Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom NINDS Intramural Research Program unterstützt.

1. NSC-Kultur
HINWEIS: Die Manipulation einer menschlichen NSC-Linie wird unten beschrieben, aber jede Zelllinie kann für dieses Protokoll verwendet werden. Die gesamte Zellkulturarbeit wird in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
<ol><li>Beschichten Sie eine 96-Well-Platte mit Kellermembran/extrazellulärer Matrix (ECM).<ol>
<li>Thaw aliquot von ECM (Tabelle der Materialien), die Befestigung von NSC erleichtern wird, auf Eis. ECM auf die entsprechende Konze...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Das primäre Ziel dieses Artikels war es, eine Strategie zu beschreiben, die Verbindungen, die das Zellwachstum beeinflussen, effizient und kostengünstig in einem Screening mit niedrigem bis moderatem Durchsatz identifizieren könnte. Zwei orthogonale Techniken wurden verwendet, um die Zellzahl zu bewerten, um das Vertrauen in die Schlussfolgerungen zu erhöhen und zusätzliche Erkenntnisse zu bieten, die nicht verfügbar wären, wenn nur ein einziger Test verwendet würde. Einer der Assays verwendete einen fluoresziere...

Eines der wichtigsten Merkmale, die für eine chemische Verbindung mit therapeutischem Potenzial bestimmt werden müssen, ist ihre Toxizität für tierische Zellen. Diese Eigenschaft wird bestimmen, ob ein Medikament ein guter Kandidat für eine umfassendere Studie ist. In den meisten Fällen werden Verbindungen mit minimaler Toxizität gesucht, aber es gibt Situationen, in denen eine Verbindung mit der Fähigkeit, bestimmte Zelltypen abzutöten, von Interesse ist, z. B. antitumorgene Medikamente. Obwohl ganze Tiere die besten Modellsysteme sind, um die systemische Toxizität zu bestimmen, sind die Damit verbundenen Kosten und Arbeitsstoffe unerschwinglich, wenn mehr als ein paar Verbindungen getestet werden müssen. Als solche Säugetierzellkultur wird in der Regel als die effizienteste Alternativeverwendet 1,2. Kleine bis mittlere Durchsatz-Drogen-Screens sind eine wichtige Modalität, durch die Toxizität in der Zellkultur beurteilt werden kann. Diese Bildschirme können verwendet werden, um annotierte Bibliotheken abzuhören, die auf einzelne Signalwege abzielen. Das allgemeine Format eines solchen Bildschirms besteht darin, zunächst alle Verbindungen in der Bibliothek in einer Einzeldosis (in der Regel 10 M) in einem explorativen primären Toxizitätsbildschirm zu testen und dann einen tiefen Sekundärdosis-Reaktionsbildschirm durchzuführen, um die Toxizität vollständig zu charakterisieren. Profil der Treffer vom primären Bildschirm. Die Methoden zur Umsetzung dieser Strategie werden hier beschrieben und bieten eine schnelle, effiziente und kostengünstige Möglichkeit, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Zytotoxizität kleiner Verbindungen und Nanomaterial in Säugetierzellen3,4zu bewerten. Es sollte beachtet werden, dass bestimmte Materialien mit dem Test interagieren können, der irreführende Ergebnisse liefert, und solche Wechselwirkungen sollten bei der Charakterisierung von Treffern von Toxizitätsbildschirmen getestet werden4. Zytotoxizitäts-Assays umfassen Trypanblau-Ausschluss5, Lactat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest6, Alamar blue assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, und der ATP-Assay9. Alle diese Assays messen verschiedene Aspekte des Zellstoffwechsels, die als Proxy für die Zellzahl dienen können. Während alle Vorteile bieten, Tetrazoliumsalz-basierte Assays wie 3-(4,5-Dimethylthizol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-Tetrazolium-5-carboxyaniliid Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzoldisulfonat (WST-1)10,11 bieten eine gute Genauigkeit und Benutzerfreundlichkeit bei niedrigen Kosten. MTT, das in dieser Demonstration verwendet wird, wird durch eine mitochondriale Reduktase auf ein unlösliches Formazan reduziert, und die Rate dieser Umwandlung korreliert stark mit der Zellzahl. Dieser Assay wurde routinemäßig sowohl in kleinem Maßstab als auch für Screening-Bibliotheken mit bis zu 2.000 Verbindungen12verwendet. Die direkte Zählung von Zellen durch einen markierten Marker bietet eine weitere Methode zur Bewertung der Zellzahl, und im Gegensatz zum MTT-Assay kann es zusätzliche Informationen über die Dynamik des Zellwachstums liefern. Mehrere öffentlich verfügbare Algorithmen stehen zur Verfügung, um automatisierte Zellzählanalysen durchzuführen, und es gibt auch proprietäre Algorithmen, die Teil von Softwarepaketen für Imaging-Reader13,14sind. In dieser Methodenbeschreibung dient eine menschliche neuronale Stammzelllinie (NSC), die genetisch so bearbeitet wurde, dass tdTomato15 konstitutiv ausdrückt, als Testlinie, um die Ergebnisse der zellulären Lebensfähigkeit zwischen einem MTT-Assay und einer automatisierten Zellzählung zu vergleichen. Test in einem Sieb zur Beurteilung der Toxizität von 57 Prüfverbindungen. Obwohl das primäre Ziel dieser Strategie war, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren, hat es den zusätzlichen Vorteil der potenziell identifizierenwachstumshemmenden und wachstumsfördernden Verbindungen und bietet somit eine wirksame Methode zur Identifizierung von Medikamenten die das zelluläre Wachstum modulieren können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Zytotoxizität ist ein kritischer Parameter, der quantifiziert werden muss, wenn Medikamente untersucht werden, die therapeutische Vorteile haben können. Aus diesem Grund, viele Arzneimittel-Screening-Assays nutzen Zytotoxizität als eine der kritischen Eigenschaften für einzelne Verbindungen profiliert werden. Zellen in kultur sind ein nützliches Modell, um die Zytotoxizität zu bewerten, bevor sie vielversprechende Bleiverbindungen in teureren und arbeitsintensiveren Tiermodellen weiterverfolgen. Wir beschreiben eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum in einer tdTomato-exemitzenten menschlichen neuronalen Stammzellenlinie (NSC) beeinflussen. Die Strategie verwendet zwei ergänzende Assays, um die Zellzahl zu bewerten. Ein Assay funktioniert über die Reduktion von 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazan als Proxy für die Zellzahl und der andere zählt direkt die tdTomato-exemitten NSCs. Die beiden Assays können gleichzeitig in einem einzigen Experiment durchgeführt werden und sind nicht arbeitsintensiv, schnell und kostengünstig. Die in dieser Demonstration beschriebene Strategie testete 57 Verbindungen in einem explorativen Primärbildschirm auf Toxizität in einem 96-Well-Plattenformat. Drei der Treffer wurden weiter in einer Sechs-Punkt-Dosis-Antwort mit dem gleichen Assay-Setup wie der primäre Bildschirm charakterisiert. Neben der hervorragenden Bestätigung der Toxizität kann der Vergleich der Ergebnisse der beiden Assays auch bei der Identifizierung von Verbindungen, die andere Aspekte des Zellwachstums beeinflussen, wirksam sein.

Die automatisierten Zellzähldaten identifizierten elf Verbindungen mit weniger als 25 % Lebensfähigkeit bei normalisierter DMSO-Kontrolle, während die MTT-Daten dieselben Verbindungen sowie zwei zusätzliche Verbindungen identifizierten(Tabelle 1 und Tabelle 2, schattiert rot). Die beiden Verbindungen, die nur im MTT-Assay (Wells F3 und G10) als toxisch eingestuft wurden, hatten 31 % bzw. 39 %, die Anzahl der tdTomato-positiven Zellen als Kontroll- und Rangreihenfolge waren die nächs...

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A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Es ist oft notwendig, die potenzielle Zytotoxizität einer Reihe von Verbindungen auf kultivierten Zellen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Strategie, um auf toxische Verbindungen zuverlässig im 96-Well-Format zu überprüfen.

Eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum und das Überleben in kultivierten Säugetierzellen bei niedrigem bis moderatem Durchsatz beeinflussen

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Strategie, um gleichzeitig zwei Assays zu verwenden, um mehrere hundert Verbindungen auf ihre Auswirkungen auf das Zellwachstum zu überprüfen. Die Assays können uns Informationen darüber liefern, ob bestimmte Verbindungen zytotoxisch sind, das Zellwachstum hemmen oder das Zellwachstum verbessern. Durch die Verwendung der beiden Assays zusammen sind wir in der Lage, die Genauigkeit zu erhöhen und zytotoxische Verbindungen zu identifizieren.In Fällen, in denen die Ergebnisse der beiden Assays voneinander abweichen, kann diese Strategie es uns ermöglichen, Verbindung mit einzigartigen Auswirkungen auf die Zellfunktion zu identifizieren, die mit anderen Mitteln weiter untersucht werden können. Der Hauptvorteil dieser Strategie ist, dass sie schnell, kostengünstig und arbeitsintensiv ist. Einmal gemeistert, Es ermöglicht Forschern, leicht einen primären Bildschirm von bis zu 200 Verbindungen in einer Woche durchzuführen, und dann eine erschöpfende Dosis-Reaktionskurve auf 10 bis 15 Verbindungen in einer anderen Woche durchführen.Demonstriert werden ich und Rohini Manickam, ein Mitarbeiter und Post-Baccalaureate-Stipendiat aus dem Labor. Erstens, in einem biologischen Sicherheitsschrank, Kulturzellen in einem T75-Kolben mit NSC-Medium, so dass sie mindestens 80% konfluent sein, wenn der Test beginnt. Und legen Sie den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator, der bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid eingestellt ist.Sobald die Zellen 80% Konfluss erreichen, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und aspirieren Sie Das NSC-Medium. Fügen Sie drei Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu und brüten Sie fünf Minuten im Inkubator. Nach der Inkubation sieben Milliliter NSC-Medium in den Kolben geben und Pipette kräftig geben, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen lösen.Übertragen Sie die dissoziierte Zelllösung auf ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifugieren Bei 200-fachem G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand aus der Röhre und hängen Sie die Zellen in 10 Milliliter NSC-Medium wieder auf. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und fügen Sie NSC-Medium in die Röhre ein, um die Konzentration der Zellen auf 200 000 Zellen pro Milliliter neu zu justieren.Dann, mit sechs der acht Schlitze eines achtKanal-Mehrkanal-Pipettierer, um 100 Mikroliter der Zellmischung Spalte für Spalte in 60 Innenbrunnen von drei 96 Brunnenplatten, die mit extrazellulären Matrix beschichtet wurden. Fügen Sie 100 Mikroliter Basismedium oder NSC-Medium zu allen Brunnen ohne Zellen hinzu, um die potenzielle Verdunstung aus äußersten Brunnen, die Zellen enthalten, zu minimieren. Unter einem Zellkulturmikroskop können Sie mindestens 10 Brunnen auf jeder der drei 96 Brunnenplatten visuell inspizieren, um zu bestätigen, dass die Zellen bei der erwarteten Dichte sitzen.Inkubieren bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Entfernen Sie die Zellkulturplatten 16 bis 24 Stunden nach dem Aufteilen aus dem Inkubator und aspirieren Sie NSC-Mittelspalte für Spalte mit einem acht Kanal-Multi-Well-Pipettor ab, wobei nur sechs der acht Multi-Well-Steckplätze verwendet werden. Fügen Sie 95 Mikroliter frisches NSC-Medium zu jedem Brunnen der drei Replikplatten hinzu und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator.Mit einem acht Kanal Multi-Well Pipettor, fügen Sie 49 Mikroliter NSC Medium in jedem der inneren 60 Brunnen einer leeren U-Boden, V-Boden oder rund-Boden 96 Well Platte. Entsiegeln Sie die vorbereitete Master-Compound-Platte. Einen Mikroliter der Verbindung von der Masterplatte in jeden der inneren 60 Brunnen mit NSC-Medium pfeifen und die verdünnte Verbindung dreimal mit einem Tischpipettor mischen.Als nächstes entfernen Sie die drei 96 Well-Platten von NSCs aus dem Inkubator und geben fünf Mikroliter der verdünnten Verbindung in jeden Brunnen der drei Platten, die Zellen enthalten, um eine ein bis 1000 Verdünnung für die endgültige Zusammengesetztenkonzentration von 10 Mikromolaren mit einer DMSO-Konzentration von 0,1%Inkubationszellen mit Verbindung für 72 Stunden zu erhalten, und fahren mit Zytotoxizitätstests fort. Um Dosis-Wirkungs-Assay durchzuführen, richten Sie einen 96-Brunnen ein. Verwenden Sie Spalte Zwei für sechs DMSO-Kontrollreplikationen und testen Sie Triplizen von bis zu drei verschiedenen Verbindungen bei zweifachen seriellen Verdünnungen, bei sechs Dosen, beginnend mit einer hohen Dosis von 10 Mikromolaren.Vier Mikroliter 100%DMSO oder Testverbindung in DMSO in 196 Mikroliter NSC-Medium in einem 0,5- oder 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verdünnen. Fügen Sie 25 Mikroliter des verdünnten DMSO zur Kontrolle von Brunnen und 50 Mikroliter der verdünnten Testverbindungen zu ihren entsprechenden Brunnen hinzu. Pipette 25 Mikroliter NSC Medium zu den restlichen leeren Brunnen im Inneren der 96 Brunnenplatte.Mit einem Mehrkanalpipettor 25 Mikroliter der Verbindung aus den 10 Mikromolarenbrunnen auf die fünf Mikromolarenbrunnen übertragen und mindestens fünfmal mischen. Ersetzen Sie die Pipettenspitzen, und wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie die verbleibenden Reihen mischen, um Triplicate bei zweifachen Verdünnungen für insgesamt sechs Dosen für jede der Verbindungen zu erzeugen. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in eine neue Platte mit Kulturzellen, die getestet werden.Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nachdem die Zellen 72 Stunden lang inkubiert wurden, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Plattenleser. Öffnen Sie die Imager-Software, um Protokoll- und Experimentierdateien für die Studie einzurichten.Wechseln Sie zum manuellen Imager-Modus im Task-Manager, und klicken Sie auf Jetzt erfassen. Wählen Sie 96 Well Plate als Schiffstyp. Wählen Sie 10 Mal für die Vergrößerung und rotes fluoreszierendes Protein 531 und 593 für die Bildgebung tdTomato.Klicken Sie auf einen Brunnen. Klicken Sie dann auf Autofokus, um das Bild zu fokussieren, und Auto Expose für die richtige Belichtungszeit. Passen Sie bei Bedarf den Fokus und die Belichtung manuell an.Klicken Sie auf das Kamerasymbol, um das Bild aufzunehmen. Klicken Sie dann auf Prozessanalyse oben, um mit dem Erstellen des Protokolls fortzufahren. Und wählen Sie die Registerkarte Analyse aus.Klicken Sie rechts neben dem Bild im Analyseschritt analysieren auf Zellzellanalyse, und klicken Sie auf Start. Das Bild zeigt hervorgehobene Zellen, um jede einzelne Zelle anzuzeigen. Klicken Sie auf die Auswahl Optionen, um Parameter zu ändern, um Zellen basierend auf dem Fluoreszenzschwellenwert oder der Zellengröße besser auszuwählen.Wenn der Bildleiter die Zellen richtig zählt, klicken Sie unten auf dem Bildschirm auf Schritt hinzufügen. Klicken Sie auf das Symbol oben auf dem Bildschirm, um Experimente aus dem Bildsatz zu erstellen. Klicken Sie im geöffneten Fenster unter der Registerkarte Protokoll auf Prozedur.Wählen Sie dann im neuen Fenster, das sich öffnet, Lesen aus. Klicken Sie auf Vollplatte, um nur die 60 Bohrungen auszuwählen, die die Zellen enthalten. Klicken Sie auf OK, um Änderungen zu speichern.Klicken Sie dann im Prozedurfenster auf OK. Klicken Sie auf das Wiedergabesymbol, um die Platte auszuführen. Speichern Sie in der Eingabeaufforderung die Datei, und klicken Sie dann in der Eingabeaufforderung Lastplatte auf OK. Laden Sie nach Abschluss der Bildgebung die Zellenzähldaten aus dem Imager-Softwareprogramm zur Analyse in eine Kalkulationstabelle herunter.Innerhalb von zwei Stunden nach Abschluss der tdTomato-Bildgebung beginnen Sie mit dem MTT-Test. Wiegen Sie 25 Milligramm MTT und setzen Sie es in fünf Milliliter NSC Medium, um fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lagerlösung zu machen. Wirbel die Lösung für mehrere Minuten, bis es keine sichtbaren Ausscheidungen von MTT.Entfernen Sie Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium Zellkultur. VERdünnen Sie MTT ein bis zehn in frischem NSC-Medium und fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten MTT zu jedem Bohrkörper der Zellen hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.Ein purpurner Niederschlag ist in etwa im Verhältnis zur Anzahl der Zellen im Brunnen sichtbar. Saugen Sie die MTT-Lösung von den Platten, und fügen Sie 50 Mikroliter von 100%DMSO zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie die Platten auf einen Shaker bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 400 RPM.Danach die Platte auf einen Plattenleser übertragen. Lesen Sie die Absorption jedes Bohrbrunnens bei der voreingestellten Wellenlänge von 595 Nanometern, und exportieren Sie Daten zur Analyse in die Kalkulationstabelle, genau wie bei den Zellzähldaten. Die Untersuchung von tdTomato Fluoreszenzbildern ergab zwei Brunnen, die sich auf Toxizität zwischen MTT und Zellzahl-Assay diskoraniert.Für einen Brunnen deuteten die Daten über die Zellzahl auf keine Toxizität hin. Aber MTT-Daten taten es. Ein anderer Brunnen hatte die Zellzahl um MTT im Verhältnis zur tdTomato-Zahl überschätzt und schien größere Zellen zu haben, während in Brunnen, in denen MTT die Zellzahl im Vergleich zu tdTomato unterschätzte, die Zellen kleiner zu sein schienen.Zusammenfassend klassifizierte der tdTomato-Assay 11 Verbindungen als toxisch, 11 als wachstumshemmend und eine als wachstumsfördernd, wobei 34 keine offensichtliche Wirkung auf das Zellwachstum hatten. Der MTT-Assay klassifizierte 13 Verbindungen als toxisch, zwei als wachstumshemmend und eine als wachstumsfördernd, wobei 41 keine offensichtliche Wirkung auf das Zellwachstum hatte. Die Grafik der lebensfähigen Zellen für die Verbindung WP1066 zeigt eine relativ flache Kurve ohne Toxizität für die vier niedrigsten Konzentrationen.Die Kurve fällt schnell bei der fünfmikromollaren Dosis und sinkt auf fast volle Toxizität bei 10 Mikromolaren, was zu der tödlichen Dosis 50 als 4,4 und 6,0 Mikromolar für den tdTomato-Assay und den MTT-Assay führt. Es ist wichtig, dass Verbindungen im Dosis-Reaktions-Bildschirm richtig verdünnt werden, so dass die richtige Dosis-Antwort-Kurve erzeugt wird. Verbindungen, die durch dieses Verfahren identifiziert werden, um das Zellwachstum zu beeinflussen, können weiter durch funktionelle Assays charakterisiert werden, um potenziell neuartige Signalwege zu identifizieren, die das Zellwachstum steuern.Verbindungen, die für neuronale Stammzellen toxisch sind, wurden als potenzielle therapeutische Wirkstoffe für Hirntumoren wie Glioblastom und Neuroblastom getestet. Tragen Sie beim Umgang mit Säugetierzellen, DMSO und MTT immer Handschuhe und einen Labormantel. Entsorgen Sie DMSO und MTT gemäß den Richtlinien für chemische Abfälle Ihrer Institution.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Forschung

Biochemie

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...