Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het NINDS Intramural Research Program.

1. cultuur van de NSC
Opmerking: manipulatie van een menselijke NSC-lijn wordt hieronder beschreven, maar elke cellijn kan voor dit protocol worden gebruikt. Alle celkweek werkzaamheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
<ol><li>Jas een 96-goed bord met kelder membraan/extracellulaire matrix (ECM).<ol>
<li>Hoeveelheid ecu (tabel met materialen) ontdooien, die de bevestiging van de NSC op ijs zal vergemakkelijken. Verdun de ECM naar de juiste concentratie (...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Het primaire doel van dit artikel was om een strategie die efficiënt en goedkoop identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een low-to matige doorvoer screening te beschrijven. Er werden twee orthogonale technieken gebruikt om het celnummer te beoordelen om het vertrouwen in de conclusies te vergroten en aanvullende inzichten te bieden die niet beschikbaar zouden zijn als slechts één enkele test werd gebruikt. Een van de assays gebruikt een fluorescerende celimager om rechtstreeks tdtomaat-p...

Een van de belangrijkste kenmerken die moet worden bepaald voor een chemische verbinding die therapeutische potentie heeft is de toxiciteit voor dierlijke cellen. Dit kenmerk zal bepalen of een medicijn een goede kandidaat is voor een uitgebreidere studie. In de meeste gevallen, verbindingen met minimale toxiciteit worden gezocht, maar er zijn situaties waarin een verbinding met de capaciteit om specifieke celtypen te doden is van belang, bijvoorbeeld, anti-tumorigene drugs. Hoewel hele dieren de beste modelsystemen zijn om systemische toxiciteit te bepalen, zijn de betrokken kosten en arbeid prohibitief wanneer meer dan een paar verbindingen moeten worden getest. Als zodanig wordt de zoogdier celcultuur over het algemeen gebruikt als het meest efficiënte alternatief1,2. Kleine tot middelgrote doorvoer drug schermen zijn een belangrijke modaliteit waardoor toxiciteit kan worden beoordeeld in de celcultuur. Deze schermen kunnen worden gebruikt voor het interroken van geannoleerde bibliotheken die gericht zijn op individuele signalerings trajecten. Het algemene formaat van een dergelijk scherm is om in eerste instantie alle verbindingen in de bibliotheek te testen met een enkelvoudige dosis (over het algemeen 10 μM) in een verkennend primair toxiciteits scherm, en vervolgens een diepgaand secundair dosisrespons scherm uit te voeren om de toxiciteit volledig te karakteriseren Profiel van hits van het primaire scherm. De methoden om deze strategie uit te voeren worden hier beschreven en bieden een snelle, efficiënte en goedkope manier om toxische verbindingen te identificeren en te karakteriseren.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld om de cytotoxiciteit van kleine verbindingen en nanomateriaal in zoogdiercellen3,4te beoordelen. Opgemerkt moet worden dat bepaalde materialen kunnen interageren met de test die misleidende resultaten oplevert, en dergelijke interacties moeten worden getest bij het karakteriseren van hits van toxiciteits schermen4. Cytotoxiciteits testen omvatten trypaan blauwe uitsluiting5, lactaat dehydrogenase (LDH) release assay6, Alamar blue assay7, calcien ACETOXYMETHYL Ester (am)8en de ATP-test9. Al deze assays meten verschillende aspecten van celmetabolisme die als een proxy voor het celnummer fungeren kunnen. Terwijl alle voordelen bieden, tetrazolium zout gebaseerde assays zoals 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), 2, 3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide Inner Salt (XTT)-1, en 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeen disulfonaat (WST-1)10,11 bieden een goede nauwkeurigheid en gebruiksgemak tegen lage kosten. MTT, dat in deze demonstratie zal worden gebruikt, wordt gereduceerd tot een onoplosbare Formazan door een mitochondriale reductase en de snelheid van deze conversie correleert sterk met het celnummer. Deze test is routinematig gebruikt op zowel een kleine schaal en voor het screenen van bibliotheken met maximaal 2.000 verbindingen12. Direct tellen van cellen door een gelabelde marker biedt een andere methode om het mobiele nummer te beoordelen, en in tegenstelling tot de MTT-assay kan het aanvullende informatie geven over de dynamiek van cellulaire groei. Er zijn verschillende algemeen beschikbare algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde celcount-analyses uit te voeren en er zijn ook eigen algoritmen die deel uitmaken van softwarepakketten voor beeldvormings lezers13,14. In deze methode beschrijving, een menselijke neurale stam cel (NSC) lijn die is genetisch bewerkt tot constitutief Express tdTomato15 zal dienen als een test lijn om cellulaire levensvatbaarheid resultaten te vergelijken tussen een MTT assay en een geautomatiseerde celtelling assay in een scherm dat de toxiciteit van 57 teststoffen beoordeelt. Hoewel het primaire doel van deze strategie was om te identificeren en te karakteriseren van giftige stoffen, het heeft het extra voordeel van potentieel identificeren van groei remmende en groei-verbeterende verbindingen en biedt dus een effectieve methode voor het identificeren van drugs die cellulaire groei kan moduleren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Cytotoxiciteit is een kritische parameter die moet worden gekwantificeerd bij het bestuderen van geneesmiddelen die therapeutische voordelen kunnen hebben. Hierdoor, veel drug screening testen maken gebruik van cytotoxiciteit als een van de kritische kenmerken worden geprofileerd voor afzonderlijke verbindingen. Cellen in cultuur zijn een nuttig model om cytotoxiciteit te beoordelen voordat ze overgaan tot het opvolgen van veelbelovende loodverbindingen in duurdere en arbeidsintensieve diermodellen. We beschrijven een strategie voor het identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een tdTomato uitdrukken menselijke neurale stamcellen (NSC) lijn. De strategie maakt gebruik van twee complementaire assays om het celnummer te beoordelen. Eén test werkt via de reductie van 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) naar Formazan als een proxy voor het celnummer en de andere rechtstreeks de tdTomato die NSCs uitdrukt. De twee testen kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een enkel experiment en zijn niet arbeidsintensief, snel en goedkoop. De strategie beschreven in deze demonstratie getest 57 verbindingen in een verkennend primair scherm voor toxiciteit in een 96-well plaat formaat. Drie van de hits werden verder gekarakteriseerd in een zespunts dosisrespons met dezelfde assay-opstelling als het primaire scherm. Naast het verstrekken van uitstekende bevestiging voor toxiciteit, vergelijking van de resultaten van de twee assays kan effectief zijn bij het identificeren van verbindingen die andere aspecten van celgroei beïnvloeden.

De geautomatiseerde cel Count gegevens geïdentificeerd elf verbindingen met minder dan 25% levensvatbaarheid wanneer genormaliseerd naar de DMSO-besturingselement terwijl de MTT gegevens geïdentificeerd deze dezelfde verbindingen plus twee extra degenen (tabel 1 en tabel 2, gearceerd rood). De twee verbindingen bleken alleen giftig in de MTT assay (Wells F3 en G10) had 31% en 39%, respectievelijk, het aantal tdTomato-positieve cellen als de controle en de rangorde waren de volgende twe...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte strategie om tegelijkertijd twee tests te gebruiken om enkele honderden verbindingen te screenen op hun effecten op de celgroei. De tests kunnen ons informatie geven over de vraag of specifieke verbindingen cytotoxisch zijn, celgroei remmen of de celgroei verbeteren. Door gebruik te maken van de twee tests samen, zijn we in staat om de nauwkeurigheid te verhogen en cytotoxische verbindingen te identificeren.In gevallen waarin de resultaten van de twee tests uiteenlopen, kan deze strategie ons in staat stellen om verbinding te identificeren met unieke effecten op de cellulaire functie die verder kunnen worden onderzocht op andere manieren. Het belangrijkste voordeel van deze strategie is dat het snel, goedkoop en niet-arbeidsintensief is. Eenmaal onder de knie, het stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk uit te voeren een primair scherm van maximaal 200 verbindingen in een week, en vervolgens een uitputtende dosis respons curve uit te voeren op 10 tot 15 verbindingen in een andere week.Het aantonen van de procedure zal ikzelf en Rohini Manickam, een stafwetenschapper en post-baccalaureaat collega van het laboratorium. Ten eerste, in een biologische veiligheidskast, kweekcellen in een T75 kolf met NSC-medium, zodat ze ten minste 80% confluent bij het begin van de test. En plaats de kolf in een celkweek incubator ingesteld op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide.Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, verwijdert u de kolf uit de couveuse en haalt u het NSC-medium aan. Voeg drie milliliter celdissociatiereagenmiddel toe en incubbate gedurende vijf minuten in de couveuse. Voeg na incubatie zeven milliliter NSC-medium in de kolf toe en pipet krachtig om ervoor te zorgen dat alle cellen losraken.Breng de gescheiden celoplossing over op een buis van 15 milliliter en vercentrifuge vijf minuten op 200 keer G. Verwijder de supernatant uit de buis en schort de cellen opnieuw op in 10 milliliter NSC-medium. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de cellen te tellen en voeg NSC-medium toe aan de buis om de concentratie cellen aan te passen tot 200.000 cellen per milliliter.Dan, met behulp van zes van de acht sleuven van een acht kanaals multichannel pipettor plaat 100 microliter van de cel mengsel kolom door kolom in 60 binnenputten van drie 96 goed platen die zijn gecoat door extracellulaire matrix. Voeg 100 microliters basismedium of NSC-medium toe aan alle putten zonder cellen om potentiële verdamping van buitenste putten met cellen te minimaliseren. Onder een celcultuurmicroscoop, visueel inspecteren ten minste 10 putten op elk van de drie 96 put platen om te bevestigen dat de cellen zitten op de verwachte dichtheid.Incubeer bij 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Verwijder de celkweekplaten 16 tot 24 uur na het splitsen uit de couveuse en haal nsc-middenkolom per kolom aan met een achtkanaals multi-well pipettor, met slechts zes van de acht multi-well sleuven. Voeg 95 microliter verse NSC medium toe aan elke put van de drie repliceren platen en plaats de platen terug in de couveuse.Met een acht-kanaals multi-well pipettor, voeg 49 microliters van NSC medium in elk van het interieur 60 putten van een lege U-bottomed, V-bodem, of ronde bodem 96 put plaat. Maak de geprepareerde hoofdverzwaarplaat los. Pipette een microliter van de verbinding van de master plaat in elk van het interieur 60 putten met NSC medium, en meng de verdunde verbinding drie keer met een bank top pipettor.Verwijder vervolgens de drie 96 putplaten nscs uit de couveuse en doseer vijf microliter van de verdunde verbinding in elke put van de drie platen die cellen bevatten om een één tot 1000 verdunning te geven voor de uiteindelijke samengestelde concentratie van 10 micromoer met een DMSO-concentratie van 0,1%Incubaatcellen met verbinding gedurende 72 uur, en ga verder met cytotoxiciteitstesten. Om dosisresponstest uit te voeren, stel een 96-put in. Gebruik Kolom Twee voor zes DMSO-controlerepliceert en test drievouden van maximaal drie verschillende verbindingen bij tweevoudige seriële verdunningen, bij zes doses, te beginnen met een hoge dosis van 10 micromolar.Verdun vier microliters van 100%DMSO of testverbinding in DMSO tot 196 microliter van NSC-medium in een 0,5 of 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 25 microliter van de verdunde DMSO toe om putten en 50 microliter van de verdunde testverbindingen aan de bijbehorende putten te controleren. Pipette 25 microliters van NSC medium tot de resterende lege putten in het binnengedeelte van de 96 putplaat.Met een multichannel pipettor, breng 25 microliter van de verbinding van de 10 micromolar putten naar de vijf micromolar putten, en meng ten minste vijf keer. Vervang de pipet tips, en herhaal het proces door het mengen van de resterende rijen te genereren drieledige bij tweevoudige verdunningen voor een totaal van zes doses voor elk van de verbindingen. Breng vijf microliter van elke verdunning over in een nieuwe plaat met kweekcellen die worden getest.Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Nadat cellen 72 uur zijn geïncubeerd, verwijder de plaat uit de couveuse en plaats deze in de plaatlezer. Open de imager-software om protocol- en experimentbestanden voor de studie in te stellen.Ga naar de handmatige modus imager op Taakbeheer en klik op Nu vastleggen. Kies 96 goed plaat als het type schip. Selecteer 10 keer voor de vergroting en rood fluorescerend eiwit 531 en 593 voor beeldvorming tdTomato.Klik op een put. Klik vervolgens op Autofocus om de afbeelding scherp te stellen en Automatisch bloot voor de juiste belichtingstijd. Pas indien nodig handmatig de scherpstelling en belichting aan.Klik op het camerapictogram om de foto vast te leggen. Klik vervolgens op Procesanalyse boven afbeelding om door te gaan met het bouwen van het protocol. En selecteer het tabblad Analyse.Klik rechts van de afbeelding op Cellulaire analyse in De stap Analyse toevoegen en klik op Start. De afbeelding toont gemarkeerde cellen om elke afzonderlijke cel aan te geven. Klik op de selectie Opties om parameters te wijzigen om cellen beter te selecteren op basis van de fluorescentiedrempel of celgrootte.Als de imager de cellen goed telt, klikt u onder aan het scherm op Stap toevoegen. Klik op het pictogram boven aan het scherm om een experiment te maken vanuit de afbeeldingsset. En klik in het geopende venster op Procedure onder het tabblad Protocol.Selecteer Vervolgens in het nieuwe venster dat wordt geopend de optie Lezen. Klik op Volledige plaat om alleen de 60 putten te selecteren die de cellen bevatten. Klik op OK om wijzigingen op te slaan.Klik vervolgens op OK in het venster Procedure. Klik op het pictogram Afspelen om de plaat uit te voeren. Sla in de prompt het bestand op en klik vervolgens in de prompt Laadplaat op OK. Na voltooiing van de beeldvorming, download de cel tellen gegevens van de imager software programma om een spreadsheet voor analyse.Binnen twee uur na het voltooien van tdTomato imaging, beginnen met de MTT test. Weeg 25 milligram MTT af en schort het opnieuw op in vijf milliliter NSC-medium om vijf milligram per milliliter MTT-voorraadoplossing te maken. Vortex de oplossing voor enkele minuten, totdat er geen zichtbare neerslag van MTT.Verwijder celkweekplaten uit de couveuse en aspirate off cell culture medium. Verdun MTT één tot 10 in vers NSC-medium en voeg 100 microliter van de verdunde MTT toe aan elke put cellen. Incubeercellen op 37 graden Celsius gedurende twee uur.Een paarsachtige neerslag is ongeveer zichtbaar in verhouding tot het aantal cellen in de put. Aspirate de MTT oplossing van de platen, en voeg 50 microliter van 100% DMSO aan elke put. Plaats de platen op een shaker op kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 400 RPM.Breng de plaat daarna over naar een plaatlezer. Lees de absorptie van elke put op de vooraf ingestelde golflengte van 595 nanometer en exporteer gegevens naar spreadsheets voor analyse, precies zoals voor de gegevens van het aantal cellen. Onderzoek van tdTomato fluorescentie beelden bleek twee putten discordant voor toxiciteit tussen de MTT en cel telling test.Voor een goed, cel telling gegevens suggereerde geen toxiciteit. Maar MTT gegevens wel. Een andere put had overschat cel telling door MTT ten opzichte van tdTomato tellen, en leek te hebben grotere cellen, terwijl in putten waar MTT onderschat cel telling ten opzichte van tdTomato, de cellen bleek te zijn kleiner.Samengevat, de tdTomato test geclassificeerd 11 verbindingen als giftig, 11 als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 34 met geen duidelijk effect op de celgroei. De MTT-test geclassificeerd 13 verbindingen als giftig, twee als groei remmende, en een als groei te verbeteren, met 41 met geen duidelijk effect op de celgroei. De grafiek van levensvatbare cellen voor de verbinding WP1066 toont een relatief vlakke curve zonder toxiciteit voor de vier laagste concentraties.De curve valt snel bij de vijf micromolar dosis, en daalt tot bijna volledige toxiciteit op 10 micromolar, wat leidt tot de dodelijke dosis 50 als 4,4 en 6,0 micromolar voor de tdTomato test en de MTT test. Het is van cruciaal belang dat verbindingen goed worden verdund in het doseerscherm van de dosisrespons, zodat de juiste dosisresponscurve wordt gegenereerd. Verbindingen die door deze procedure worden geïdentificeerd om celgroei te beïnvloeden, kunnen verder worden gekenmerkt door functionele tests om potentieel nieuwe signaleringstrajecten te identificeren die de celgroei controleren.Verbindingen die giftig zijn voor neurale stamcellen zijn getest als potentiële therapeutische middelen voor hersenkanker, zoals glioblastoom en neuroblastoom. Draag altijd handschoenen en een labjas bij het hanteren van zoogdiercellen, DMSO en MTT. Gooi DMSO en MTT volgens de richtlijnen voor chemisch afval van uw instelling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...