Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural da NINDS.

1. cultura NSC
Nota: a manipulação de uma linha NSC humana será descrita abaixo, mas qualquer linha celular pode ser usada para este protocolo. Todo o trabalho da cultura da pilha é executado em um armário de segurança biológico.
<ol><li>Cubra uma placa de 96 poços com membrana basal/matriz extracelular (ECM).<ol>
<li>Thaw alíquota de ECM (tabela de materiais), que facilitará a fixação de NSC, no gelo. Diluir o ECM para a concentração apropriada (geralmente 1:1...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. 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P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

O objetivo preliminar deste artigo era descrever uma estratégia que pudesse eficientemente e barata identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em uma baixa-à avaliação da moderado-taxa de transferência. Duas técnicas ortogonais foram utilizadas para avaliar o número de células para aumentar a confiança nas conclusões e oferecer insights adicionais que não estariam disponíveis se apenas um único ensaio fosse utilizado. Um dos ensaios usou um Imager da pilha fluorescente para contar diretamente...

Uma das características mais importantes que precisa ser determinada para um composto químico que tem potencial terapêutico é a sua toxicidade para as células animais. Esta característica determinará se uma droga é um bom candidato para um estudo mais extenso. Na maioria dos casos, os compostos com toxicidade mínima são procurados, mas há situações em que um composto com a capacidade de matar tipos de células específicas é de interesse, por exemplo, drogas antitumorigenic. Embora os animais inteiros sejam os melhores sistemas do modelo para determinar a toxicidade sistemática, o custo e o trabalho envolvidos são proibitivos quando mais do que alguns compostos precisam de ser testados. Como essa cultura de células de mamíferos é geralmente usada como a alternativa mais eficiente1,2. Telas de medicamentos de pequeno a médio débito são uma modalidade importante através da qual a toxicidade pode ser avaliada na cultura celular. Essas telas podem ser usadas para interrogar bibliotecas anotadas visando caminhos de sinalização individuais. O formato geral de tal tela é inicialmente testar todos os compostos na biblioteca em uma única dose (geralmente 10 μM) em uma tela de toxicidade primária exploratória e, em seguida, executar uma tela de resposta de dose secundária em profundidade para caracterizar plenamente a toxicidade Perfil de acertos da tela principal. Os métodos para implementar essa estratégia serão descritos aqui e fornecerão uma maneira rápida, eficiente e barata de identificar e caracterizar compostos tóxicos.
Foram desenvolvidos vários métodos para avaliar a citotoxicidade de pequenos compostos e nanomateriais em células de mamíferos3,4. Deve-se notar que certos materiais podem interagir com o ensaio fornecendo resultados enganosos, e tais interações devem ser testadas quando caracterizar hits de telas de toxicidade4. Os ensaios de citotoxicidade incluem a exclusão azul de Tripan5, o ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH)6, o ensaio azul Alamar7, o éster acetoxymetil calcien (AM)8e o ensaio ATP9. Todos estes ensaios medem vários aspectos do metabolismo celular que pode servir como um proxy para o número de células. Enquanto todos oferecem benefícios, tetrazólio sal-base de ensaios como 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofeny)-2h-tetrazólio-5-carboxyanilide sal interno (xtt)-1 e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-Nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)10,11fornecer boa precisão e facilidade de uso a baixo custo. O MTT, que será usado nesta demonstração, é reduzido a um formazan insolúvel por um redutase mitochondrial e a taxa desta conversão correlaciona fortemente com o número de pilha. Este ensaio tem sido rotineiramente utilizado em uma pequena escala e para bibliotecas de triagem com até 2.000 compostos12. A contagem direta de células por um marcador rotulado oferece outro método para avaliar o número de celular, e ao contrário do ensaio MTT pode fornecer informações adicionais sobre a dinâmica do crescimento celular. Vários algoritmos disponíveis publicamente estão disponíveis para realizar análises automatizadas de contagem de células e também há algoritmos proprietários que fazem parte dos pacotes de software paraleitores de imagens13,14. Nesta descrição do método, uma linha de células-tronco neurais humanas (NSC) que foi editada geneticamente para expressar constitutivamente o tdTomato15 servirá como uma linha de teste para comparar os resultados da viabilidade celular entre um ensaio de MTT e uma contagem de células automatizada ensaio em uma tela avaliando a toxicidade de 57 compostos de teste. Embora o objetivo principal desta estratégia fosse identificar e caracterizar compostos tóxicos, ele tem o benefício adicional de potencialmente identificar os compostos de crescimento inibitório e crescimento e, portanto, fornece um método eficaz para a identificação de drogas que pode modular o crescimento celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

A citotoxicidade é um parâmetro crítico que precisa ser quantificado ao estudar drogas que podem ter benefícios terapêuticos. Por causa disso, muitos ensaios de triagem de drogas utilizam a citotoxicidade como uma das características críticas a serem perfiladas para compostos individuais. As células na cultura são um modelo útil para avaliar a citotoxicidade antes de prosseguir para o acompanhamento de compostos promissores de chumbo em modelos animais mais dispendiosos e trabalhoso. Nós descrevemos uma estratégia para identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em um tdTomato que expressa a linha de pilhas de haste neural humanas (NSC). A estratégia utiliza dois ensaios complementares para avaliar o número de células. Um ensaio funciona através da redução de 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) para formazan como um proxy para o número da célula e o outro conta diretamente o tdTomato expressando NSCs. Os dois ensaios podem ser realizados simultaneamente em um único experimento e não são trabalhoso, rápido e barato. A estratégia descrita nesta demonstração testou 57 compostos em uma tela preliminar exploratória para a toxicidade em um formato da placa de 96 poços. Três dos hits foram caracterizados mais em uma resposta da dose de seis pontos usando o mesmo ajuste-acima do ensaio que a tela preliminar. Além de proporcionar excelente corroboração para toxicidade, a comparação dos resultados dos dois ensaios pode ser efetiva na identificação de compostos que afetam outros aspectos do crescimento celular.

Os dados de contagem de células automatizadas identificaram onze compostos com menos de 25% de viabilidade quando normalizados para o controle DMSO, enquanto os dados do MTT identificaram esses mesmos compostos mais dois adicionais (tabela 1 e tabela 2, vermelho sombreado). Os dois compostos encontrados para serem tóxicos apenas no ensaio de MTT (poços F3 e G10) tiveram 31% e 39%, respectivamente, o número de células tdTomato-positivas como o controle e por ordem de classificação ...

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A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Este protocolo oferece uma estratégia rápida e eficiente para usar simultaneamente dois ensaios para triagem de várias centenas de compostos para seus efeitos no crescimento celular. Os ensaios podem nos fornecer informações sobre se compostos específicos são citotóxicos, inibem o crescimento celular ou melhoram o crescimento celular. Utilizando os dois ensaios juntos, somos capazes de aumentar a precisão e identificar compostos citotóxicos.Nos casos em que os resultados dos dois ensaios divergem, essa estratégia pode permitir identificar compostos com efeitos únicos sobre a função celular que podem ser mais examinados por outros meios. A principal vantagem dessa estratégia é que ela é rápida, barata e não intensiva em mão-de-obra. Uma vez dominado, permite que os pesquisadores executem facilmente uma tela primária de até 200 compostos em uma semana e, em seguida, realizem uma curva de resposta de dose exaustiva em 10 a 15 compostos em outra semana.Demonstrando o procedimento, seremos eu e Rohini Manickam, um cientista da equipe e pós-bacharelado do laboratório. Primeiro, em um gabinete de segurança biológica, células de cultura em um frasco T75 com meio NSC de modo que eles serão pelo menos 80% confluentes ao iniciar o ensaio. E coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Uma vez que as células atinjam 80% de confluência, remova o frasco da incubadora e aspire fora do meio NSC. Adicione três mililitros de reagente de dissociação celular e incubar por cinco minutos na incubadora. Após a incubação, adicione sete mililitros de meio NSC no frasco e pipeta vigorosamente para garantir que todas as células se despeçam.Transfira a solução celular dissociada para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos. Remova o supernatante do tubo e suspenda as células em 10 mililitros do meio NSC. Use um contador celular automatizado ou hemócitometro para contar as células, e adicione o meio NSC no tubo para reajustar a concentração de células para 200.000 células por mililitro.Em seguida, utilizando seis das oito ranhuras de um pipettor multicanal de oito canais para a placa de 100 microliters da coluna de mistura celular por coluna em 60 poços interiores de três placas de poços de 96 que foram revestidas por matriz extracelular. Adicione 100 microliters de meio base ou meio NSC a todos os poços sem células para minimizar a evaporação potencial de poços mais externos que contêm células. Sob um microscópio de cultura celular, inspecione visualmente pelo menos 10 poços em cada uma das três placas de poços 96 para confirmar que as células estão sentadas na densidade esperada.Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova as placas de cultura celular da incubadora 16 a 24 horas após a divisão, e aspire a coluna média NSC por coluna com um pipettor multi-poço de oito canais, usando apenas seis das oito ranhuras multi-poço. Adicione 95 microliters de meio NSC fresco a cada poço das três placas de réplica, e coloque as placas de volta na incubadora.Com um pipettor multi-bem de oito canais, adicione 49 microliters de meio NSC em cada um dos 60 poços interiores de uma placa vazia com fundo em V, com fundo em V ou com fundo redondo de 96. Desslaque a placa composta mestre preparada. Pipeta um microliter do composto da placa principal em cada um dos 60 poços interiores contendo meio NSC, e misture o composto diluído três vezes com um pipettor superior de banco.Em seguida, remova as três placas de poços de NSCs da incubadora e dispense cinco microlitadores do composto diluído em cada poço das três placas que contêm células para produzir uma diluição de um a 1000 para a concentração composta final de 10 micromolares com uma concentração de DMSO de 0,1% Incubar células com composto por 72 horas, e proceder com ensaios de citotoxicidade. Para realizar o ensaio de resposta à dose, configure um poço de 96. Use a Coluna Dois para seis réplicas de controle DMSO e teste triplicados de até três compostos diferentes em diluições seriais duplas, em seis doses, começando com uma alta dose de 10 micromolar.Diluir quatro microlitres de 100% DMSO ou composto de teste em DMSO em 196 microliters de meio NSC em um tubo de microcentrifuge de 0,5 ou 1,5 mililitro. Adicione 25 microlitadores do DMSO diluído para controlar poços, e 50 microlitres dos compostos de teste diluídos aos seus poços correspondentes. Pipeta 25 microliters de médio NSC para os demais poços vazios na porção interna da placa de 96 poços.Com um pipettor multicanal, transfira 25 microliters do composto dos 10 poços micromolar para os cinco poços micromolares, e misture pelo menos cinco vezes. Substitua as pontas da pipeta e repita o processo misturando as linhas restantes para gerar triplicados em diluições duplas para um total de seis doses para cada um dos compostos. Transfira cinco microliters de cada diluição para uma nova placa com células de cultura que estão sendo testadas.Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que as células tiverem sido incubadas por 72 horas, remova a placa da incubadora e coloque-a dentro do leitor de placas. Abra o software de imager para configurar arquivos de protocolo e experimento para o estudo.Vá para o modo manual do Imager no Gerenciador de tarefas e clique em Capturar Agora. Escolha 96 placas bem como o tipo de vaso. Selecione 10 vezes para a ampliação, e proteína fluorescente vermelha 531 e 593 para tdTomato de imagem.Clique em um poço. Em seguida, clique em Foco automático para focar a imagem e Desacalar automaticamente para obter o tempo adequado de exposição. Ajuste manualmente o foco e a exposição, se necessário.Clique no ícone da câmera para capturar a imagem. Em seguida, clique em Analisar imagem acima para continuar construindo o protocolo. E selecione a guia Análise.À direita da imagem, clique em Análise Celular em Etapa de Análise adicionar e clique em Iniciar. A imagem mostra células destacadas para indicar cada célula individual. Clique na seleção Opções para alterar parâmetros para selecionar melhor as células com base no limiar de fluorescência ou no tamanho da célula.Se o imager estiver contando corretamente as células, clique em Adicionar passo na parte inferior da tela. Clique no ícone na parte superior da tela para criar experimento a partir do conjunto de imagens. E na janela aberta, clique em Procedimento na guia Protocolo.Em seguida, na nova janela que abre, selecione Ler. Clique em Placa Completa para selecionar apenas os 60 poços que contêm as células. Clique em OK para salvar alterações.Em seguida, clique em OK na janela Procedimento. Clique no ícone Reproduzir para executar a placa. No prompt, salve o arquivo e, em seguida, no prompt 'Placa de carga', clique em OK. Após a conclusão da imagem, baixe os dados da contagem de células do programa de software imager para uma planilha para análise.Dentro de duas horas após completar a imagem tdTomato, inicie o ensaio MTT. Pese 25 miligramas de MTT e suspenda-o em cinco mililitros de meio NSC para fazer cinco miligramas por solução de estoque MTT mililitro. Vórtice a solução por vários minutos, até que não haja precipitações visíveis de MTT.Remova as placas de cultura celular da incubadora e aspire fora do meio de cultura celular. Diluir MTT de um a 10 em meio NSC fresco, e adicionar 100 microliters do MTT diluído a cada poço de células. Incubar células a 37 graus Celsius por duas horas.Um precipitado arroxeado é visível aproximadamente em proporção ao número de células no poço. Aspire a solução MTT das placas e adicione 50 microliters de 100% DMSO a cada poço. Coloque as placas em um agitador à temperatura ambiente por 10 minutos a 400 RPM.Depois disso, transfira a placa para um leitor de placas. Leia a absorção de cada poço no comprimento de onda predefinido de 595 nanômetros e exporte dados para planilha para análise, exatamente como para os dados de contagem de células. O exame das imagens de fluorescência tdTomato revelou dois poços discordantes para toxicidade entre o MTT e o ensaio de contagem de células.Por um poço, os dados da contagem de células não sugeriram toxicidade. Mas os dados do MTT sim. Outro bem-estimado número de células por MTT em relação à contagem de tdTomato, e parecia ter células maiores, enquanto em poços onde o MTT subestimou a contagem de células em relação ao tdTomato, as células pareciam ser menores.Em resumo, o ensaio tdTomato classificou 11 compostos como tóxicos, 11 como inibidores de crescimento e um como aumento do crescimento, com 34 não tendo efeito aparente no crescimento celular. O ensaio MTT classificou 13 compostos como tóxicos, dois como inibidores de crescimento e um como aumento do crescimento, com 41 não tendo efeito aparente no crescimento celular. O gráfico de células viáveis para o composto WP1066 mostra uma curva relativamente plana sem toxicidade para as quatro concentrações mais baixas.A curva cai rapidamente na dose de cinco micromolares, e cai para uma toxicidade quase total em 10 micromolar, o que leva à dose letal 50 como 4,4 e 6,0 micromolar para o ensaio tdTomato e o ensaio MTT. É fundamental que os compostos sejam devidamente diluídos na tela de resposta da dose para que a curva de resposta da dose correta seja gerada. Compostos identificados por este procedimento para afetar o crescimento celular podem ser ainda mais caracterizados por ensaios funcionais para identificar vias de sinalização potencialmente novas que controlam o crescimento celular.Compostos tóxicos para células-tronco neurais foram testados como potenciais agentes terapêuticos para cânceres cerebrais, como glioblastoma e neuroblastoma. Use sempre luvas e um jaleco ao manusear células de mamíferos, DMSO e MTT. Descarte DMSO e MTT de acordo com as Diretrizes de Resíduos Químicos de sua instituição.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Bioquímica

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...