Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج NINDS للبحوث داخل الجدارية.

1- ثقافة مجلس الأمن القومي
ملاحظة: سيتم وصف معالجة خط NSC الإنسان أدناه ولكن يمكن استخدام أي خط خلية لهذا البروتوكول. يتم تنفيذ جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية.
<ol><li>معطف لوحة 96 جيدا مع غشاء الطابق السفلي / مصفوفة خارج الخلية (ECM).<ol>
<li>ذوبان aliquot من ECM(جد?...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

كان الهدف الرئيسي من هذه المقالة هو وصف استراتيجية يمكن أن تحدد بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في فحص الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة. واستُخدمت تقنيتان متعامدة لتقييم رقم الخلية لزيادة الثقة في الاستنتاجات وتقديم رؤى إضافية لن تكون متاحة إذا ما استُخدم سوى ?...

واحدة من أهم الخصائص التي تحتاج إلى تحديد لمجمع كيميائي له إمكانات علاجية هو سميته للخلايا الحيوانية. هذه الخاصية ستحدد ما إذا كان الدواء هو مرشح جيد لدراسة أكثر شمولا. في معظم الحالات، يتم البحث عن مركبات مع الحد الأدنى من السمية ولكن هناك حالات فيها مركب مع القدرة على قتل أنواع محددة من الخلايا هو موضع اهتمام، على سبيل المثال، الأدوية المضادة للورم. على الرغم من أن الحيوانات كلها هي أفضل أنظمة نموذجية لتحديد السمية النظامية، فإن التكلفة والعمالة التي ينطوي عليها الأمر باهظة عندما تحتاج إلى اختبار أكثر من عدد قليل من المركبات. كما أن مثل هذه الثقافة الخلية الثدييات يستخدم عموما كبديل الأكثر كفاءة1،2. وشاشات المخدرات الصغيرة والمتوسطة الإنتاجية هي طريقة هامة يمكن من خلالها تقييم السمية في زراعة الخلايا. يمكن استخدام هذه الشاشات لاستجواب المكتبات المشروحة التي تستهدف مسارات الإشارات الفردية. الشكل العام لمثل هذه الشاشة هو اختبار في البداية جميع المركبات في المكتبة بجرعة واحدة (عموما 10 درجة مئوية) في شاشة سمية أولية استكشافية، ومن ثم إجراء شاشة استجابة جرعة ثانوية متعمقة لتوصيف السمية بشكل كامل ملف تعريف الزيارات من الشاشة الأساسية. وسيجري هنا وصف أساليب تنفيذ هذه الاستراتيجية وتوفير طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتحديد المركبات السمية وتوصيفها.
وقد وضعت أساليب متعددة لتقييم السمية الخلوية للمركبات الصغيرة والمواد النانوية في خلايا الثدييات3،4. وتجدر الإشارة إلى أن بعض المواد يمكن أن تتفاعل مع الفحص الذي يوفر نتائج مضللة، وينبغي اختبار هذه التفاعلات عند وصف الضربات من شاشات السمية4. وتشمل اختبار السمية الخلوية تريبان استبعاد الأزرق5، لاكتات dehydrogenase (LDH) اختبار الإصدار6، ألامار الأزرق اختبار7، استر الأسيتوإكسيميثيل (AM)8، وATP اختبار9. كل هذه الاختبارات قياس جوانب مختلفة من استقلاب الخلايا التي يمكن أن تكون بمثابة وكيل لرقم الخلية. في حين أن جميع الفوائد تقدم، والاختبارات المستندة إلى ملح تيترازوليوم مثل 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT)، 2،3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide الملح الداخلي (XTT)-1، و4-(3-4- يودوفينيل]-2-[4-نيتروفينل]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)10,11 توفر دقة جيدة وسهولة الاستخدام بتكلفة منخفضة. يتم تقليل MTT، والتي سيتم استخدامها في هذه المظاهرة، إلى شكل غير قابل للذوبان عن طريق اختزال الميتوكوندريا ويرتبط معدل هذا التحويل بقوة مع رقم الخلية. وقد استخدم هذا الفحص بشكل روتيني على نطاق صغير وللمكتبات التي تعرض ما يصل إلى 000 2 مركب12. يوفر العد المباشر للخلايا بواسطة علامة مسماة طريقة أخرى لتقييم رقم الخلايا الخلوية، وعلى عكس فحص MTT يمكن أن يوفر معلومات إضافية حول ديناميات النمو الخلوي. تتوفر العديد من الخوارزميات المتاحة للجمهور لإجراء تحليلات حساب الخلايا الآلي وهناك أيضا خوارزميات الملكية التي هي جزء من حزم البرمجيات لقراء التصوير13،14. في هذا الوصف الأسلوب، فإن خط الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) التي تم تحريرها وراثيا للتعبير عن المكونة tdTomato15 بمثابة خط اختبار لمقارنة نتائج الصلاحية الخلوية بين اختبار MTT وحساب الخلايا الآلي الفحص في شاشة تقييم سمية 57 مركبات الاختبار. على الرغم من أن الهدف الرئيسي لهذه الاستراتيجية كان تحديد وتوصيف المركبات السامة، إلا أن لها فائدة إضافية تتمثل في احتمال تحديد مركبات النمو المثبطة وتعزيز النمو، وبالتالي توفر طريقة فعالة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تعدل النمو الخلوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

السمية الخلوية هي معلمة حرجة تحتاج إلى تحديد كمية عند دراسة الأدوية التي قد تكون لها فوائد علاجية. وبسبب هذا، يستخدم العديد من الاختبارات فحص المخدرات السمية الخلوية باعتبارها واحدة من الخصائص الحرجة التي ينبغي تحديدها للمركبات الفردية. الخلايا في الثقافة هي نموذج مفيد لتقييم السمية الخلوية قبل الشروع في متابعة مركبات الرصاص الواعدة في نماذج حيوانية أكثر تكلفة وكثيفة العمالة. نحن نصف استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في tdTomato التعبير عن الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) خط. وتستخدم الاستراتيجية اثنين من الاختبارات التكميلية لتقييم رقم الخلية. يعمل اختبار واحد عن طريق تخفيض 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيزول-2-yl)-2,5-ثنائي الفينيل بروميد التترازوليوم (MTT) لتشكلكوكالة كوكيل لرقم الخلية والآخر يعد مباشرة tdTomato التعبير عن NSCs. يمكن إجراء الفحصين في وقت واحد في تجربة واحدة وليست كثيفة العمالة وسريعة وغير مكلفة. وقد اختبرت الاستراتيجية الموصوفة في هذه المظاهرة 57 مركباً في شاشة أولية استكشافية للسمية في شكل لوحة من 96 بئراً. وقد تم وصف ثلاثة من الضربات أكثر في استجابة جرعة من ست نقاط باستخدام نفس الإعداد اختبار الشاشة الأولية. وبالإضافة إلى تقديم دعم ممتاز للسمية، فإن مقارنة النتائج من الاختبارين قد تكون فعالة في تحديد المركبات التي تؤثر على جوانب أخرى من نمو الخلايا.

وحددت بيانات عدد الخلايا الآلية أحد عشر مركباً ذات قدرة قابلة للبقاء تقل عن 25 في المائة عند تطبيعها إلى عنصر التحكم في نظام إدارة الوجهات السياحية، في حين حددت بيانات MTT هذه المركبات نفسها بالإضافة إلى مركبين إضافيين(الجدول 1 والجدول 2،أحمر مظلل). وكان المركبان اللذين تبي...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

غالباً ما يكون من الضروري تقييم السمية الخلوية المحتملة لمجموعة من المركبات على الخلايا المستزرعة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لفحص موثوق للمركبات السامة في شكل 96 جيدا.

استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة في خلايا الثدييات المستزرعة في الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

هذا البروتوكول يوفر استراتيجية سريعة وفعالة لاستخدام في وقت واحد اثنين من المقايسات لفحص عدة مئات من المركبات لآثارها على نمو الخلايا. يمكن أن تقدم لنا الأقوال معلومات حول ما إذا كانت مركبات محددة هي السامة للخلايا، وتمنع نمو الخلايا، أو تعزيز نمو الخلايا. من خلال الاستفادة من اثنين من المقايسات معا، ونحن قادرون على زيادة الدقة وتحديد المركبات السامة للخلايا.في الحالات التي تختلف فيها نتائج اثنين من المقايسات، قد تسمح لنا هذه الاستراتيجية لتحديد مركب مع آثار فريدة على وظيفة الخلوية التي يمكن أن تدرس بشكل أكبر بوسائل أخرى. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية في أنها سريعة وغير مكلفة وغير كثيفة العمالة. مرة واحدة يتقن, فإنه يسمح للباحثين بسهولة أداء شاشة أولية تصل إلى 200 مركبات في أسبوع واحد, ومن ثم تنفيذ منحنى استجابة جرعة شاملة على 10 إلى 15 مركبات في أسبوع آخر.وسوف يكون إثبات الإجراء هو أنا وروهيني مانيكام، وهو عالم في هيئة التدريس وزميل ما بعد البكالوريا من المختبر. أولاً، في خزانة السلامة البيولوجية، الخلايا الثقافية في قارورة T75 مع وسيط NSC بحيث تكون على الأقل 80٪ التقاء عند بدء الفحص. ووضع القارورة في حاضنة لثقافة الخلية التي تم تعيينها في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.مرة واحدة الخلايا تصل إلى التقاء 80٪، وإزالة قارورة من الحاضنة وpirate قبالة وسيط NSC. إضافة ثلاثة ملليلتر من خلية انفصام الكاشف واحتضان لمدة خمس دقائق في الحاضنة. بعد الحضانة، إضافة سبعة ملليلتر من المتوسط NSC في القارورة، وماصة بقوة لضمان جميع الخلايا تصبح منفصلة.نقل محلول الخلية المنفصلة إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسط NSC. استخدام عداد الخلايا الآلي أو قياس الهيموسيتات لحساب الخلايا، وإضافة وسيط NSC في أنبوب لإعادة ضبط تركيز الخلايا إلى 200،000 خلية لكل ملليلتر.ثم، وذلك باستخدام ست فتحات من ثماني فتحات من ثمانية قناة pipettor متعدد القنوات لوحة 100 ميكرولترات من خلية خليط العمود عمود في 60 آبار الداخلية من ثلاثة 96 لوحات البئر التي تم المغلفة من قبل مصفوفة خارج الخلية. إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة قاعدة أو NSC المتوسطة لجميع الآبار دون خلايا لتقليل التبخر المحتمل من الآبار الخارجية التي تحتوي على الخلايا. تحت مجهر زراعة الخلية، فتش بصريا ما لا يقل عن 10 آبار على كل من لوحات الآبار الثلاثة 96 للتأكد من أن الخلايا جالسة في الكثافة المتوقعة.احتضان في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة 16 إلى 24 ساعة بعد تقسيم، وpirate قبالة NSC عمود المتوسطة عمود مع ثمانية قناة متعدد الآبار الأنابيب، وذلك باستخدام ستة فقط من فتحات ثمانية متعددة الآبار. أضف 95 ميكرولترات من متوسط NSC الطازج إلى كل بئر من اللوحات الثلاثة ، ووضع اللوحات مرة أخرى في الحاضنة.مع ثمانية قناة متعدد الآبار pipettor، إضافة 49 ميكرولترات من المتوسط NSC في كل من 60 آبار الداخلية من فارغة U القاع، V-القاع، أو مستديرة القاع 96 لوحة جيدا. فك الـ لوحة المركب الرئيسي المعدة. Pipette واحد ميكرولتر من المجمع من لوحة رئيسية في كل من 60 آبار الداخلية التي تحتوي على متوسط NSC، وخلط المجمع المخفف ثلاث مرات مع أنبوب أعلى مقاعد البدلاء.بعد ذلك، إزالة ثلاث 96 لوحات بئر من NSCs من الحاضنة والاستغناء عن خمسة ميكرولترات من المجمع المخفف في كل بئر من اللوحات الثلاثة التي تحتوي على خلايا لتوليد تخفيف واحد إلى 1000 للتركيز المركب النهائي من 10 ميكرومولار مع تركيز DMSO خلايا Incubate 0.1٪ مع مركب لمدة 72 ساعة، والمضي قدما مع مقايسات السمية للخلايا. لأداء جرعة استجابة المقايسة، إعداد 96 جيدا. استخدام العمود الثاني لستة نظام مراقبة DMSO يكرر، واختبار ثلاث مرات من ما يصل إلى ثلاثة مركبات مختلفة في التخفيفات التسلسلية مزدوجة، في ست جرعات، بدءا من جرعة عالية من 10 ميكرومولار.تخفيف أربعة ميكرولترات من 100٪ DMSO أو اختبار مركب في DMSO في 196 ميكرولترات من المتوسط NSC في أنبوب microcentuge 0.5 أو 1.5 ملليلتر. إضافة 25 ميكرولتر من DMSO المخفف للسيطرة على الآبار، و 50 ميكرولترات من مركبات الاختبار المخففة إلى آبارها المقابلة. Pipette 25 ميكرولترات من NSC المتوسطة إلى الآبار الفارغة المتبقية في الجزء الداخلي من لوحة 96 بئر.مع أنبوب متعدد القنوات، نقل 25 ميكرولتر من المجمع من 10 آبار ميكرومولار إلى الآبار الدقيقة الخمس، واخلط خمس مرات على الأقل. استبدال نصائح ماصة، وتكرار العملية عن طريق خلط الصفوف المتبقية لتوليد ثلاثية في التخفيفات مضاعف لما مجموعه ست جرعات لكل من المركبات. نقل خمسة ميكروليتر من كل تخفيف في لوحة جديدة مع الخلايا الثقافة التي يجري اختبارها.ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد أن يتم احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ووضعها داخل قارئ اللوحة. افتح برنامج المصوّر لإعداد البروتوكولات وتجربة الملفات للدراسة.انتقل إلى وضع دليل الصور على إدارة المهام وانقر فوق التقاط الآن. اختيار 96 لوحة جيدا كنوع السفينة. حدد 10 مرات للتكبير، والبروتين الفلورسنت الأحمر 531 و 593 للتصوير tdTomato.انقر على بئر. ثم انقر على التركيز البؤري التلقائي للتركيز على الصورة ، وفضح السيارات لوقت التعرض المناسب. ضبط التركيز والتعرض يدويًا عند الحاجة.انقر على أيقونة الكاميرا لالتقاط الصورة. ثم انقر فوق تحليل المعالجة أعلاه الصورة لمتابعة إنشاء البروتوكول. وحدد علامة التبويب تحليل.إلى يمين الصورة، انقر فوق تحليل خلوي في إضافة خطوة تحليل، وانقر فوق ابدأ. تُظهر الصورة خلايا مظلّزة للإشارة إلى كل خلية على حدة. انقر على اختيار خيارات لتغيير المعلمات لتحديد الخلايا بشكل أفضل استناداً إلى عتبة الفلوريسنس أو حجم الخلية.إذا كان المصور يحسب الخلايا بشكل صحيح، فانقر على إضافة خطوة في أسفل الشاشة. انقر على الرمز الموجود أعلى الشاشة لإنشاء تجربة من مجموعة الصور. وعلى النافذة المفتوحة، انقر فوق الإجراء تحت علامة التبويب البروتوكول.ثم، في النافذة الجديدة التي تفتح، حدد قراءة. انقر على Full Plate لتحديد الآبار الـ 60 التي تحتوي على الخلايا فقط. انقر فوق موافق لحفظ التغييرات.ثم انقر فوق موافق في الإطار الإجراء. انقر فوق رمز التشغيل لتشغيل اللوحة. في المطالبة، حفظ الملف، ثم في موجه لوحة التحميل، انقر فوق موافق. عند الانتهاء من التصوير، قم بتنزيل بيانات عدد الخلايا من برنامج برنامج التصوير إلى جدول بيانات للتحليل.في غضون ساعتين من الانتهاء من التصوير tdTomato، تبدأ MTT المقايسة. تزن بها 25 ملليغرام من MTT وإعادة تعليق ذلك في خمسة ملليلتر من المتوسط NSC لجعل خمسة ملليغرام لكل ملليلتر MTT حل الأسهم. دوامة الحل لعدة دقائق، حتى لا يكون هناك ترسبات مرئية من MTT.إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة وpirate قبالة خلية ثقافة المتوسطة. تمييع MTT 1 إلى 10 في وسط NSC الطازجة ، وإضافة 100 ميكرولترات من MTT المخففة لكل بئر من الخلايا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.يُرى الترسبات الزخرافية تقريبًا بما يتناسب مع عدد الخلايا في البئر. التعرق حل MTT قبالة لوحات، وإضافة 50 ميكرولترات من 100٪ DMSO إلى كل بئر. ضع اللوحات على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 400 دورة في الدقيقة.بعد ذلك، نقل لوحة إلى قارئ لوحة. اقرأ امتصاص كل بئر في الطول الموجي المحدد مسبقًا لـ 595 نانومتر، وتصدير البيانات إلى جدول البيانات للتحليل، تمامًا كما هو الحال بالنسبة لبيانات عدد الخلايا. وكشف فحص الصور الفلورية tdTomato اثنين من الآبار المتنافرة للسمية بين MTT و جرد الخلية.بالنسبة لرُحَمٍ واحد، فإن بيانات عدد الخلايا لا تشير إلى سمية. لكن بيانات MTT فعلت. بئر آخر كان بالغ في تقدير عدد الخلايا من قبل MTT نسبة إلى العد tdTomato، ويبدو أن لديها خلايا أكبر، في حين أنه في الآبار حيث MTT التقليل من عدد الخلايا نسبة إلى tdTomato، ويبدو أن الخلايا أصغر.وباختصار، صنّف فحص tdTomato 11 مركبًا على أنها سامة، و11 كمثبط للنمو، وواحد كتعزيز للنمو، مع عدم وجود تأثير واضح على نمو الخلايا 34. صنّف المقايسة MTT 13 مركبًا على أنها سامة، واثنان منها كمثبط للنمو، وواحد كتعزيز للنمو، مع عدم وجود تأثير واضح على نمو الخلايا 41. ويبين الرسم البياني للخلايا القابلة للحياة للمركب WP1066 منحنى مسطح نسبياً بدون سمية للتركيزات الأربعة الأدنى.المنحنى يسقط بسرعة في جرعة المايكرومولار الخمسة، وينخفض إلى سمية كاملة تقريبا في 10 ميكرومولار، مما يؤدي إلى الجرعة القاتلة 50 كما 4.4 و 6.0 ميكرومولار لم مقايسة tdTomato ومجرسة MTT. ومن الأهمية بمكان أن يتم تخفيف المركبات بشكل صحيح في شاشة استجابة الجرعة بحيث يتم إنشاء منحنى استجابة الجرعة الصحيحة. يمكن للمركبات التي يحددها هذا الإجراء للتأثير على نمو الخلايا أن تتميز كذلك بالجراصير الوظيفية لتحديد مسارات الإشارات الجديدة المحتملة التي تتحكم في نمو الخلايا.وقد تم اختبار المركبات السامة للخلايا الجذعية العصبية كعوامل علاجية محتملة لسرطانات الدماغ، مثل الورم الأرومي الدبقي والورم الأرومي العصبي. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند التعامل مع خلايا الثدييات، DMSO، وMTT. تخلص من DMSO و MTT وفقًا لإرشادات النفايات الكيميائية للمؤسسة الخاصة بك.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

إعادة تشكيل تجميع السبعين في الأغشية لدراسة الخصائص والوظائف الفيزيائية الحيوية

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...