Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NINDS intramural Research program.

1. NSC-kultur
Merk: manipulering av en menneskelig NSC-linje vil bli beskrevet nedenfor, men en hvilken som helst cellelinje kan brukes for denne protokollen. Alle cellekultur arbeid utføres i et biologisk sikkerhetskabinett.
<ol><li>Coat en 96-brønn plate med kjeller membran/ekstracellulære matrise (ECM).<ol>
<li>Tine alikvot av ECM (tabell av materialer), som vil lette vedlegg av NSC, på isen. Fortynne ECM til riktig konsentrasjon (vanligvis 1:100) i 10 mL basis medium...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Det primære målet med denne artikkelen var å beskrive en strategi som kan effektivt og rimelig identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en lav-til moderat gjennomstrømming screening. To ortogonale teknikker ble benyttet for å vurdere celle nummer for å øke tilliten til konklusjonene og tilby ytterligere innsikt som ikke ville være tilgjengelig hvis bare en enkelt analysen ble brukt. En av analysene brukt en fluorescerende celle imager å direkte telle tdTomato-positive celler og den andre var avhengig...

En av de viktigste egenskapene som må fastsettes for en kjemisk forbindelse som har terapeutisk potensial er dens toksisitet for dyreceller. Dette karakteristiske vil avgjøre om et medikament er en god kandidat for mer omfattende studier. I de fleste tilfeller er forbindelser med minimal toksisitet søkt, men det finnes situasjoner der en forbindelse med kapasitet til å drepe bestemte celletyper er av interesse, for eksempel, anti-tumorigene narkotika. Selv om hele dyr er den beste modellen systemer for å fastslå systemisk toksisitet, er kostnaden og arbeidskraft involvert uoverkommelige når mer enn noen få forbindelser må testes. Som sådan er pattedyr cellekultur vanligvis brukt som den mest effektive alternativ1,2. Små til middels gjennomstrømning narkotika skjermer er en viktig modalitet som toksisitet kan vurderes i cellekultur. Disse skjermene kan brukes til å forhøre kommenterte biblioteker rettet mot individuelle signal veier. Den generelle formatet på en slik skjerm er å først teste alle forbindelsene i biblioteket på en enkelt dose (vanligvis 10 μM) i en undersøkende primær toksisitet skjermen, og deretter utføre en grundig sekundær dose respons skjermen for fullt karakterisere toksisitet profilen til treff fra hovedskjermen. Metodene for å implementere denne strategien vil bli beskrevet her og gi en rask, effektiv og rimelig måte å identifisere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er utviklet for å vurdere cytotoksisitet av små forbindelser og nanomaterialebasert i pattedyrceller3,4. Det bør bemerkes at visse materialer kan samhandle med analysen gir villedende resultater, og slike interaksjoner bør testes når karakteriserer treff fra toksisitet skjermer4. Cytotoksisitet analyser inkluderer trypan Blue eksklusjon5, melkesyre DEHYDROGENASE (LDH) Release analysen6, Alamar blå analysen7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, og ATP-analysen9. Alle disse analysene måle ulike aspekter av celle metabolisme som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyr fordeler, tetrazolium salt-baserte analyser som 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 3-BIS (2-metoksy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1 og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonate (WST-1)10,11 gir god nøyaktighet og brukervennlighet til lave kostnader. MTT, som vil bli brukt i denne demonstrasjonen, er redusert til et uløselig formazan av en mitokondrie reduktase og frekvensen av denne konverteringen samsvarer sterkt med celle nummer. Denne analysen har vært rutinemessig utnyttet både i liten skala og for screening biblioteker med opptil 2 000 forbindelser12. Direkte telling av celler med en merket markør tilbyr en annen metode for å vurdere mobilnummeret, og i motsetning til MTT-analysen kan det gi ytterligere informasjon om dynamikken i mobilnettet vekst. Flere offentlig tilgjengelige algoritmer er tilgjengelige for å utføre automatiserte celle tellings analyser, og det finnes også proprietære algoritmer som er en del av programvarepakker for Imaging leserne13,14. I denne metoden beskrivelse, en menneskelig neural Stem Cell (NSC) linje som har blitt genetisk redigert til constitutively uttrykke tdTomato15 vil tjene som en test linje for å sammenligne cellulære levedyktighet resultater mellom en MTT-analysen og en automatisert celle telling analysen i en skjerm vurdere toksisitet av 57 test forbindelser. Selv om det primære målet med denne strategien var å identifisere og karakterisere giftige forbindelser, har den ekstra fordelen av potensielt identifisere veksthemmende og vekst styrke forbindelser og dermed gir en effektiv metode for å identifisere legemidler som kan modulere mobilnettet vekst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Cytotoksisitet er en kritisk parameter som må kvantifisert når man studerer medikamenter som kan ha terapeutiske fordeler. På grunn av dette, mange narkotika screening analyser utnytte cytotoksisitet som en av de kritiske egenskaper for å bli profilert for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig modell for å vurdere cytotoksisitet før du fortsetter å følge opp lovende bly forbindelser i mer kostbare og arbeidsintensive dyremodeller. Vi beskriver en strategi for å identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en tdTomato uttrykker menneskelige nevrale stamceller (NSC) linje. Strategien bruker to komplementære analyser for å vurdere celle nummer. En analysen fungerer via reduksjon av 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den andre direkte teller tdTomato uttrykker NSCs. De to analysene kan utføres samtidig i et enkelt eksperiment, og er ikke arbeidsintensive, raske og rimelige. Strategien beskrevet i denne demonstrasjonen testet 57 forbindelser i en undersøkende primærskjerm for toksisitet i en 96-brønn plateformat. Tre av treffene ble preget videre i en seks-punkts dose respons ved hjelp av samme analysen satt opp som den primære skjermen. I tillegg til å gi utmerket bekreftelse for toksisitet, kan sammenligning av resultater fra de to analysene være effektive i å identifisere forbindelser som påvirker andre aspekter av cellevekst.

Den automatiserte celle telling data identifisert elleve forbindelser med mindre enn 25% levedyktighet når normalisert til DMSO-kontroll mens MTT data identifisert de samme forbindelsene pluss to ekstra seg (tabell 1 og tabell 2, skyggelagt rød). De to forbindelsene funnet å være giftig bare i MTT analysen (brønner F3 og G10) hadde 31% og 39%, henholdsvis antall tdTomato-positive celler som kontroll og ved rang orden var de neste to mest giftige forbindelser i dette biblioteket ette...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Det er ofte nødvendig å vurdere den potensielle cytotoksisitet av et sett med forbindelser på kulturperler celler. Her beskriver vi en strategi for pålitelig skjerm for giftige forbindelser i et 96-brønn format.

En strategi for å identifisere forbindelser som påvirker Cell vekst og overlevelse i kultivert pattedyrceller ved lav-til-moderat gjennomstrømming

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Denne protokollen tilbyr en rask og effektiv strategi for å samtidig bruke to analyser for å screene flere hundre forbindelser for deres effekter på cellevekst. Analysene kan gi oss informasjon om hvorvidt spesifikke forbindelser er cytotoksiske, hemme cellevekst, eller forbedre cellevekst. Ved å bruke de to analysene sammen, er vi i stand til å øke nøyaktigheten og identifisere cytotoksiske forbindelser.I tilfeller der resultatene av de to analysene avviker, kan denne strategien tillate oss å identifisere sammensatt med unike effekter på cellulær funksjon som kan undersøkes videre på andre måter. Den største fordelen med denne strategien er at den er rask, billig og ikke-arbeidsintensiv. Når mestret, det tillater forskere å enkelt utføre en primær skjerm på opptil 200 forbindelser i en uke, og deretter utføre en uttømmende dose responskurve på 10 til 15 forbindelser i en uke.Demonstrere prosedyren vil være meg selv og Rohini Manickam, en stab forsker og post-baccalaureate stipendiat fra laboratoriet. Først, i et biologisk sikkerhetsskap, kulturceller i en T75 kolbe med NSC medium slik at de vil være minst 80% samløpet når du begynner analysen. Og legg kolben i en cellekultur inkubator satt til 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid.Når cellene når 80% samløpet, fjern kolben fra inkubatoren og aspirer av NSC-mediet. Tilsett tre milliliter celledissosiasjonsreagens og inkuber i fem minutter i inkubatoren. Etter inkubasjon, tilsett syv milliliter NSC medium i kolben, og pipette kraftig for å sikre at alle celler blir løsrevet.Overfør den dissosierte celleløsningen til et 15 ml ml, og sentrifuge ved 200 ganger G i fem minutter. Fjern supernatanten fra røret og re-suspendere cellene i 10 milliliter av NSC medium. Bruk en automatisert celleteller eller hemocytometer for å telle cellene, og legg til NSC-medium i røret for å justere konsentrasjonen av celler til 200 000 celler per milliliter.Deretter, ved hjelp av seks av de åtte sporene av en åtte kanals flerkanals pipettor til plate 100 mikroliter av celleblandingen kolonne for kolonne i 60 innvendige brønner av tre 96 brønnplater som har blitt belagt av ekstracellulær matrise. Tilsett 100 mikroliter med basemedium eller NSC-medium til alle brønner uten celler for å minimere potensiell fordampning fra ytterste brønner som inneholder celler. Under et cellekulturmikroskop inspiserer du visuelt minst 10 brønner på hver av de tre 96 brønnplatene for å bekrefte at cellene sitter ved forventet tetthet.Inkuber ved 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid. Fjern cellekulturplatene fra inkubatoren 16 til 24 timer etter splitting, og aspirer av NSC medium kolonne for kolonne med en åtte-kanals multi-brønnpipettor, ved hjelp av bare seks av de åtte multi-brønnsporene. Tilsett 95 mikroliter med friskt NSC-medium til hver brønn av de tre replikere platene, og plasser platene tilbake i inkubatoren.Med en åtte-kanals flerbrønns pipettor, legg til 49 mikroliter NSC medium i hver av de indre 60 brønnene til en tom U-bunnet, V-bunnet eller rundbunnet 96 brønnplate. Unseal den forberedte master sammensatte plate. Pipette en mikroliter av forbindelsen fra hovedplaten inn i hver av de indre 60 brønnene som inneholder NSC medium, og bland den fortynnede forbindelsen tre ganger med en benketopppipetter.Deretter fjerner du de tre 96 brønnplatene av NSC-er fra inkubatoren og dispenserer fem mikroliter av den fortynnede forbindelsen i hver brønn av de tre platene som inneholder celler for å gi en 1 til 1000 fortynning for den endelige sammensatte konsentrasjonen på 10 mikromos med en DMSO-konsentrasjon på 0,1% Inkubere celler med forbindelse i 72 timer, og fortsetter med cytoktoksisitetsanalyser. For å utføre doseresponsanalyse, sett opp en 96-brønn. Bruk kolonne to for seks DMSO kontroll replikerer, og test triplicates av opptil tre forskjellige forbindelser ved togangers seriell fortynning, ved seks doser, starter med en høy dose på 10 mikromos.Fortynn fire mikroliter på 100% DMSO eller testforbindelse i DMSO i 196 mikroliter NSC-medium i et 0,5 eller 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Tilsett 25 mikroliter av fortynnet DMSO for å kontrollere brønner, og 50 mikroliter av de fortynnede testforbindelsene til deres tilsvarende brønner. Pipette 25 mikroliter av NSC medium til de resterende tomme brønnene i den indre delen av 96 brønnplaten.Med en flerkanals pipettor overfører du 25 mikroliter av forbindelsen fra de 10 mikromosbrønnene til de fem mikromosbrønnene, og bland minst fem ganger. Bytt pipettespissene, og gjenta prosessen ved å blande de resterende radene for å generere triplikater ved todelt fortynning for totalt seks doser for hver av forbindelsene. Overfør fem mikroliter av hver fortynning til en ny plate med kulturceller som testes.Plasser platen i inkubatoren ved 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid. Etter at cellene har blitt inkubert i 72 timer, fjern platen fra inkubatoren og plasser den inne i plateleseren. Åpne imager-programvaren for å konfigurere protokoll- og eksperimentfiler for studien.Gå til Imager Manual Mode (Imager Manual Mode) i Oppgavebehandling (Task Manager), og klikk på Ta opp nå. Velg 96 brønnplate som kartype. Velg 10 ganger for forstørrelse, og rødt fluorescerende protein 531 og 593 for bildebehandling tdTomato.Klikk på en brønn. Klikk deretter på Autofokus for å fokusere bildet, og Auto Expose for riktig eksponeringstid. Juster fokuset og eksponeringen manuelt om nødvendig.Klikk på kameraikonet for å ta bildet. Klikk deretter Behandle analyser over bildet for å fortsette å bygge protokollen. Og velg kategorien Analyse.Til høyre for bildet klikker du Mobilanalyse i Trinn for legg til analyse, og klikker Start. Bildet viser uthevede celler for å angi hver enkelt celle. Klikk på Valgvalg for å endre parametere for å bedre velge celler basert på fluorescensterskelen eller cellestørrelsen.Hvis bilden teller cellene riktig, klikker du Legg til trinn nederst på skjermen. Klikk på ikonet øverst på skjermen for å opprette eksperiment fra bildesettet. Og i det åpne vinduet klikker du på Prosedyre under Protokoll-fanen.Velg deretter Les i det nye vinduet som åpnes. Klikk Full Plate for å velge bare de 60 brønnene som inneholder cellene. Klikk OK for å lagre endringer.Klikk deretter OK i prosedyrevinduet. Klikk på Spill av-ikonet for å kjøre platen. Lagre filen i ledeteksten, og klikk deretter OK i ledeteksten Legg inn plate. Når bildebehandlingen er fullført, laster du ned celletellingsdataene fra bildeprogrammet til et regneark for analyse.Innen to timer etter at tdTomato-bildebehandling er fullført, starter du MTT-analysen. Vei ut 25 milligram MTT og re-suspendere den i fem milliliter NSC medium for å lage fem milligram per milliliter MTT lagerløsning. Vortex oppløsningen i flere minutter, til det ikke er synlige bunnst.Fjern cellekulturplater fra inkubatoren og aspirer av cellekulturmedium. Fortynn MTT en til 10 i friskt NSC-medium, og tilsett 100 mikroliter av fortynnet MTT til hver brønn av celler. Inkuber celler ved 37 grader Celsius i to timer.Et purplish bunnskudd er synlig omtrent i forhold til antall celler i brønnen. Aspirer MTT-oppløsningen av platene, og tilsett 50 mikroliter på 100 % DMSO til hver brønn. Plasser platene på en shaker ved romtemperatur i 10 minutter ved 400 o/min.Deretter overfører du platen til en plateleser. Les absorpsjonen av hver brønn ved den forhåndsinnstilte bølgelengden på 595 nanometer, og eksporter data til regneark for analyse, akkurat som for celletellingsdataene. Undersøkelse av tdTomato fluorescens bilder viste to brønner avvikende for toksisitet mellom MTT og celletelling analyse.For en brønn, celletelling data antydet ingen toksisitet. Men MTT-data gjorde det. En annen brønn hadde overvurdert celletall av MTT i forhold til tdTomato-telling, og syntes å ha større celler, mens i brønner hvor MTT undervurderte celletall i forhold til tdTomato, syntes cellene å være mindre.Oppsummert klassifiserte tdTomato-analysen 11 forbindelser som giftige, 11 som veksthemmere, og en som vekstfremmende, med 34 har ingen åpenbar effekt på cellevekst. MTT-analysen klassifiserte 13 forbindelser som giftige, to som veksthemmere, og en som vekstfremmende, med 41 har ingen åpenbar effekt på cellevekst. Grafen over levedyktige celler for forbindelsen WP1066 viser en relativt flat kurve uten toksisitet for de fire laveste konsentrasjonene.Kurven faller raskt ved den fem mikromolardosen, og faller til nesten full toksisitet ved 10 mikromos, noe som fører til den dødelige dosen 50 som 4,4 og 6,0 mikromos for tdTomato-analysen og MTT-analysen. Det er avgjørende at forbindelser fortynnes riktig i doseringsresponsskjermen slik at riktig doseresponskurve genereres. Forbindelser identifisert av denne prosedyren for å påvirke cellevekst kan være ytterligere preget av funksjonelle analyser for å identifisere potensielt nye signalveier som styrer cellevekst.Forbindelser som er giftige for nevrale stamceller har blitt testet som potensielle terapeutiske midler for hjernekreft, som glioblastom og neuroblastom. Bruk alltid hansker og laboratoriefrakk ved håndtering av pattedyrceller, DMSO og MTT. Kast DMSO og MTT i henhold til retningslinjene for kjemisk avfall for institusjonen din.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

En massespektrometribasert tilnærming for å identifisere fosfoproteinfosfater og deres interagere

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Rekonstituering av septinmontering ved membraner for å studere biofysiske egenskaper og funksjoner

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput bildebasert kvantifisering av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...