Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NINDS Intramural Research program.

1. NSC-kulturen
Bemærk: manipulation af en human NSC linje vil blive beskrevet nedenfor, men enhver cellelinje kan bruges til denne protokol. Alt cellekultur arbejde udføres i et biologisk sikkerhedskabinet.
<ol><li>Coat a 96-brønd plade med kælder membran/ekstracellulær matrix (ECM).<ol>
<li>Taw alikvot af ECM (tabel over materialer), som vil lette fastgørelse af NSC, på is. Der fortyndes ECM til den relevante koncentration (normalt 1:100) i 10 mL base medium (<stron...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Hovedformålet med denne artikel var at beskrive en strategi, som effektivt og billigt kunne identificere forbindelser, der påvirker cellevækst i en lav-til moderat-gennemløb screening. To ortogonale teknikker blev udnyttet til at vurdere celle nummer for at øge tilliden til konklusionerne og tilbyde yderligere indsigt, der ikke ville være til rådighed, hvis kun en enkelt analyse blev brugt. En af de assays brugte en fluorescerende celle Imager til direkte tælle tdTomato-positive celler og den anden var afhængig ...

En af de vigtigste egenskaber, der skal bestemmes for en kemisk forbindelse, der har terapeutisk potentiale er dens toksicitet for animalske celler. Denne Karakteristik vil afgøre, om et lægemiddel er en god kandidat til mere omfattende undersøgelse. I de fleste tilfælde, forbindelser med minimal toksicitet er søgt, men der er situationer, hvor en forbindelse med kapacitet til at dræbe specifikke celletyper er af interesse, f. eks, anti-tumorigenic narkotika. Selv om hele dyr er de bedste modelsystemer til at bestemme systemisk toksicitet, omkostninger og arbejdskraft er prohibitiv, når mere end et par forbindelser skal testes. Da en sådan pattedyrscelle kultur generelt anvendes som det mest effektive alternativ1,2. Små til medium gennemstrømning narkotika skærme er en vigtig modalitet, hvorigennem toksicitet kan vurderes i cellekultur. Disse skærme kan bruges til at afhøre kommenterede biblioteker, der er rettet mod individuelle signalering-veje. Det generelle format af en sådan skærm er først at teste alle forbindelser i biblioteket ved en enkelt dosis (generelt 10 μM) i en sonderende primær toksicitet skærm, og derefter udføre en dybtgående sekundær dosisrespons skærm til fuldt ud at karakterisere toksiciteten profil af hits fra den primære skærm. Metoderne til at gennemføre denne strategi vil blive beskrevet her og give en hurtig, effektiv og billig måde at identificere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er blevet udviklet til at vurdere cytotoksicitet af små forbindelser og nanomateriale i pattedyrsceller3,4. Det skal bemærkes, at visse materialer kan interagere med analysen giver misvisende resultater, og sådanne interaktioner bør testes, når karakterisering hits fra toksicitet skærme4. Cytotoksiske assays omfatter trypan og et blå udelukkelse5, lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay6, Alamar blå assay7, calcien acetoxymethylester (am)8, og ATP assay9. Alle disse assays måle forskellige aspekter af cellemetabolisme, som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyder fordele, tetrazolium salt-baserede assays såsom 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 2,3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1, og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonat (WST-1)10,11 giver god nøjagtighed og brugervenlighed til lave omkostninger. MTT, som vil blive anvendt i denne demonstration, er reduceret til en uopløselig formazan af en mitokondriel reduktase og hastigheden af denne omdannelse korrelerer stærkt med celle nummer. Denne analyse er blevet rutinemæssigt udnyttet i både en lille skala og til screening biblioteker med op til 2.000 forbindelser12. Direkte optælling af celler med en mærket markør tilbyder en anden metode til at vurdere cellernes nummer, og i modsætning til MTT-analysen kan det give yderligere oplysninger om dynamikken i cellulær vækst. Flere offentligt tilgængelige algoritmer er tilgængelige til at udføre automatiserede celletal analyser, og der er også proprietære algoritmer, der er en del af softwarepakker til billedbehandlings læsere13,14. I denne metodebeskrivelse, en human neurale stamcelle (NSC) linje, der er blevet genetisk redigeret til konstitutivt Express tdTomato15 vil tjene som en test linje til at sammenligne cellulære levedygtighed resultater mellem en MTT assay og en automatiseret celletælling analyse i en skærm, der vurderer toksiciteten af 57 test forbindelser. Selv om hovedformålet med denne strategi var at identificere og karakterisere giftige forbindelser, det har den yderligere fordel af potentielt identificere væksthæmmende og vækstfremmende forbindelser og dermed giver en effektiv metode til at identificere narkotika der kan moduere cellulære vækst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Cytotoksicitet er en kritisk parameter, der skal kvantificeres, når man studerer lægemidler, der kan have terapeutiske fordele. På grund af dette, mange Drug screening assays udnytte cytotoksicitet som en af de kritiske egenskaber, der skal profileret for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig model til at vurdere cytotoksicitet før du fortsætter med at følge op på lovende bly forbindelser i dyrere og arbejdskrævende dyremodeller. Vi beskriver en strategi for at identificere forbindelser, der påvirker cellevækst i en tdTomato udtrykker humane neurale stamceller (NSC) linje. Strategien bruger to komplementære assays til at vurdere celle nummer. En analyse virker via reduktion af 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den anden direkte tæller tdTomato udtrykker NSCs. De to assays kan udføres samtidigt i et enkelt eksperiment og er ikke arbejdskraftintensive, hurtige og billige. Den strategi, der er beskrevet i denne demonstration testede 57 forbindelser i en sonderende primær skærm for toksicitet i en 96-brønd plade format. Tre af de hits blev karakteriseret yderligere i en seks-punkts dosisrespons ved hjælp af den samme analyse set-up som den primære skærm. Ud over at give fremragende bekræftelse for toksicitet, sammenligning af resultaterne fra de to analyser kan være effektiv til at identificere forbindelser, der påvirker andre aspekter af cellevækst.

De automatiserede celle tælle data identificerede elleve forbindelser med mindre end 25% levedygtighed, når normaliseret til DMSO kontrol, mens MTT data identificerede disse samme forbindelser plus to yderligere dem (tabel 1 og tabel 2, skygget rød). De to forbindelser, der kun fandtes at være giftige i MTT-analysen (Wells F3 og G10), havde henholdsvis 31% og 39%, antallet af tdTomato-positive celler som kontrol og efter rangorden var de næste to mest giftige forbindelser i dette bi...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Det er ofte nødvendigt at vurdere den potentielle cytotoksicitet af et sæt forbindelser på dyrkede celler. Her beskriver vi en strategi for pålideligt at screene for giftige forbindelser i et 96-Well-format.

En strategi til identificering af forbindelser, der påvirker cellevækst og overlevelse i dyrkede pattedyrceller ved lav til moderat gennemløb

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Denne protokol tilbyder en hurtig og effektiv strategi til samtidig at bruge to analyser til at screene flere hundrede forbindelser for deres virkninger på cellevækst. Analyserne kan give os oplysninger om, hvorvidt specifikke forbindelser er cytotoksiske, hæmmer cellevækst, eller forbedre cellevækst. Ved at udnytte de to analyser sammen, vi er i stand til at øge nøjagtigheden og identificere cytotoksiske forbindelser.I tilfælde, hvor resultaterne af de to analyser afviger, kan denne strategi give os mulighed for at identificere sammensatte med unikke virkninger på cellulære funktion, der kan undersøges yderligere på anden måde. Den største fordel ved denne strategi er, at det er hurtigt, billigt og ikke-arbejdskrævende. Når mestrer, det giver forskerne mulighed for nemt at udføre en primær skærm på op til 200 forbindelser i en uge, og derefter udføre en udtømmende dosis respons kurve på 10 til 15 forbindelser i en anden uge.Demonstration af proceduren vil være mig selv og Rohini Manickam, en stab videnskabsmand og post-studentereksamen fra laboratoriet. For det første skal der i et biologisk sikkerhedsskab dyrkes celler i en T75-kolbe med NSC-medium, så de skal være mindst 80 % sammenløb, når analysen påbegyndes. Og læg kolben i en cellekultur inkubator indstillet til 37 grader Celsius og fem procent kuldioxid.Når cellerne når op på 80 %sammenløbet, fjernes kolben fra inkubatoren og aspirere nsc-mediet af. Der tilsættes tre milliliter gensociering af celler og inkuberes i fem minutter i inkubatoren. Efter inkubation tilsættes der syv milliliter NSC-medium i kolben, og der pipetes kraftigt for at sikre, at alle celler bliver afmonteret.Den dissocierede celleopløsning overføres til et 15 milliliterrør, og centrifugeres ved 200 gange G i fem minutter. Fjern supernatanten fra røret og ophæng cellerne igen i 10 milliliter NSC-medium. Brug en automatiseret celletæller eller hæmocytometer til at tælle cellerne, og tilsæt NSC-medie i røret for at justere cellernes koncentration til 200.000 celler pr. milliliter.Derefter ved hjælp af seks af de otte slots af en otte kanal multikanal pipettor til plade 100 mikroliter af celleblandingen kolonne efter kolonne i 60 indvendige brønde af tre 96 brøndplader, der er blevet belagt med ekstracellulære matrix. Tilføj 100 mikroliter af base medium eller NSC medium til alle brønde uden celler for at minimere potentielle fordampning fra yderste brønde, der indeholder celler. Under et cellekulturmikroskop inspiceres der visuelt mindst 10 brønde på hver af de tre 96 brøndplader for at bekræfte, at cellerne sidder ved den forventede tæthed.Inkubere ved 37 grader Celsius og fem procent kuldioxid. Fjern cellekulturpladerne fra inkubatoren 16 til 24 timer efter opdeling, og inspirer NSC-mellemsøjlen med kolonne med en otte-kanals flertånpipettor, der kun bruger seks af de otte multi-well-pladser. Der tilsættes 95 mikroliter frisk NSC-medium til hver brønd af de tre replikerede plader, og sæt pladerne tilbage i inkubatoren.Med en otte kanal multi-godt pipettor, tilføje 49 mikroliter NSC medium i hver af de indvendige 60 brønde af en tom U-bottomed, V-bottomed, eller rund-bottomed 96 godt plade. Unseal den forberedte master sammensatte plade. Pipette en mikroliter af forbindelsen fra master plade i hver af de indvendige 60 brønde, der indeholder NSC medium, og bland den fortyndede forbindelse tre gange med en bænk top pipettor.Dernæst fjernes de tre 96 brøndplader af NSC'er fra inkubatoren og dispensere fem mikroliter af den fortyndede forbindelse i hver brønd af de tre plader, der indeholder celler, for at give en 1-1000 fortynding for den endelige sammensatte koncentration af 10 mikromolar med en DMSO-koncentration på 0,1%Inkuber celler med sammensatte i 72 timer, og fortsæt med cytotoxi-ascityanalyser. For at udføre dosis respons assay, oprette en 96 godt. Brug kolonne to til seks DMSO-kontrolrelikater, og test tredoblinger af op til tre forskellige forbindelser ved dobbelt serielle fortyndinger ved seks doser, begyndende med en høj dosis på 10 mikromolar.Fire mikroliter på 100% DMSO eller testforbindelse i DMSO fortyndes til 196 mikroliter NSC-medium i et 0,5 eller 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Der tilsættes 25 mikroliter af den fortyndede DMSO til kontrol af brønde og 50 mikroliter af de fortyndede testforbindelser til deres tilsvarende brønde. Pipette 25 mikroliter af NSC medium til de resterende tomme brønde i den indvendige del af 96 brøndpladen.Med en multikanalpipettor overføres 25 mikroliter af forbindelsen fra de 10 mikromolarbde til de fem mikromolarbde, og bland mindst fem gange. Udskift pipettespidserne, og gentag processen ved at blande de resterende rækker for at generere tre eksemplarer ved dobbelt fortynding i i alt seks doser for hver af forbindelserne. Overfør fem mikroliter af hver fortynding til en ny plade med dyrkningsceller, der testes.Placer pladen i inkubatoren ved 37 grader Celsius og fem procent kuldioxid. Når cellerne er blevet inkuberet i 72 timer, fjernes pladen fra inkubatoren, og den sættes ind i pladelæseren. Åbn imager-softwaren for at konfigurere protokol- og eksperimentfiler til undersøgelsen.Gå til Imager Manual Mode på Jobliste, og klik på Hent nu. Vælg 96 brøndplade som kartype. Vælg 10 gange for forstørrelsen og rødt fluorescerende protein 531 og 593 til billeddannelse tdTomato.Klik på en brønd. Klik derefter på Autofokus for at fokusere billedet, og Automatisk eksponere for korrekt eksponeringstid. Juster fokus og eksponering manuelt, hvis det er nødvendigt.Klik på kameraikonet for at tage billedet. Klik derefter på Procesanalyse ovenfor billede for at fortsætte med at opbygge protokollen. Og vælg fanen Analyse.Til højre for billedet skal du klikke på Mobilanalyse i Tilføj analysetrin og klikke på Start. Billedet viser fremhævede celler for at angive hver enkelt celle. Klik på valg af indstillinger for at ændre parametre for bedre at markere celler baseret på fluorescenstærskel eller cellestørrelse.Hvis billederen tæller cellerne korrekt, skal du klikke på Tilføj trin nederst på skærmen. Klik på ikonet øverst på skærmen for at oprette eksperiment fra billedsættet. Og klik på Procedure under fanen Protokol i det åbne vindue.Vælg derefter Læs i det nye vindue, der åbnes. Klik på Fuld plade for kun at markere de 60 brønde, der indeholder cellerne. Klik på OK for at gemme ændringerne.Klik derefter på OK i vinduet Procedure. Klik på ikonet Afspil for at køre pladen. Gem filen i prompten, og klik derefter på OK i prompten Indlæs plade. Når billeddannelsen er fuldført, skal du downloade celletæltningsdataene fra imagersoftwareprogrammet til et regneark til analyse.Inden for to timer efter afslutningen af tdTomato imaging, begynde MTT assay. Afveje 25 milligram MTT og re-suspendere det i fem milliliter NSC medium til at gøre fem milligram per milliliter MTT lager løsning. Vortex opløsningen i flere minutter, indtil der ikke er synlige udfældere af MTT.Fjern cellekulturplader fra inkubatoren, og inspirer cellekulturmediet af. MTT en til 10 fortyndes i frisk NSC-medium, og der tilsættes 100 mikroliter af den fortyndede MTT til hver cellebode. Inkuber celler ved 37 grader Celsius i to timer.En lilla bundfald er synlig nogenlunde i forhold til antallet af celler i brønden. Aspirere MTT-opløsningen af pladerne, og tilsæt 50 mikroliter på 100% DMSO til hver brønd. Anstænker pladerne på en shaker ved stuetemperatur i 10 minutter ved 400 omdr./min.Derefter overføres pladen til en pladelæser. Læs absorbansen af hver brønd ved den forudindstillede bølgelængde af 595 nanometer, og eksporter data til regneark til analyse, nøjagtigt som for celletællerdataene. Undersøgelse af tdTomato fluorescens billeder afslørede to brønde uharmonisk for toksicitet mellem MTT og celletal assay.For en brønd, viste celletælt data ingen toksicitet. Men MTT data gjorde. En anden brønd havde overvurderet celletal af MTT i forhold til tdTomato tælle, og syntes at have større celler, mens der i brønde, hvor MTT undervurderet celletal i forhold til tdTomato, cellerne syntes at være mindre.Sammenfattende klassificerede tdTomato-analysen 11 forbindelser som giftige, 11 som væksthæmmende, og en som vækstfremmende, med 34, der ikke har nogen tilsyneladende effekt på cellevækst. MTT-analysen klassificerede 13 forbindelser som giftige, to som væksthæmmende, og en som vækstfremmende, med 41 har ingen tilsyneladende effekt på cellevækst. Grafen over levedygtige celler for forbindelsen WP1066 viser en forholdsvis flad kurve uden toksicitet for de fire laveste koncentrationer.Kurven falder hurtigt ved fem mikromolar dosis, og falder til næsten fuld toksicitet ved 10 mikromolar, hvilket fører til den dødelige dosis 50 som 4,4 og 6,0 mikromolære for tdTomato assay og MTT assay. Det er afgørende, at forbindelser er korrekt fortyndet i dosis respons skærmen, således at den korrekte dosis respons kurve genereres. Forbindelser identificeret ved denne procedure til at påvirke cellevækst kan yderligere karakteriseres ved funktionelle analyser til at identificere potentielt nye signalering veje, der styrer cellevækst.Forbindelser, der er giftige for neurale stamceller er blevet testet som potentielle terapeutiske midler til kræft i hjernen, såsom glioblastoma og neuroblastom. Bær altid handsker og en laboratoriekittel, når du håndterer pattedyrceller, DMSO og MTT. Bortskaf DMSO og MTT i henhold til din institutions retningslinjer for kemisk affald.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Udnyttelse af tidsforelt protein-induceret fluorescensforbedring til at identificere stabile lokale konformationer En α-Synuclein Monomer ad gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

En massespektrometribaseret tilgang til identifikation af fosfoproteinphosphataser og deres interaktionorer

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Rekonstitution af Septin-samling ved membraner for at studere biofysiske egenskaber og funktioner

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening for at opnå krystal hits til proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...