Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal NINDS Intramural Research Program.

1. Cultura NSC
NOTA: La manipolazione di una linea NSC umana verrà descritta di seguito, ma qualsiasi linea cellulare può essere utilizzata per questo protocollo. Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in un armadietto di sicurezza biologica.
<ol><li>Cappotto una piastra di 96 pozzetto con membrana seminterrato/matrice extracellulare (ECM).<ol>
<li>Scongelare l'aliquota di ECM (Tabella dei materiali), che faciliterà l'attaccamento di NSC, sul ghiaccio. Diluir...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

L'obiettivo principale di questo articolo era descrivere una strategia in grado di identificare in modo efficiente e conveniente i composti che influenzano la crescita delle cellule in uno screening a bassa o moderata velocità effettiva. Sono state utilizzate due tecniche ortogonali per valutare il numero di cellule per aumentare la fiducia nelle conclusioni e offrire ulteriori approfondimenti che non sarebbero disponibili se fosse stato utilizzato un solo saggio. Uno dei saggi ha usato un imager cellulare fluorescente ...

Una delle caratteristiche più importanti che deve essere determinata per un composto chimico che ha un potenziale terapeutico è la sua tossicità per le cellule animali. Questa caratteristica determinerà se un farmaco è un buon candidato per uno studio più ampio. Nella maggior parte dei casi, si cercano composti con tossicità minima, ma ci sono situazioni in cui un composto con la capacità di uccidere specifici tipi di cellule è di interesse, ad esempio, farmaci anti-tumigenici. Anche se gli animali interi sono i migliori sistemi modello per determinare la tossicità sistemica, il costo e la manodopera coinvolti sono proibitivi quando più di un paio di composti devono essere testati. Come tale coltura cellulare mammiferi è generalmente utilizzato come l'alternativa più efficiente1,2. Gli schermi farmacologici di medio-piccolo e medio throughput sono una modalità importante attraverso la quale la tossicità può essere valutata nella coltura cellulare. Queste schermate possono essere utilizzate per interrogare le librerie con notato che prendono di mira singoli percorsi di segnalazione. Il formato generale di tale schermo è quello di testare inizialmente tutti i composti della libreria ad una singola dose (generalmente 10 M) in uno schermo di tossicità primaria esplorativo, e quindi eseguire uno schermo di risposta alla dose secondaria approfondita per caratterizzare completamente la tossicità profilo degli hit dalla schermata principale. I metodi per implementare questa strategia saranno descritti qui e forniranno un modo rapido, efficiente ed economico per identificare e caratterizzare i composti tossici.
Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la citotossicità di piccoli composti e nanomateriali nelle cellule dei mammiferi3,4. Va notato che alcuni materiali possono interagire con il saggio fornendo risultati fuorvianti, e tali interazioni dovrebbero essere testate quando caratterizzano i colpi provenienti da schermi di tossicità4. I saggi di citotossicità includono l'esclusione blu trypan5, lattato dehydrogenase (LDH) rilasciare asdetto6, Alamar blu assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, e il test ATP9. Tutti questi saggi misurano vari aspetti del metabolismo cellulare che può servire come proxy per il numero di cellule. Mentre tutti offrono vantaggi, saggi a base di sale di tetrazolium come 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MT ), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sale interno (XTT)-1, e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonato (WST-1)10,11 fornire una buona precisione e facilità d'uso a basso costo. L'MTT, che verrà utilizzato in questa dimostrazione, è ridotto a un formazan insolubile da una riduttrice mitocondriale e il tasso di questa conversione è fortemente correlato al numero di cellulare. Questo saggio è stato regolarmente utilizzato sia su piccola scala che per le librerie di screening con fino a 2.000 composti12. Il conteggio diretto delle cellule da parte di un marcatore etichettato offre un altro metodo per valutare il numero cellulare e, a differenza dell'analisi MTT, può fornire informazioni aggiuntive sulle dinamiche della crescita cellulare. Diversi algoritmi pubblicamente disponibili sono disponibili per eseguire analisi automatizzate del conteggio delle celle e ci sono anche algoritmi proprietari che fanno parte di pacchetti software per lettori di imaging13,14. In questa descrizione del metodo, una linea di cellule staminali neurali umane (NSC) che è stata geneticamente modificata per sovrattuazionalmente esprimere tdTomato15 servirà come una linea di prova per confrontare i risultati della vitalità cellulare tra un saggio MTT e un conteggio automatico delle cellule un'immagine in una schermata che valuta la tossicità di 57 composti di prova. Anche se l'obiettivo principale di questa strategia era quello di identificare e caratterizzare i composti tossici, ha il vantaggio aggiuntivo di identificare potenzialmente i composti inibitori della crescita e di miglioramento della crescita e quindi fornisce un metodo efficace per identificare i farmaci che può modulare la crescita cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

La citotossicità è un parametro critico che deve essere quantificato quando si studiano farmaci che possono avere benefici terapeutici. Per questo motivo, molti saggi di screening farmacologico utilizzano la citotossicità come una delle caratteristiche critiche da profilare per i singoli composti. Le cellule nella coltura sono un modello utile per valutare la citotossicità prima di procedere a seguire composti di piombo promettenti in modelli animali più costosi e ad alta intensità di lavoro. Descriviamo una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare in una linea di tdTomato che esprime cellule staminali neurali umane (NSC). La strategia utilizza due saggi complementari per valutare il numero di cellulare. Un saggio funziona attraverso la riduzione di 3-(4,5-dimetilthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) a formazan come proxy per il numero di cellulare e l'altro conta direttamente il tdTomato che esprime NSC. I due saggi possono essere eseguiti contemporaneamente in un unico esperimento e non sono laboriosi, rapidi e poco costosi. La strategia descritta in questa dimostrazione ha testato 57 composti in uno schermo primario esplorativo per la tossicità in un formato di piastra di 96 pozze. Tre dei colpi sono stati ulteriormente caratterizzati in una risposta alla dose di sei punti utilizzando lo stesso set-up assay come lo schermo primario. Oltre a fornire un'eccellente corroborazione per la tossicità, il confronto dei risultati dei due saggi può essere efficace nell'identificare i composti che interessano altri aspetti della crescita cellulare.

I dati automatizzati del conteggio delle cellule hanno identificato undici composti con minore del 25% di fattibilità quando vengono normalizzati al controllo DMSO, mentre i dati MTT identificavano questi stessi composti più due ulteriori (Tabella 1 e Tabella 2, rosso scuro). I due composti trovati tossici solo nell'esempio MTT (pozzi F3 e G10) avevano rispettivamente il 31% e il 39%, il numero di cellule tdTomato-positive come controllo e per ordine di rango erano i successivi due com...

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A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Questo protocollo offre una strategia rapida ed efficiente per utilizzare contemporaneamente due test per schermare diverse centinaia di composti per i loro effetti sulla crescita cellulare. I test possono fornirci informazioni sul fatto che composti specifici siano citotossici, inibiscono la crescita cellulare o migliorano la crescita cellulare. Utilizzando i due test insieme, siamo in grado di aumentare la precisione e identificare composti citotossici.Nei casi in cui i risultati dei due saggi divergono, questa strategia può permetterci di identificare composti con effetti unici sulla funzione cellulare che possono essere ulteriormente esaminati con altri mezzi. Il vantaggio principale di questa strategia è che è veloce, economico e non laborioso. Una volta padroneggiato, consente ai ricercatori di eseguire facilmente uno schermo primario fino a 200 composti in una settimana, quindi eseguire una curva di risposta alla dose esaustiva su 10-15 composti in un'altra settimana.A dimostrare la procedura ci saranno io e Rohini Manickam, scienziato dello staff e compagno di maturità del laboratorio. In primo luogo, in un armadietto di sicurezza biologica, le cellule di coltura in un pallone T75 con mezzo NSC in modo che siano almeno confluenti all'80% all'inizio del test. E posizionare il pallone in un incubatore di coltura cellulare fissato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il pallone dall'incubatore e aspirare fuori dal mezzo NSC. Aggiungere tre millilitri di reagente di dissociazione cellulare e incubare per cinque minuti nell'incubatrice. Dopo l'incubazione, aggiungere sette millilitri di mezzo NSC nel pallone e pipettare vigorosamente per assicurarsi che tutte le cellule si distaccno.Trasferire la soluzione cellulare dissociata in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante dal tubo e sospendere di nuovo le celle in 10 millilitri di mezzo NSC. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per contare le cellule e aggiungere il mezzo NSC nel tubo per riadattare la concentrazione di cellule a 200.000 cellule per millilitro.Quindi, utilizzando sei degli otto slot di un pipettor multicanale a otto canali per placcare 100 microlitri della miscela cellulare colonna per colonna in 60 pozzi interni di tre piastre a 96 pozzi che sono state rivestite da matrice extracellulare. Aggiungere 100 microlitri di supporto di base o mezzo NSC a tutti i pozzi senza celle per ridurre al minimo la potenziale evaporazione da pozzi più esterni contenenti cellule. Al microscopio a coltura cellulare, ispezionare visivamente almeno 10 pozzi su ciascuna delle tre 96 piastre del pozzo per confermare che le cellule sono seduti alla densità prevista.Incubare a 37 gradi Celsius e al cinque per cento di anidride carbonica. Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore da 16 a 24 ore dopo la scissione e aspirare fuori colonna media NSC per colonna con un pipettor multi-pozzo a otto canali, utilizzando solo sei degli otto slot multi-pozzo. Aggiungere 95 microlitri di mezzo NSC fresco a ciascun pozzo delle tre piastre replicate e riposizionare le piastre nell'incubatore.Con un pipettor multi-pozzo a otto canali, aggiungere 49 microlitri di mezzo NSC in ciascuno dei 60 pozzali interni di una piastra vuota con fondo a U, con fondo a V o a fondo rotondo 96. Srotopare la piastra composta principale preparata. Pipettare un microlitro del composto dalla piastra principale in ciascuno dei 60 pozzetti interni contenenti mezzo NSC e mescolare il composto diluito tre volte con un pipettor da banco.Successivamente, rimuovere le tre piastre di 96 pozza di NSC dall'incubatore e erogare cinque microlitri del composto diluito in ogni pozzo delle tre piastre che contengono cellule per produrre una diluizione da uno a 1000 per la concentrazione finale del composto di 10 micromolare con una concentrazione DMSO dello 0,1%Incubare celle con composto per 72 ore e procedere con test di citotossicità. Per eseguire il test di risposta alla dose, impostare un pozzo 96. Utilizzare la colonna due per sei repliche di controllo DMSO e testare triplicati fino a tre composti diversi a due diluizioni seriali, a sei dosi, a partire da un'alta dose di 10 micromolari.Diluire quattro microlitri di DMSO al 100% o di composto di prova in DMSO in 196 microlitri di mezzo NSC in un tubo di microcentrifugo da 0,5 o 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri del DMSO diluito per controllare i pozzi e 50 microlitri dei composti di prova diluiti ai loro pozzi corrispondenti. Pipetta 25 microlitri di NSC medio ai restanti pozzi vuoti nella parte interna della piastra del pozzo 96.Con un pipettor multicanale, trasferire 25 microlitri del composto dai 10 pozzi micromolari ai cinque pozzi micromolari e mescolare almeno cinque volte. Sostituire le punte della pipetta e ripetere il processo mescolando le file rimanenti per generare triplicati a due diluizioni per un totale di sei dosi per ciascuno dei composti. Trasferire cinque microlitri di ogni diluizione in una nuova piastra con celle di coltura che sono in fase di test.Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule sono state incubate per 72 ore, rimuovere la piastra dall'incubatore e posizionarla all'interno del lettore di piastre. Aprire il software imager per impostare i file di protocollo e di esperimento per lo studio.Passare alla modalità manuale imager in Task Manager e fare clic su Acquisisci ora. Scegli 96 piastre e il tipo di nave. Selezionare 10 volte per l'ingrandimento e la proteina fluorescente rossa 531 e 593 per l'imaging tdTomato.Clicca su un pozzo. Quindi fare clic su Messa a fuoco automatica per mettere a fuoco l'immagine ed Esporre automaticamente per il tempo di esposizione corretto. Regolare manualmente la messa a fuoco e l'esposizione, se necessario.Fare clic sull'icona della fotocamera per acquisire l'immagine. Quindi fare clic su Analisi processo sopra l'immagine per continuare a creare il protocollo. E selezionare la scheda Analisi.A destra dell'immagine fare clic su Analisi cellulare in Aggiungi passaggio analisi e quindi su Avvia. L'immagine mostra le celle evidenziate per indicare ogni singola cella. Fare clic sulla selezione Opzioni per modificare i parametri per selezionare meglio le celle in base alla soglia di fluorescenza o alle dimensioni della cella.Se l'imager conta correttamente le celle, fare clic su Aggiungi passaggio nella parte inferiore dello schermo. Fare clic sull'icona nella parte superiore dello schermo per creare un esperimento dal set di immagini. Nella finestra aperta fare clic su Procedura nella scheda Protocollo.Quindi, nella nuova finestra visualizzata, selezionare Leggi. Fate clic su Piastra completa (Full Plate) per selezionare solo i 60 pozzi che contengono le celle. Fare clic su OK per salvare le modifiche.Quindi fare clic su OK nella finestra Procedura. Fare clic sull'icona Riproduci per eseguire la piastra. Nel prompt salvare il file e quindi nel prompt Piastra di caricamento fare clic su OK. Al termine dell'imaging, scaricare i dati del conteggio delle celle dal programma software imager in un foglio di calcolo per l'analisi.Entro due ore dal completamento dell'imaging tdTomato, iniziare il test MTT. Pesare 25 milligrammi di MTT e sospenderlo in cinque millilitri di mezzo NSC per realizzare cinque milligrammi per millilitro soluzione stock MTT. Vortice la soluzione per diversi minuti, fino a quando non ci sono precipitati visibili di MTT.Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare il mezzo di coltura cellulare. Diluire MTT da uno a 10 in mezzo NSC fresco e aggiungere 100 microlitri dell'MTT diluito ad ogni pozzo di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore.Un precipitato violaceo è visibile approssimativamente in proporzione al numero di cellule nel pozzo. Aspirare la soluzione MTT dalle piastre e aggiungere 50 microlitri di 100%DMSO a ciascun pozzo. Posizionare le piastre su uno shaker a temperatura ambiente per 10 minuti a 400 giri/min.Successivamente, trasferire la piastra a un lettore di lastre. Leggere l'assorbanza di ogni pozzo alla lunghezza d'onda preimpostata di 595 nanometri ed esportare i dati in foglio di calcolo per l'analisi, esattamente come per i dati del conteggio delle celle. L'esame delle immagini della fluorescenza del tdTomato ha rivelato due pozzi discordanti per la tossicità tra l'MTT e il saggio sul conteggio delle cellule.Per un pozzo, i dati sul conteggio delle cellule non hanno suggerito tossicità. Ma i dati MTT sì. Un altro pozzo aveva sovrastimato il numero di cellule per MTT rispetto al numero di tdTomato, e sembrava avere cellule più grandi, mentre nei pozzi in cui MTT sottovalutò il numero di cellule rispetto a tdTomato, le cellule sembravano essere più piccole.In sintesi, il saggio tdTomato ha classificato 11 composti come tossici, 11 come inibitori della crescita e uno come miglioramento della crescita, con 34 che non hanno alcun effetto apparente sulla crescita cellulare. Il saggio MTT ha classificato 13 composti come tossici, due come inibitori della crescita e uno come miglioramento della crescita, con 41 che non hanno alcun effetto apparente sulla crescita cellulare. Il grafico delle cellule vitali per il composto WP1066 mostra una curva relativamente piatta senza tossicità per le quattro concentrazioni più basse.La curva cade rapidamente alla dose di cinque micromolari e scende a tossicità quasi completa a 10 micromolari, il che porta alla dose letale 50 come micromolare 4.4 e 6.0 per il test tdTomato e il saggio MTT. È fondamentale che i composti siano correttamente diluiti nella schermata di risposta alla dose in modo da generare la curva di risposta alla dose corretta. I composti identificati da questa procedura per influenzare la crescita cellulare possono essere ulteriormente caratterizzati da test funzionali per identificare percorsi di segnalazione potenzialmente nuovi che controllano la crescita cellulare.I composti tossici per le cellule staminali neurali sono stati testati come potenziali agenti terapeutici per i tumori cerebrali, come il glioblastoma e il neuroblastoma. Indossare sempre guanti e un camice da laboratorio quando si maneggiano cellule di mammiferi, DMSO e MTT. Smalti DMSO e MTT secondo le Linee guida sui rifiuti chimici della tua istituzione.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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