Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
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이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

1. NSC 문화
참고: 인간 NSC 라인의 조작은 아래에 설명될 것이지만 모든 세포주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 모든 세포 배양 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
<ol><li>지하 막 / 세포 외 매트릭스 (ECM)로 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.<ol>
<li>얼음에 NSC의 부착을 용이하게하는 ECM(재료의 테이블)의aliquot를 해동합니다. ECM을 10 mL 염기배지(표)에...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. 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P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

이 문서의 주요 목표는 낮은-중간 처리량 스크리닝에서 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 효율적이고 저렴하게 식별할 수 있는 전략을 설명하는 것이었습니다. 2개의 직교 기술은 결론에 있는 신뢰를 증가하고 단 하나 분석분석만 사용된 경우에 유효하지 않을 추가 통찰력을 제안하기 위하여 세포 수를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 상기 한 가지 는 형광 세포 이미저를 사용하여 tdTomato 양...

치료 잠재력을 가지고 있는 화학 화합물에 대 한 결정 해야 하는 가장 중요 한 특성 중 하나는 동물 세포에 그것의 독성. 이 특성은 약물이 더 광범위한 연구를위한 좋은 후보인지 여부를 결정합니다. 대부분의 경우, 최소한의 독성을 가진 화합물이 모색되지만 특정 세포 유형을 죽일 수 있는 능력을 가진 화합물이 관심있는 상황이 있습니다, 예를 들어, 항 종양성 약물. 전체 동물이 전신 독성을 결정하는 가장 좋은 모델 시스템이지만, 몇 가지 화합물을 테스트해야 할 때 관련된 비용과 노동력은 엄다합니다. 이와 같은 포유류 세포 배양은 일반적으로 가장 효율적인대안1,2로사용된다. 중소형 처리량 약물 스크린은 세포 배양에서 독성을 평가할 수 있는 중요한 양상입니다. 이러한 화면은 개별 신호 경로를 대상으로 하는 추가라이브러리를 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 스크린의 일반적인 형식은 처음에 예비 1차 독성 화면에서 단일 용량(일반적으로 10 μM)으로 라이브러리의 모든 화합물을 테스트한 다음, 독성을 완전히 특성화하기 위해 심층적인 이차 용량 응답 스크린을 수행하는 것입니다. 기본 화면에서 조회수의 프로필을 볼 수 있습니다. 이 전략을 구현하는 방법은 여기에 설명되어 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 빠르고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다.
포유류 세포에서 작은 화합물 및 나노 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다3,4. 특정 물질이 잘못된 결과를 제공하는 분석과 상호 작용할 수 있으며, 독성 화면에서 안타를 특성화 할 때 이러한 상호 작용을 테스트해야합니다4. 세포독성 분석법은 트라이판 블루 배제5,락테이트 탈수소효소(LDH) 방출분석분석6,알라마르블루분석7,칼시엔 아세톡시메틸에스테르(AM)8,ATP 분석기9를포함한다. 이 모든 측정은 세포 번호에 대한 프록시 역할을 할 수있는 세포 대사의 다양한 측면을 측정합니다. 모든 혜택을 제공하는 동안, 테트라 졸륨 염계 측정기 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸리움 브로마이드(MTT), 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페니)-2H-테트라즈리움-1-카르데 및 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-니트로페닐]-2H-5-테트라졸리오)-1,3-벤젠 이설포네이트 (WST-1)10,11은 저렴한 비용으로 좋은 정확성과 사용 편의성을 제공합니다. 이 데모에서 사용되는 MTT는 미토콘드리아 환원효소에 의해 불용성 포르마잔으로 감소되고 이 변환의 속도는 세포 수와 강하게 상관관계가 있다. 이 분석은 작은 규모와 최대 2,000 개의 화합물12를가진 선별 라이브러리에 일상적으로 활용되었습니다. 표지된 마커에 의한 세포의 직접 계수는 세포 수를 평가하는 또 다른 방법을 제공하며, MTT 분석과는 달리 세포 성장의 역학에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 공개적으로 사용할 수 있는 여러 알고리즘은 자동화된 셀 수 분석을 수행할 수 있으며 이미징 판독기13,14를위한 소프트웨어 패키지의 일부인 독점 알고리즘도 있습니다. 이 방법 설명에서, tdTomato15를 구성적으로 발현하기 위해 유전자 편집된 인간 신경 줄기 세포(NSC) 라인은 MTT 분석과 자동화된 세포 계수 사이의 세포 생존 결과를 비교하는 테스트 라인역할을 할 것이다. 57 개의 시험 화합물의 독성을 평가하는 화면에서 분석. 이 전략의 주요 목표는 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 것이었지만, 잠재적으로 성장 억제 및 성장 강화 화합물을 식별하는 추가적인 이점을 가지고 있으므로 약물을 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 즉, 세포 성장을 조절 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

세포 독성은 치료 혜택을 가질 수 있는 약물을 공부할 때 정량화 될 필요가 중요 한 매개 변수. 이 때문에, 많은 약물 스크리닝 검사는 개별 화합물에 대해 프로파일화되는 중요한 특성 중 하나로 세포 독성을 이용한다. 배양되는 세포는 더 비싸고 노동 집약적인 동물 모형에 있는 유망한 지도 화합물에 후속을 진행하기 전에 세포 독성을 평가하는 유용한 모형입니다. 우리는 인간 신경 줄기 세포 (NSC) 선을 표현하는 tdTomato에 있는 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 전략을 기술합니다. 이 전략은 세포 수를 평가하기 위해 2개의 상보적인 assays를 이용합니다. 1개의 분석제는 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT)의 감소를 통해 세포 수에 대한 프록시로서 포르마잔을 하고 다른 하나는 직접 TdTomato 발현 NSC를 계산한다. 2개의 실험은 단 하나 실험에서 동시에 수행될 수 있고 노동 집약적이고, 급속하고, 저렴하지 않습니다. 이 데모에 설명된 전략은 96웰 플레이트 형식의 독성에 대한 예비 1차 화면에서 57개의 화합물을 테스트했습니다. 3개의 안타는 1차 화면과 동일한 분석 설정을 사용하여 6점 투여 반응에서 더 특징을 보였다. 독성에 대한 우수한 부식을 제공하는 것 외에도, 두 가지 측정법의 결과의 비교는 세포 성장의 다른 양상에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 데 효과적일 수 있다.

자동화된 셀 카운트 데이터는 DMSO 제어로 정규화될 때 25% 미만의 생존율로 11개의 화합물을 확인했으며 MTT 데이터는 이러한 동일한 화합물과 2개의 추가 화합물을 확인하였다(표1 및 표 2,적색). MTT 분석(wells F3 및 G10)에서만 독성이 있는 것으로 밝혀진 두 화합물은 각각 31%와 39%를 가졌고, 대조군및 계급 순서에 의한 tdTomato 양성 세포의 수는 독성으로 간주된 후 이 라이브러...

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A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

이 프로토콜은 동시에 세포 성장에 미치는 영향에 대한 수백 개의 화합물을 선별하기 위해 두 개의 분석서를 사용하는 빠르고 효율적인 전략을 제공합니다. 이 약제는 특정 화합물이 세포 독성인지, 세포 성장을 억제하거나, 세포 성장을 향상시키는지에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 두 가지 아세서를 함께 활용함으로써 정확도를 높이고 세포 독성 화합물을 식별할 수 있습니다.두 개의 아세의 결과가 분기하는 경우,이 전략은 우리가 다른 방법으로 더 검사 할 수있는 세포 기능에 고유 한 효과화합물을 식별 할 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 빠르고 저렴하며 비노동 집약적이라는 것입니다. 일단 마스터, 그것은 연구원 쉽게 최대의 기본 화면을 수행 할 수 있습니다 200 일주일에 화합물, 다음에 철저한 용량 응답 곡선을 수행 10 받는 사람 15 다른 주에 화합물.절차를 시연하는 것은 나 자신과 로히니 Manickam, 실험실에서 직원 과학자 및 포스트 baccalaureate 동료가 될 것입니다. 첫째, 생물학적 안전 캐비닛에서, 배양 세포는 분석을 시작할 때 적어도 80%의 컨실수가 될 수 있도록 NSC 매체를 가진 T75 플라스크에 있는. 그리고 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.세포가 80%에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 NSC 배지에서 흡인합니다. 세포 해리 시약 3 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 플라스크에 NSC 배지 7밀리리터를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 모든 세포가 분리되도록 합니다.해리된 세포 용액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G로 전달합니다. 튜브에서 상체를 제거하고 NSC 배지의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 자동 세포 카운터 또는 혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고, 튜브에 NSC 배지를 추가하여 밀리리터당 200, 000 세포로 세포의 농도를 재조정합니다.이어서, 세포외 매트릭스에 의해 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 우물에서 열로 셀 혼합물 컬럼의 100 마이크로리터를 플레이트에 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개의 슬롯 중 6개를 이용하여. 세포가 없는 모든 웰에 100마이크로리터의 베이스 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 세포를 포함하는 가장 바깥쪽 우물에서 잠재적인 증발을 최소화합니다. 세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상된 밀도에 앉는다는 것을 확인하기 위하여 3개의 96의 우물 각각에 적어도 10개의 우물을 육안으로 검사합니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 분리 후 16내지 24시간 인큐베이터에서 세포 배양판을 제거하고 8개의 멀티웰 피펫을 사용하여 8개의 채널 멀티웰 피펫기로 열별로 NSC 중간 열을 흡인하고, 8개의 다중 웰 슬롯 중 6개만 사용한다. 복제 플레이트 3개 의 각 웰에 95마이크로리터의 신선한 NSC 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.8개의 채널 멀티웰 피펫을 사용하면 49마이크로리터의 NSC 배지를 빈 U-바닥, V-바닥 또는 라운드 바닥 96 웰 플레이트의 내부 60웰에 추가합니다. 준비된 마스터 컴파운드 플레이트의 봉인을 해제합니다. 피펫 1 마이크로리터는 마스터 플레이트로부터 NSC 배지를 포함하는 내부 60개의 우물으로 각각 의 화합물을 삽입하고, 희석된 화합물을 벤치 탑 피펫터와 세 번 혼합한다.다음으로, 인큐베이터로부터 NSC의 96개의 웰 플레이트 3개를 제거하고, 세포를 포함하는 3개의 플레이트의 각각 에 5개의 마이크로리터를 분배하여 10 마이크로몰라의 최종 화합물 농도에 대해 1 내지 1000 희석을 산출하고, 72시간 동안 화합물을 함유한 0.1%의 배양세포를 0.1%의 배양세포로 진행한다. 용량 반응 분석을 수행하려면 96을 잘 설정하십시오. 6개의 DMSO 대조군 복제를 위한 2개의 열을 사용하고, 6회 복용량에서, 10 마이크로몰러의 고용량으로 시작하여, 두 배의 연속 희석에서 최대 3개의 다른 화합물의 트리클리타를 시험합니다.DMSO에서 100%DMSO 또는 테스트 화합물 의 4개의 마이크로리터를 0.5 또는 1.5 밀리리터 미세센트심분리기 튜브에서 NSC 배지의 196마이크로리터로 희석한다. 희석된 DMSO의 마이크로리터 25개와 희석된 시험 화합물 50개소를 해당 우물에 첨가합니다. 96 웰 플레이트의 내부 부분에 남아있는 빈 우물에 NSC 매체의 파이펫 25 마이크로 리터.멀티채널 피펫터를 사용하여, 10 마이크로몰라 우물에서 5개의 마이크로몰러 우물로 화합물의 25 마이크로리터를 전송하고, 적어도 5회 혼합한다. 파이펫 팁을 교체하고, 나머지 행을 혼합하여 각 화합물에 대해 총 6회 동안 두 배의 희석제에서 삼중액을 생성하여 프로세스를 반복한다. 각 희석제의 5마이크로리터를 테스트 중인 배양 세포가 있는 새로운 플레이트로 옮겨넣습니다.플레이트를 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다. 세포가 72시간 동안 배양된 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 판독기 내부에 배치합니다. 이미지 기 소프트웨어를 열어 스터디에 대한 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다.작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다. 용기 유형으로 96 웰 플레이트를 선택합니다. 배율에 대해 10회, 적색 형광 단백질 531 및 593을 선택하여 이미징 tdTomato을 선택합니다.우물을 클릭합니다. 그런 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 자동으로 노출합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.카메라를 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 위의 이미지 분석 프로세스를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드합니다. 그리고 분석 탭을 선택합니다.이미지 오른쪽에 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 이미지는 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀을 보여줍니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 세포 크기에 따라 세포를 더 잘 선택하도록 매개 변수를 변경합니다.이미저가 셀을 제대로 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다. 화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 집합에서 실험을 만듭니다. 열린 창에서 프로토콜 탭 아래에서 절차를 클릭합니다.그런 다음 열리는 새 창에서 읽기를 선택합니다. 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 우물만 선택합니다. 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장합니다.그런 다음 프로시저 창에서 확인을 클릭합니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 프롬프트에서 파일을 저장한 다음 로드 플레이트 프롬프트에서 확인을 클릭합니다. 이미징이 완료되면 이미저 소프트웨어 프로그램에서 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드하여 분석을 합니다.tdTomato 이미징을 완료한 지 2시간 이내에 MTT 분석서를 시작합니다. 25 밀리그램의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5밀리리터로 다시 일시 중단하여 밀리리터 MTT 스톡 솔루션당 5밀리그램을 만듭니다. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 몇 분 동안 솔루션을 소용돌이.인큐베이터에서 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인시합니다. MTT를 신선한 NSC 배지에 1-10을 희석하고 희석된 MTT의 마이크로리터 100개를 각 셀웰에 추가합니다. 2 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오.순수한 침전은 우물의 세포 수에 비례하여 대략 적으로 보입니다. MTT 용액을 플레이트에서 분리하고 각 웰에 100% DMSO의 50마이크로리터를 추가합니다. 400 RPM에서 10 분 동안 실온에서 셰이커에 접시를 놓습니다.그 후 플레이트를 플레이트 판독기로 옮기합니다. 595 나노미터의 사전 설정된 파장에서 각 우물의 흡광도를 읽고, 데이터를 스프레드시트로 내보내 분석용 데이터를 셀 카운트 데이터와 정확하게 분석한다. tdTomato 형광 이미지의 검사는 MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 두 개의 우물 불화를 밝혀.하나 잘, 세포 수 데이터는 독성을 제안하지. 그러나 MTT 데이터는 그랬습니다. 또 다른 잘 tdTomato 수에 비해 MTT에 의해 세포 수를 과대 평가했다, 더 큰 세포를 가지고 있는 것으로 나타났다, 반면 MTTt tdTomato에 비해 셀 수를 과소 평가 우물에서, 세포는 더 작은 것으로 나타났다.요약하자면, tdTomato 분석은 11개의 화합물을 독성으로 분류하고, 11개의 성장 억제제로서, 성장 촉진으로, 34는 세포 성장에 명백한 영향을 미치지 않는다. MTT 분석 분류 13 독성으로 화합물, 성장 억제로 두, 성장 향상으로 하나, 와 41 세포 성장에 명백한 영향을 미치지. 화합물 WP1066에 대한 실행 가능한 세포의 그래프는 4개의 가장 낮은 농도에 대한 독성이 없는 비교적 평평한 곡선을 나타낸다.곡선은 5 개의 마이크로 몰라 용량에서 급속히 떨어지고, 10 마이크로 몰러에서 거의 완전한 독성으로 떨어지며, 이는 tdTomato 분석 및 MTT 분석에 대한 치명적인 용량 50을 4.4 및 6.0 마이크로 몰러로 이끕다. 올바른 용량 반응 곡선이 생성되도록 화합물이 용량 반응 화면에서 제대로 희석되는 것이 중요합니다. 세포 성장에 영향을 미치는이 절차에 의해 확인 된 화합물은 세포 성장을 제어 하는 잠재적으로 새로운 신호 경로를 식별 하기 위해 기능적인 에세이에 의해 더 특징지을 수 있습니다.신경 줄기 세포에 독성 화합물은 뇌암에 대 한 잠재적인 치료 약으로 테스트 되었습니다., 교 모 세포 종 및 신경 모세포종 등. 포유류 세포, DMSO 및 MTT를 취급할 때 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 기관의 화학 폐기물 지침에 따라 DMSO 및 MTT를 폐기하십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

연구

생화학

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...