Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר של NINDS.

1. תרבות המועצה לבטחון לאומי
הערה: מניפולציה של קו המועצה לבטחון לאומי מתוארת להלן, אך ניתן להשתמש בכל קו תא לפרוטוקול זה. כל העבודות בתרבית תאים מתבצעות בארון בטיחות ביולוגי.
<ol><li>מעיל a 96-צלחת עם מטריצות קרום מרתף/מטריתאי (ECM).<ol>
<li>הפשרה של ECM (טבלת חומרים), שתקל על הה?...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

המטרה העיקרית של מאמר זה הייתה לתאר אסטרטגיה שיכולה ביעילות ובזול לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים בהקרנה נמוכה עד בינונית תפוקה. שתי טכניקות אורתוגונאליות נוצלו להערכת מספר התאים כדי להגביר את האמון במסקנות ולהציע תובנות נוספות שלא יהיו זמינות אם נעשה שימוש באחד בלבד. אחד הבחני אומ?...

אחד המאפיינים החשובים ביותר שצריך להיקבע עבור תרכובת כימית כי יש פוטנציאל טיפולי הוא רעילות שלה לתאי בעלי חיים. מאפיין זה יקבע אם הסם הוא מועמד טוב למחקר מקיף יותר. ברוב המקרים, תרכובות עם רעילות מינימלית מבוקשים אך ישנם מצבים בהם מתחם בעל יכולת להרוג סוגי תאים ספציפיים הוא עניין, למשל, תרופות אנטי-מוריגניות. למרות בעלי חיים שלמים הם מערכות מודל הטובה ביותר כדי לקבוע רעילות מערכתית, העלות והעבודה מעורבים הוא מונע כאשר כמה תרכובות צריך להיבדק. כגון תרבות תא של היונקים משמש בדרך כלל כחלופה היעילה ביותר1,2. מסכי הסמים קטנים עד בינוניים הם מודאליות חשוב שדרכו רעילות ניתן להעריך בתרבות התא. מסכי אלה ניתן להשתמש כדי לחקור ספריות מסומן מיקוד מסלולים בודדים איתות. הפורמט הכללי של מסך כזה הוא בתחילה לבדוק את כל התרכובות בספרייה במינון אחד (בדרך כלל 10 μM) במסך רעילות העיקרי גישוש, ולאחר מכן לבצע מינון מעמיק התגובה במינון המסך כדי לאפיין במלואו את רעילות פרופיל של כניסות מהמסך הראשי. השיטות ליישום אסטרטגיה זו יתואר כאן ויספקו דרך מהירה, יעילה וזולה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות.
פותחו מספר שיטות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות קטנות וננו בתאי מיונקים3,4. יש לציין כי חומרים מסוימים יכולים לקיים אינטראקציה עם הספקות המספקים תוצאות מטעות, ואינטראקציות כאלה יש לבדוק כאשר מדובר במאפיינים של מסכי רעילות4. רעילות ציטודיטוקסין כוללת טריפן כחול5, לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התשובה6, alamar שיטת כחול7, מתיל אסתר (AM)8, ואת שיטת ATP9. כל אלה בחני למדוד היבטים שונים של מטבוליזם התא אשר יכול לשמש proxy עבור מספר התא. בעוד שכולם מציעים יתרונות, aszo, מלח מבוסס על מלחים כגון 3-(4, 5-diמתילthizol-2-yl)-2, 5-דיפנפניזויום ברומיד (MTT), 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfopheny)-2H-טטרזויום-5-carboxyande מלח פנימי (XTT)-1, ו-4-(3-[4- שפתי-על-2-[4-ניטרוגליצרין)-2H-5-טטרזוליו-1, 3-בנזין דיסולולאט (WST-1)10, 11 לספק דיוק טוב וקלות השימוש בעלות נמוכה. MTT, אשר ישמשו בהפגנה זו, הוא הופחת לתוך בלתי מסיסים על ידי מיטוכונדריאלי ושיעור ההמרה הזאת באופן מאוד מתאים למספר התא. מקרה זה נוצל באופן שגרתי הן בקנה מידה קטן והן לסינון ספריות עם עד 2,000 תרכובות12. ספירה ישירה של תאים על-ידי סמן המסומן בתווית מציעה שיטה נוספת להערכת המספר הסלולרי, ובשונה מהזמינותו של MTT היא יכולה לספק מידע נוסף על הדינמיקה של צמיחת הסלולר. מספר אלגוריתמים זמינים לציבור זמינים לביצוע ניתוחים אוטומטיים של ספירת תאים וקיימים גם אלגוריתמים קנייניים המהווים חלק מחבילות תוכנה לקוראי תמונות13,14. בתיאור שיטה זה, קו גזע הגוף האנושי (למועצה לבטחון לאומי) שנערך באופן גנטי כדי להשוות את תוצאות הכדאיות התאית בין שיטת mtt וספירת תאים אוטומטיים הערכה במסך הערכת רעילות של 57 תרכובות מבחן. למרות שהמטרה העיקרית של האסטרטגיה הזאת הייתה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות, יש לה יתרון נוסף של הפוטנציאל לזיהוי מעכבות צמיחה ושיפור תרכובות הצמיחה וכך מספקת שיטה יעילה לזיהוי סמים שיכולים לווסת את הצמיחה התאית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

רעילות ציטוזה הוא פרמטר קריטי שצריך לכמת כאשר לימוד תרופות שעשויות להיות בעלי הטבות טיפוליות. בגלל זה, הרבה סמים הקרנת התרופה לנצל את הרעילות בתור אחד המאפיינים הקריטיים להיות פרופיל עבור תרכובות בודדות. תאים בתרבות הם מודל שימושי כדי להעריך את הרעילות לפני שתמשיך לעקוב אחר תרכובות עופרת מבטיח יקר יותר, עבודה אינטנסיבית בעלי חיים מודלים. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ב tdTomato ביטוי בתאי גזע האדם העצבי (המועצה לבטחון לאומי) קו. האסטרטגיה משתמשת בשני משלים משלימים להערכת מספר התא. שיטת עבודה אחת פועלת באמצעות הפחתה של 3-(4, 5-diמתילתיול-2-yl)-2, 5-diפנילטיזויום ברומיד (MTT) כדי formazan כמו פרוקסי עבור מספר התא והשני במישרין סופרת את tdTomato המבטאת NSCs. שתי הדרישות יכולות להתבצע בו זמנית בניסוי אחד ואינן העבודה האינטנסיבית, המהירה והזולה. האסטרטגיה המתוארת בהפגנה זו נבדקה 57 תרכובות במסך ראשי מנוסה לרעילות בפורמט 96-באר הצלחת. שלוש מהתצפיות הוגדרו עוד יותר בתגובה למינון של שש נקודות, תוך שימוש באותה מערכת הערכה כמסך הראשי. בנוסף למתן אימות מעולה עבור רעילות, השוואה של תוצאות שתי בחני עשוי להיות יעיל בזיהוי תרכובות המשפיעות על היבטים אחרים של צמיחת תאים.

הנתונים האוטומטיים ספירת תאים זיהה אחד-עשר תרכובות עם פחות מ -25% כדאיות כאשר מנורמל לפקד DMSO בעוד נתוני MTT זיהה אותם תרכובות ועוד שני אחרים (טבלה 1 ושולחן 2, מוצל אדום). שני תרכובות נמצאו רעילים רק בתוך שיטת MTT (בארות F3 ו G10) היו 31% ו 39%, בהתאמה, מספר תאים tdTomato-חיוביים כפקד ועל ידי ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מהירה ויעילה להשתמש בו זמנית שני assays כדי לסנן כמה מאות תרכובות עבור ההשפעות שלהם על צמיחת התאים. ה- assays יכול לספק לנו מידע על אם תרכובות ספציפיות הן cytotoxic, לעכב את צמיחת התאים, או לשפר את צמיחת התא. על ידי ניצול שתי התרכובות יחד, אנו מסוגלים להגביר את הדיוק ולזהות תרכובות ציטוטוקסיות.במקרים שבהם התוצאות של שתי הבדיקות מתפצלות, אסטרטגיה זו עשויה לאפשר לנו לזהות תרכובת עם השפעות ייחודיות על התפקוד התאי שניתן לבחון עוד באמצעים אחרים. היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו הוא שהיא מהירה, זולה ואינטנסיבית שאינה עבודה. לאחר השליטה, זה מאפשר לחוקרים לבצע בקלות מסך ראשי של עד 200 תרכובות בשבוע אחד, ולאחר מכן לבצע עקומת תגובה מינון ממצה על 10 עד 15 תרכובות בשבוע אחר.הדגמת ההליך תהיה אני ורוהיני מניקאם, מדען צוות ועמית פוסט-תואר ראשון מהמעבדה. ראשית, בארון בטיחות ביולוגי, תאי תרבות בבקבוק T75 עם מדיום המל"ל, כך שהם יהיו לפחות 80% confluent בעת תחילת המבחן. ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו-חמצני.ברגע שהתאים מגיעים ל-80%, מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ושואבים את מדיום המל"ל. מוסיפים שלושה מיליליטר של ניתוב תאים ודגירה במשך חמש דקות באינקובטור. לאחר הדגירה, מוסיפים שבעה מיליליטר של מדיום המל"ל בבקבוקון, ואת פיפטה במרץ כדי להבטיח שכל התאים יתנתקו.מעבירים את פתרון התא המנותק לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי מהצינור והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום המל"ל. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemocytometer לספור את התאים, ולהוסיף מדיום NSC לתוך הצינור כדי להסתגל מחדש את ריכוז התאים ל 200, 000 תאים למיליליטר.לאחר מכן, באמצעות שישה מתוך שמונת החריצים של pipettor רב ערוצי שמונה ערוצים כדי צלחת 100 microliters של עמוד תערובת התא בעמודה ב 60 בארות פנימיות של שלוש 96 צלחות היטב כי כבר מצופה מטריצה חוץ תאית. הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום בסיס או בינוני NSC לכל בארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מן בארות החיצוניות המכילות תאים. תחת מיקרוסקופ של תאים, בדקו ויזואלית לפחות 10 בארות בכל אחת משלוש 96 צלחות הבאר כדי לאשר שהתאים יושבים בצפיפות הצפויה.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. הסר את לוחות תרבות התאים מהחרם 16 עד 24 שעות לאחר הפיצול, ושואב את העמודה הבינונית של המל"ל בעמודה אחר עמודה עם צינור רב-תכליתי בן שמונה ערוצים, תוך שימוש רק בשישה מתוך שמונת החריצים מרובי הבאר. הוסיפו 95 מיקרוליטרים של מדיום NSC טרי לכל באר של שלוש הצלחות המשוכפלות, והחזרו את הצלחות לאנקובטור.עם pipettor רב היטב שמונה ערוצים, להוסיף 49 microliters של מדיום NSC לתוך כל אחד 60 בארות הפנים של U-bottomed ריק, V-bottomed, או עגול תחתית 96 צלחת היטב. בטלו את הריסת צלחת התרכובת הראשית המוכנה. פיפטה מיקרוליטר אחד של המתחם מצלחת האב לכל אחת מ-60 בארות הפנים המכילות את מדיום המל"ל, ומערבבים את המתחם המדולל שלוש פעמים עם צינור עליון ספסל.לאחר מכן, להסיר את שלוש 96 צלחות באר של NSCs מהאינקובטור ולחלק חמישה microliters של המתחם מדולל לתוך כל באר של שלוש צלחות המכילות תאים להניב דילול אחד עד 1000 עבור הריכוז המורכב הסופי של 10 micromolar עם ריכוז DMSO של 0.1% אינקובט תאים עם תרכובת במשך 72 שעות, ולהמשיך עם assays cytotoxicity. כדי לבצע בדיקת תגובה מינון, להגדיר 96 גם. השתמש בעמודה 2 עבור שישה שכפולים בקרת DMSO, ולבדוק משולשים של עד שלוש תרכובות שונות בדילול סדרתי כפול, בשש מנות, החל במינון גבוה של 10 micromolar.לדלל ארבעה microliters של 100% DMSO או תרכובת בדיקה ב DMSO לתוך 196 microliters של מדיום NSC בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 או 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטרים של DMSO מדולל לשליטה בארות, ו 50 microliters של תרכובות הבדיקה מדולל הבאר המתאימה שלהם. פיפטה 25 מיקרוליטרים של מדיום המל"ל ל שאר בארות ריקות בחלק הפנימי של צלחת 96 באר.בעזרת צינור רב-ערוצי, מעבירים 25 מיקרוליטרים של התרכובת מ-10 בארות המיקרומולרים לחמש בארות המיקרומולריות, ומערבבים לפחות חמש פעמים. החלף את טיפים פיפטה, ולחזור על התהליך על ידי ערבוב השורות הנותרות כדי ליצור משולשים בדילול כפול עבור סך של שש מנות עבור כל אחת מהתרכובות. מעבירים חמישה מיקרוליטרים של כל דילול לצלחת חדשה עם תאי תרבות שנבדקים.מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני. לאחר התאים כבר דגירה במשך 72 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה למקם אותו בתוך קורא הלוח. פתח את תוכנת התמונה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים למחקר.עבור אל מצב ידני של Imager במנהל המשימות ולחץ על לכוד כעת. בחר 96 גם צלחת כמו סוג הכלי. בחרו 10 פעמים להגדלה, וחלבון פלואורסצנטי אדום 531 ו-593 להדמיית tdTomato.לחץ על באר. לאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, וחשוף אוטומטית לזמן חשיפה מתאים. התאימו ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על נתח תהליך לעיל כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול. ובחר בכרטיסיה ניתוח.מימין לתמונה, לחצו על 'ניתוח תאי' ב'הוסף שלב ניתוח' ולחצו על 'התחל'. התמונה מציגה תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. לחץ על הבחירה אפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור טוב יותר תאים בהתבסס על סף הפלואורסצנטיות או גודל התא.אם התמונה סופרת כראוי את התאים, לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך. לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות. ובחלון הפתוח, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול.לאחר מכן, בחלון החדש שנפתח, בחר קרא. לחץ על לוח מלא כדי לבחור רק את 60 הבאר המכילות את התאים. לחץ על אישור כדי לשמור שינויים.לאחר מכן לחץ על אישור בחלון פרוצדורה. לחץ על סמל הפעל כדי להפעיל את הלוח. בבקשה, שמרו את הקובץ ולאחר מכן, בבקשה 'טען לוח', לחצו על הלחצן 'אשר'. עם השלמת ההדמיה, הורד את נתוני ספירת התאים מתוכנית הדמיה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.בתוך שעתיים מהשלמת הדמיית tdTomato, להתחיל את ההקדמה MTT. לשקול 25 מיליגרם של MTT ולהשעות אותו מחדש בחמישה מיליליטר של מדיום NSC כדי להפוך חמישה מיליגרם לכל פתרון מלאי MTT מיליליטר. Vortex הפתרון במשך כמה דקות, עד שאין משקעים גלויים של MTT.הסר צלחות תרבות תאים מהחרם ושואב את מדיום תרבות התא. לדלל MTT אחד עד 10 במדיום NSC טרי, ולהוסיף 100 microliters של MTT מדולל לכל באר של תאים. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.משקעים גרגריים גלויים בערך ביחס למספר התאים באר. שאפו את פתרון MTT מהצלחות, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של 100% DMSO לכל באר. מניחים את הצלחות על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 400 סל"ד.לאחר מכן, להעביר את הצלחת לקורא צלחת. קרא את הספיגה של כל באר באורך הגל המוגדר מראש של 595 ננומטר, וייצא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח, בדיוק כמו עבור נתוני ספירת התאים. בדיקה של תמונות פלואורסצנטיות tdTomato גילה שתי בארות צורם רעילות בין MTT וספירת תאים בדיקה.עבור באר אחת, נתוני ספירת תאים לא הראו רעילות. אבל נתוני MTT עשו. באר אחרת העריכה יתר על המידה את ספירת התאים על ידי MTT ביחס לספירת tdTomato, ונראה שיש לה תאים גדולים יותר, ואילו בארות שבהן MTT לא העריך כראוי את ספירת התאים ביחס ל- tdTomato, התאים נראו קטנים יותר.לסיכום, tdTomato assay מסווג 11 תרכובות רעיל, 11 כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 34 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. בדיקת MTT מסווג 13 תרכובות רעיל, שניים כמו עיכוב צמיחה, ואחד כמו שיפור הצמיחה, עם 41 אין השפעה נראית לעין על צמיחת התא. הגרף של תאים קיימא עבור WP1066 המתחם מראה עקומה שטוחה יחסית ללא רעילות עבור ארבעת הריכוזים הנמוכים ביותר.העקומה נופלת במהירות במינון של חמישה מיקרומולרים, ויורדת לרעילות כמעט מלאה ב-10 מיקרומולרים, מה שמוביל למינון הקטלני 50 כ-4.4 ו-6.0 מיקרומולר לצורך בדיקת TdTomato וההתמדה של MTT. זה קריטי כי תרכובות מדוללים כראוי במסך התגובה מינון, כך עקומת התגובה המינון הנכון נוצר. תרכובות שזוהו על ידי הליך זה כדי להשפיע על צמיחת תאים יכול להיות מאופיין עוד יותר על ידי בדיקות תפקודיות כדי לזהות מסלולי איתות פוטנציאליים חדשניים לשלוט צמיחת תאים.תרכובות רעילות לתאי גזע עצביים נבדקו כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים לסרטן המוח, כגון גליובלסטומה ונוירובלסטומה. תמיד ללבוש כפפות ומעיל מעבדה בעת טיפול בתאי יונקים, DMSO, ו MTT. השלך DMSO ו- MTT בהתאם להנחיות הפסולת הכימית של המוסד שלך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...