsa OD600 ve floresan ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın. PPG RC kullanılırsa hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün.Aday suşların amino asit verimliliğini doğrulamak için, her aday suşları ile LB orta beş mililitre aşılayarak tohum kültürü hazırlamak ve hücrelerin bir shaker bir gecede 250 rpm ve 37 santigrat derecede büyümesine izin. Ertesi gün, hücre kültürünün bir mililitresinden hücreleri iki dakika boyunca 4000 kez G'yi santrifüj ederek hasat edin. Supernatant atın ve steril su bir mililitre ile palet ilike askıya.20 000 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 250 mililitrelik shaker'da 250 mililitrelik bir çalkalama da 24 saat boyunca 37 derece santigrat ile %4 glikoz içeren 20 mililitre M9 ortamı aşılayın. Ertesi gün, 4000 kez G beş dakika için kültür ortamının bir mililitre santrifüj. 200 mikrolitre süpernatantı temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.Burada gösterilen konsantrasyonlarda L-lösin standart çözeltileri hazırlayın. Bir duman başlık olarak, bir milimolar trietilamin 100 mikrolitre ve bir molar fenil izotiyosiyanat 100 mikrolitre hem supernatant ve standartlara ekleyin. Çözeltileri hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra, aynı tüp e 400 mikrolitre n-heksane ekleyin ve on saniye girdap. Alt faz amino asit türevleri içerir ve HPLC analizi için kullanılır. Alt fazı 0,2 mikrolitre politetrafloroetilen membranlar üzerinden süzün.Bundan sonra, dakikada 0,42 mililitre akış hızına sahip c18 sütunu yla donatılmış ultra HPLC'de numunenin bir mikrolitresini ve 40 santigrat derece lik kolon sıcaklığında çalıştırın. Hedeflenen amino asitleri 254 nanometrede tespit etmek ve standart eğrinin altındaki tepe alanlarının haritasını koyarak konsantrasyonlarını hesaplamak için bir diyot dizi dedektörü kullanın. Bu çalışmada, amino asit overproducers aynı anda doğruluk, duyarlılık ve yüksek iş elde etmek için nadir kodon açısından zengin belirteçleri kullanılarak tespit edilmiştir.Seçim sistemi için, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşlar için OD600 keskin bir azalma yabani türü barındıran suş ile karşılaştırıldığında gözlenmelidir. Protein ekspresyonunda nadir kodonun inhibisyonu çoğunlukla aç koşullarda gerçekleşir. Karşılık gelen amino asit ekstra besleme sonra, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşu için OD600 önemli ölçüde artar.Tarama sistemi için floresan hücre sayısındaki floresan yoğunluğu, nadir kodon açısından zengin olan gendeki floresan proteini yabani tip genden daha fazla ifade eden zorlanma için önemli ölçüde daha düşüktür. Karşılık gelen amino asit besleme nadir kodon açısından zengin genlerden protein ifadeleri geri yükleyecek. Mor protein imal edilirken, nadir kodon açısından zengin PPG'den geliştirilen renk, yabani tip genden daha hafiftir.Seyreltilmemiş LB orta ifade mor protein L-lösin besleme olmadan nadir kodon açısından zengin PPG yavaş ifade sağlar hücreler peleted kez görünür hale gelir. Ancak, bu nadir kodon açısından zengin PPG gen ekspresyonunun L-lösin ile beslenerek geliştirilmiş olduğu gerçeğini gizlemez. Nadir kodon bazlı strateji mutasyon kütüphanesinden hedeflenen amino asitlerin aşırı üreticileri tespit edebilir ve bu mutantlar ana suşları daha hedeflenen amino asitlerin daha yüksek miktarlarda üretmek gerekir.Bu yordamı denerken, yabani tip belirteçleri barındıran hücreler ve nadir kodon açısından zengin türevleri barındıran hücreler arasında OD veya renk net bir ayrımcılık elde etmek için nadir kodon frekansı ayarlamak önemlidir. Transkripsiyon analizi ve genom dizilimi, amino asit üretimleri ile ilgili mekanizmayı araştırmak için seçilen suşlara uygulanabilir. Bu tekniği kullanarak, amino asit overproducers verimli bir şekilde tespit edilebilir ve genetik bilgilerin analizi amino asit aşırı üretim arkasındaki mekanizmaları içine yeni anlayışlar sunacak.Amino asit türevi zararlı olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve bir duman başlık bu adımları gerçekleştirmek emin olun.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...