Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований NINDS.

1. Культура НСК
ПРИМЕЧАНИЕ: Манипуляция линии NSC человека будет описана ниже, но любая клеточная линия может быть использована для этого протокола. Вся работа клеточной культуры выполняется в кабинете биологической безопасности.
<ol><li>Пальто 96-хорошая пластина с мембрано...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Основная цель этой статьи состояла в том, чтобы описать стратегию, которая могла бы эффективно и недорого определить соединения, влияющие на рост клеток в низкой и умеренной пропускной связи скрининга. Два ортогоналовых метода были использованы для оценки числа клеток, чтобы повысить ?...

Одной из наиболее важных характеристик, которая должна быть определена для химического соединения, которое имеет терапевтический потенциал является его токсичность для клеток животных. Эта характеристика будет определять, является ли препарат хорошим кандидатом для более обширного исследования. В большинстве случаев, соединения с минимальной токсичностью ищутся, но Есть ситуации, в которых соединение с возможностью убить конкретных типов клеток представляет интерес, например, противоопухолевые препараты. Хотя целые животные являются лучшими модельными системами для определения системной токсичности, затраты и рабочая сила, связанные с этим, являются непомерно высокими, когда необходимо протестировать более нескольких соединений. Как таковой культуры клеток млекопитающих, как правило, используется в качестве наиболее эффективной альтернативой1,2. Малые и средние экраны пропускной способностью наркотиков являются важным способом, с помощью которого токсичность может быть оценена в культуре клеток. Эти экраны могут быть использованы для допроса аннотированных библиотек, ориентированных на отдельные сигнальные пути. Общий формат такого экрана заключается в том, чтобы сначала проверить все соединения в библиотеке в одной дозе (как правило, 10 мкм) в исследовательском первичной токсичности экрана, а затем выполнить углубленный вторичный экран реакции дозы, чтобы полностью охарактеризовать токсичность профиль хитов с основного экрана. Методы реализации этой стратегии будут описаны здесь и обеспечивают быстрый, эффективный и недорогой способ выявления и характеристики токсичных соединений.
Несколько методов были разработаны для оценки цитотоксичности малых соединений и наноматериалов в клетках млекопитающих3,4. Следует отметить, что некоторые материалы могут взаимодействовать с проверкой, обеспечивающей вводящие в заблуждение результаты, и такие взаимодействия должны быть проверены при характеристике хитов от токсичности экранов4. Анализы цитотоксичности включают trypan синий исключение5,лактат дегидрогеназы (LDH) релиз анализ6, Аламар синий анализ7, кальцийет ацетоксиметил эфир (AM)8, и АТФ анализ9. Все эти анализы измеряют различные аспекты клеточного метаболизма, которые могут служить прокси для номера ячейки. В то время как все предлагают преимущества, тетразолий соли на основе assays, таких как 3-(4,5-диметилтизол-2-yl)-2,5-дифенилтетрацололий бромид (MTT), 2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофени)-2H-тетролийт-5-5-car-2 и 4-(3-4- Иодофенил-2-4-нитрофенил-2H-5-тетразолио)-1,3-бензола дисульфоната (WST-1)10,11 обеспечивают хорошую точность и простоту использования при низкой цене. MTT, который будет использоваться в этой демонстрации, сводится к нерастворимым formazan митохондриальной редуктазы и скорость этого преобразования сильно коррелирует с номером ячейки. Этот анализ регулярно используется как в небольших масштабах, так и для скрининговых библиотек с до 2000 соединений12. Прямой подсчет клеток по маркированному маркеру предлагает другой метод оценки клеточного числа, и в отличие от mtT-оценки он может предоставить дополнительную информацию о динамике клеточного роста. Несколько общедоступных алгоритмов доступны для выполнения автоматизированного анализа количества клеток и Есть также собственные алгоритмы, которые являются частью пакетов программного обеспечения для изображений читателей13,14. В этом описании метода, человеческая нейронная стволовая клетка (NSC) линия, которая была генетически отредактирована, чтобы составно выразить tdTomato15 будет служить в качестве тестовой линии для сравнения результатов клеточной жизнеспособности между MTT анализ и автоматизированный подсчет клеток анализ на экране оценки токсичности 57 испытательных соединений. Хотя основная цель этой стратегии заключалась в выявлении и характеристике токсичных соединений, она имеет дополнительное преимущество потенциального выявления ингибирующих и растущих соединений, усиливающих соединения и тем самым обеспечивающих эффективный метод идентификации лекарств которые могут модулировать клеточный рост.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Цитотоксичность является критическим параметром, который должен быть количественно при изучении препаратов, которые могут иметь терапевтические преимущества. Из-за этого, многие анализы скрининга наркотиков использовать цитотоксичность в качестве одной из критических характеристик, которые будут профилированы для отдельных соединений. Клетки в культуре являются полезной моделью для оценки цитотоксичности, прежде чем приступить к последующей деятельности по перспективным свинца соединений в более дорогостоящих и трудоемких моделей животных. Мы описываем стратегию по выявлению соединений, которые влияют на рост клеток в tdTomato, выражающей линию стволовых клеток человека (NSC). Стратегия использует два дополнительных анализа для оценки числа клеток. Один асссеработает работает через уменьшение 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-дифениltэттрацололий бромид (МТТ) в formazan в качестве прокси для номера ячейки, а другой непосредственно рассчитывает tdTomato выражая NSCs. Два анализа могут быть выполнены одновременно в одном эксперименте и не являются трудоемкими, быстрыми и недорогими. Стратегия, описанная в этой демонстрации, протестировала 57 соединений на исследовательском первичном экране на токсичность в 96-колодцном формате пластины. Три из хитов были охарактеризованы далее в шести точках доза ответ с использованием той же настройки ассея, как основной экран. В дополнение к обеспечению отличного подтверждения токсичности, сравнение результатов двух анализов может быть эффективным в выявлении соединений, влияющих на другие аспекты роста клеток.

Автоматизированные данные подсчета ячеек определили одиннадцать соединений с менее чем 25% жизнеспособностью при нормализации управления DMSO, в то время как данные MTT определили эти же соединения плюс два дополнительных(таблица 1 и таблица 2, затененный красный). Два со?...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Часто необходимо оценить потенциальную цитотоксичность набора соединений на культивированных клетках. Здесь мы описываем стратегию надежного скрининга токсичных соединений в формате 96 скважин.

Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Этот протокол предлагает быструю и эффективную стратегию одновременного использования двух анализов для проверки нескольких сотен соединений для их воздействия на рост клеток. Анализы могут предоставить нам информацию о том, являются ли конкретные соединения цитотоксическими, подавляют рост клеток или усиливают рост клеток. Используя эти два анализа вместе, мы можем повысить точность и определить цитотоксические соединения.В тех случаях, когда результаты этих двух анализов расходятся, эта стратегия может позволить нам определить соединение с уникальным воздействием на клеточную функцию, которое может быть дополнительно изучено другими средствами. Основным преимуществом этой стратегии является то, что она быстрая, недорогая и неимутовная. После освоения, это позволяет исследователям легко выполнять первичный экран до 200 соединений в течение одной недели, а затем выполнить исчерпывающую кривую реакции дозы на 10 до 15 соединений в другую неделю.Демонстрацией процедуры будет я и Рохини Маникам, штатный ученый и сотрудник лаборатории. Во-первых, в кабинете биологической безопасности, культурные клетки в колбе T75 со средой NSC, так что они будут по крайней мере 80% confluent при начале анализа. И поместите колбу в инкубатор клеточной культуры, установленный на уровне 37 градусов по Цельсию и пятипроцентный углекислый газ.Как только клетки достигнут 80%слияния, удалите колбу из инкубатора и аспирировать от среды НСК. Добавьте три миллилитров реагента диссоциации клеток и инкубировать в течение пяти минут в инкубаторе. После инкубации добавьте семь миллилитров среды НСК в колбу и пипетку энергично, чтобы все клетки отсоединились.Перенесите диссоциированный клеточный раствор в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 раз G в течение пяти минут. Удалить супернатант из трубки и повторно приостановить клетки в 10 миллилитров среды НСК. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометр для подсчета ячеек и добавьте среду NSC в трубку, чтобы скорректировать концентрацию клеток до 200 000 клеток на миллилитр.Затем, используя шесть из восьми слотов восьмиканального многоканального трубоотвода, чтобы пластины 100 микролитров клеточной смеси колонки за колонной в 60 внутренних колодцев из трех 96 пластин скважины, которые были покрыты внеклеточной матрицы. Добавьте 100 микролитров базовой среды или среды НСК ко всем скважинам без ячеек, чтобы свести к минимуму потенциальное испарение из внешних скважин, содержащих клетки. Под микроскопом клеточной культуры, визуально проверить по крайней мере 10 скважин на каждом из трех 96 пластин скважины, чтобы подтвердить, что клетки сидят на ожидаемой плотности.Инкубация при 37 градусах цельсия и пяти процентах углекислого газа. Удалите пластины культуры клеток из инкубатора через 16-24 часа после расщепления и аспирировать от средней колонки NSC по столбец с восьмиканалю multi-well pipettor, используя только шесть из восьми многофункциональных слотов. Добавьте 95 микролитров свежей среды NSC к каждому колодец из трех пластин репликации, и поместите пластины обратно в инкубатор.С восьмиканалю многофункциональный трубоуправленец, добавить 49 микролитров НСК среды в каждом из внутренних 60 скважин пустой U-дном, V-дном, или круглым дном 96 хорошо пластины. Распечатать подготовленную мастером составную тарелку. Pipette один микролитер соединения из главной пластины в каждой из внутренних 60 скважин, содержащих НСК среды, и смешать разбавленное соединение три раза со скамейкой верхней трубоуправления.Затем удалите три пластины 96 пластин NSCs из инкубатора и выпределите пять микролитров разбавленного соединения в каждую колодец из трех пластин, которые содержат клетки, чтобы дать от одного до 1000 разбавления для окончательной концентрации соединения 10 микромоляров с концентрацией DMSO 0,1%Incubate клеток с соединением в течение 72 часов, и приступить к цитототоксичности анализов. Для выполнения анализа реакции дозы, создать 96 хорошо. Используйте колонку 2 для шести репликаций управления DMSO и испытать трипликаты до трех различных соединений при двукратном серийном разбавлении, в шести дозах, начиная с высокой дозы 10 микромолей.Разбавить четыре микролитера 100% DMSO или испытательного соединения в DMSO в 196 микролитров среды НСК в 0,5 или 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки. Добавьте 25 микролитров разбавленной ДМСО для управления скважинами и 50 микролитров разбавленных испытательных соединений к соответствующим скважинам. Pipette 25 микролитров НСК средних до оставшихся пустых скважин во внутренней части 96 пластины скважины.С помощью многоканального трубоуправления перенесите 25 микролитров соединения из 10 микромолечных скважин в пять микромолечных скважин и смешайте не менее пяти раз. Заменить пипетки советы, и повторить процесс, смешивая оставшиеся ряды для создания тройной при двукратном разбавления в общей сложности шесть доз для каждого из соединений. Перенесите пять микролитров каждого разбавления в новую пластину с культурными клетками, которые проходят тестирование.Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и пяти процентах углекислого газа. После инкубации клеток в течение 72 часов снимите пластину с инкубатора и поместите ее внутрь считыватель пластин. Откройте программное обеспечение для настройки протокола и экспериментальных файлов для исследования.Перейдите в ручной режим Imager на менеджере задач и нажмите Capture Now. Выберите 96 хорошо пластины, как тип судна. Выберите 10 раз для увеличения, и красный флуоресцентный белок 531 и 593 для изображения tdTomato.Нажмите на колодец. Затем нажмите на Autofocus, чтобы сфокусировать изображение, и Auto Expose для правильного времени экспозиции. Вручную отрегулируйте фокус и экспозицию, если это необходимо.Нажмите значок камеры, чтобы захватить изображение. Затем нажмите Process Analyze выше изображения, чтобы продолжить создание протокола. И выберите вкладку Анализ.Справа от изображения щелкните Сотовый анализ в шаге анализа добавления и нажмите Кнопку «Начать». На изображении показаны выделенные ячейки для обозначения каждой отдельной ячейки. Нажмите на выбор опций, чтобы изменить параметры, чтобы лучше выбрать ячейки на основе порога флуоресценции или размера клетки.Если изображение правильно подсчитывает ячейки, нажмите Добавить шаг в нижней части экрана. Нажмите значок в верхней части экрана, чтобы создать эксперимент из набора изображений. А на открытое окно щелкните Процедуру под вкладкой Протокола.Затем, в новом окне, которое открывается, выберите Read. Нажмите Полная плита, чтобы выбрать только 60 скважин, которые содержат клетки. Нажмите OK, чтобы сохранить изменения.Затем нажмите OK в окне Процедуры. Нажмите значок воспроизведения, чтобы запустить пластину. В запросе сохраните файл, а затем в подсказке Load Plate щелкните OK. По завершении изображения загрузите данные о подсчете ячееок из программы Imager в электронную таблицу для анализа.В течение двух часов после завершения tdTomato изображения, начать анализ MTT. Взвесить 25 миллиграммов МТТ и повторно приостановить его в пять миллилитров НСК среды, чтобы сделать пять миллиграммов на миллилитр MTT фондовый раствор. Вихрь раствор в течение нескольких минут, пока есть никаких видимых осадков MTT.Удалите пластины клеточной культуры из инкубатора и аспирировать от среды клеточной культуры. Разбавить МТТ от одного до 10 в свежей среде НСК и добавить 100 микролитров разбавленного МТТ к каждой колодец клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.Пурпурный осадок виден примерно пропорционально количеству клеток в колодеце. Аспирировать раствор МТТ с пластин, и добавить 50 микролитров 100% DMSO к каждой хорошо. Поместите тарелки на шейкер при комнатной температуре в течение 10 минут при 400 об/мин.После этого перенесите пластину на считыватель пластин. Прочитайте абсорбцию каждой системы на заданной длине волны 595 нанометров и экспортируют данные в электронную таблицу для анализа, точно так же, как и данные о подсчете ячеек. Изучение изображений флуоресценции tdTomato выявило два скважины, несогласованные по токсичности между МТТ и анализом количество клеток.С одной стороны, данные о подсчете клеток не свидетельствуют об токсичности. Но данные МТТ сделали. Другая скважина переоценила количество клеток МТТ по отношению к кол-во tdTomato и, как представляется, имела более крупные клетки, в то время как в скважинах, где МТТ недооценила количество клеток по отношению к tdTomato, клетки оказались меньше.Таким образом, анализ tdTomato классифицировал 11 соединений как токсичные, 11 как ингибитор роста, и один как повышение роста, с 34, не имеющих явного влияния на рост клеток. Анализ MTT классифицировал 13 соединений как токсичные, два как ингибитор роста, и один как повышение роста, с 41 не оказывает очевидного влияния на рост клеток. График жизнеспособных клеток для соединения WP1066 показывает относительно плоскую кривую без токсичности для четырех самых низких концентраций.Кривая быстро падает в пяти микромоляных дозах и падает почти до полной токсичности при 10 микромолях, что приводит к смертельной дозе 50 как 4,4 и 6,0 микромолара для анализа tdTomato и анализа MTT. Очень важно, чтобы соединения должным образом разбавляются в дозе ответ экран так, что правильная кривая реакции дозы генерируется. Соединения, выявленные этой процедурой для влияния на рост клеток, могут быть дополнительно охарактеризованы функциональными анализами для выявления потенциально новых сигнальных путей, которые контролируют рост клеток.Соединения, которые являются токсичными для нервных стволовых клеток были протестированы в качестве потенциальных терапевтических агентов для рака мозга, таких как глиобластома и нейробластома. Всегда носите перчатки и лабораторное пальто при обработке клеток млекопитающих, DMSO и MTT. Утилизация DMSO и MTT в соответствии с Руководящими принципами химических отходов вашего учреждения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Масс-спектрометрический подход к идентификации фосфопротеинфосфатаз и их интеракторов

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Высокопроизводительный скрининг для получения кристаллических попаданий для кристаллографии белка

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...