Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros NINDS.

1. Cultura del NSC
NOTA: La manipulación de una línea NSC humana se describirá a continuación, pero cualquier línea celular se puede utilizar para este protocolo. Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en un gabinete de seguridad biológica.
<ol><li>Recubrir una placa de 96 pocillos con membrana de sótano/matriz extracelular (ECM).<ol>
<li>Descongelar la alícuota de ECM(Tabla de Materiales),lo que facilitará la fijación de NSC, sobre hielo. Diluir ECM a la co...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. 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K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

El objetivo principal de este artículo era describir una estrategia que pudiera identificar de manera eficiente y económica compuestos que afectan el crecimiento celular en un cribado de bajo a moderado rendimiento. Se utilizaron dos técnicas ortogonales para evaluar el número de células para aumentar la confianza en las conclusiones y ofrecer información adicional que no estaría disponible si solo se utilizara un solo ensayo. Uno de los ensayos utilizó un imager de células fluorescentes para contar directamente...

Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar más de unos pocos compuestos. Como tal cultivo celular de mamíferos se utiliza generalmente como la alternativa más eficiente1,2. Las pantallas de fármacos de rendimiento pequeño a mediano son una modalidad importante a través de la cual se puede evaluar la toxicidad en el cultivo celular. Estas pantallas se pueden utilizar para interrogar bibliotecas anotadas dirigidas a vías de señalización individuales. El formato general de una pantalla de este tipo es probar inicialmente todos los compuestos de la biblioteca a una sola dosis (generalmente 10 m) en una pantalla exploratoria de toxicidad primaria, y luego realizar una pantalla de respuesta de dosis secundaria en profundidad para caracterizar completamente la toxicidad perfil de los aciertos de la pantalla principal. Los métodos para implementar esta estrategia se describirán aquí y proporcionarán una manera rápida, eficiente y económica de identificar y caracterizar compuestos tóxicos.
Se han desarrollado múltiples métodos para evaluar la citotoxicidad de compuestos pequeños y nanomateriales en células de mamíferos3,4. Cabe señalar que ciertos materiales pueden interactuar con el ensayo proporcionando resultados engañosos, y tales interacciones deben probarse al caracterizar los golpes de las pantallas de toxicidad4. Los ensayos de citotoxicidad incluyen exclusión azul de trypan5, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)6, ensayo azul de Alamar7, éster de acetoximetil calcien (AM)8y el ensayo ATP9. Todos estos ensayos miden varios aspectos del metabolismo celular que pueden servir como un proxy para el número de celda. Si bien todos ofrecen beneficios, ensayos a base de sal de tetrazolium como 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltelium bromuro (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sal interna (XTT)-1, y 4-(3-[4-4- El disulfato de yodofenilo]-2-[4-nitrofenilo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)10,11 proporcionan buena precisión y facilidad de uso a bajo costo. MTT, que se utilizará en esta demostración, se reduce a un formazán insoluble por una reductasa mitocondrial y la tasa de esta conversión se correlaciona fuertemente con el número de celda. Este ensayo se ha utilizado rutinariamente tanto a pequeña escala como para bibliotecas de cribado con hasta 2.000 compuestos12. El recuento directo de células por un marcador etiquetado ofrece otro método para evaluar el número celular, y a diferencia del ensayo MTT puede proporcionar información adicional sobre la dinámica del crecimiento celular. Varios algoritmos disponibles públicamente están disponibles para realizar análisis automatizados de recuento de celdas y también hay algoritmos propietarios que forman parte de paquetes de software para lectores de imágenes13,14. En esta descripción del método, una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que ha sido editada genéticamente para expresar constitutivamente tdTomato15 servirá como una línea de prueba para comparar los resultados de viabilidad celular entre un ensayo MTT y un recuento automatizado de células ensayo en una pantalla que evalúe la toxicidad de 57 compuestos de ensayo. Aunque el objetivo principal de esta estrategia era identificar y caracterizar compuestos tóxicos, tiene el beneficio adicional de identificar potencialmente los compuestos inhibidores del crecimiento y mejorar el crecimiento y por lo tanto proporciona un método eficaz para identificar drogas que puede modular el crecimiento celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

La citotoxicidad es un parámetro crítico que debe cuantificarse al estudiar fármacos que pueden tener beneficios terapéuticos. Debido a esto, muchos ensayos de detección de drogas utilizan citotoxicidad como una de las características críticas a perfilar para compuestos individuales. Las células en cultivo son un modelo útil para evaluar la citotoxicidad antes de proceder a dar seguimiento a compuestos de plomo prometedores en modelos animales más costosos e intensivos en mano de obra. Describimos una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular en una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que expresan tdTomato. La estrategia utiliza dos ensayos complementarios para evaluar el número de celdas. Un ensayo funciona a través de la reducción de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) al formazan como apoderado del número de celda y el otro cuenta directamente el tdTomato que expresa NSC. Los dos ensayos se pueden realizar simultáneamente en un solo experimento y no son intensivos en mano de obra, rápidos y baratos. La estrategia descrita en esta demostración probó 57 compuestos en una pantalla primaria exploratoria para la toxicidad en un formato de placa de 96 pocillos. Tres de los éxitos se caracterizaron aún más en una respuesta de dosis de seis puntos utilizando la misma configuración de ensayo que la pantalla principal. Además de proporcionar una excelente corroboración de la toxicidad, la comparación de los resultados de los dos ensayos puede ser eficaz en la identificación de compuestos que afectan a otros aspectos del crecimiento celular.

Los datos automatizados del recuento de células identificaron once compuestos con menos del 25% de viabilidad cuando se normalizan al control DMSO, mientras que los datos MTT identificaron estos mismos compuestos más dos adicionales(Tabla 1 y Tabla 2,rojo sombreado). Los dos compuestos encontrados tóxicos sólo en el ensayo MTT (pozos F3 y G10) tenían 31% y 39%, respectivamente, el número de células tdTomato-positivas como el control y por orden de rango fueron los dos compuestos m...

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A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Este protocolo ofrece una estrategia rápida y eficiente para utilizar simultáneamente dos ensayos para examinar varios cientos de compuestos por sus efectos en el crecimiento celular. Los ensayos pueden proporcionarnos información sobre si compuestos específicos son citotóxicos, inhiben el crecimiento celular o mejoran el crecimiento celular. Mediante la utilización de los dos ensayos juntos, somos capaces de aumentar la precisión e identificar compuestos citotóxicos.En los casos en que los resultados de los dos ensayos divergen, esta estrategia puede permitirnos identificar compuestos con efectos únicos sobre la función celular que pueden ser examinados más a fondo por otros medios. La principal ventaja de esta estrategia es que es rápida, barata y no intensiva en mano de obra. Una vez masterado, permite a los investigadores realizar fácilmente una pantalla primaria de hasta 200 compuestos en una semana, y luego realizar una curva de respuesta a la dosis exhaustiva en 10 Para 15 compuestos en otra semana.Demostrando el procedimiento seremos Rohini Manickam y yo, un científico del personal y becario post-bachillerato del laboratorio. En primer lugar, en un gabinete de seguridad biológica, las células de cultivo en un matraz T75 con medio NSC para que tengan al menos un 80% de confluencia al iniciar el ensayo. Y coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular situada en 37 grados celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono.Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, retire el matraz de la incubadora y aspire el medio NSC. Añadir tres mililitros de reactivo de disociación celular e incubar durante cinco minutos en la incubadora. Después de la incubación, agregue siete mililitros de medio NSC en el matraz, y pipetee vigorosamente para asegurar que todas las células se desprendan.Transfiera la solución celular disociada a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante del tubo y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio NSC. Utilice un contador de células automatizado o hemocitoómetro para contar las células, y agregue el medio NSC en el tubo para reajustar la concentración de células a 200.000 células por mililitro.A continuación, utilizando seis de las ocho ranuras de un pipeteador multicanal de ocho canales para la placa 100 microlitros de la mezcla celular columna por columna en 60 pozos interiores de tres placas de 96 pozos que han sido recubiertos por matriz extracelular. Agregue 100 microlitros de medio base o medio NSC a todos los pozos sin células para minimizar la evaporación potencial de los pozos exteriores que contienen células. Bajo un microscopio de cultivo celular, inspeccione visualmente al menos 10 pozos en cada una de las tres placas de 96 pozos para confirmar que las células están sentadas a la densidad esperada.Incubar a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora de 16 a 24 horas después de la división, y aspire la columna media NSC por columna con un pipeteador multicocho de ocho canales, utilizando sólo seis de las ocho ranuras de varios pozos. Agregue 95 microlitros de medio NSC fresco a cada pozo de las tres placas de réplica y vuelva a colocar las placas en la incubadora.Con un pipettor multi-pozo de ocho canales, agregue 49 microlitros de medio NSC en cada uno de los pozos interiores de 60 pozos de una placa vacía de fondo en U, con fondo en V o de fondo redondo de 96 pozos. Desapreoña la placa compuesta maestra preparada. Pipetear un microlitro del compuesto de la placa maestra en cada uno de los 60 pozos interiores que contienen el medio NSC, y mezclar el compuesto diluido tres veces con un pipeteador de sobremesa.A continuación, retire las tres placas de 96 pozos de las RSE de la incubadora y dispense cinco microlitros del compuesto diluido en cada pozo de las tres placas que contienen células para producir una dilución de uno a 1000 para la concentración compuesta final de 10 micromolares con una concentración de DMSO de 0,1% Incubar células con compuesto durante 72 horas, y proceder con ensayos de citotoxicidad. Para realizar el ensayo de respuesta a la dosis, configure un pozo de 96. Utilice la columna dos para seis réplicas de control DMSO y pruebe triplicados de hasta tres compuestos diferentes a dos diluciones seriales dobles, a seis dosis, comenzando con una dosis alta de 10 micromolares.Diluir cuatro microlitros de 100%DMSO o compuesto de ensayo en DMSO en 196 microlitros de medio NSC en un tubo de microcentrífuga de 0,5 o 1,5 mililitros. Añadir 25 microlitros del DMSO diluido para controlar los pozos, y 50 microlitros de los compuestos de prueba diluidos a sus pozos correspondientes. Pipetear 25 microlitros de medio NSC a los pozos vacíos restantes en la parte interior de la placa de 96 pozos.Con un pipettor multicanal, transfiera 25 microlitros del compuesto de los 10 pozos micromolares a los cinco pozos micromolares, y mezcle al menos cinco veces. Sustituya las puntas de la pipeta y repita el proceso mezclando las filas restantes para generar triplicados a dos diluciones para un total de seis dosis para cada uno de los compuestos. Transfiera cinco microlitros de cada dilución a una nueva placa con células de cultivo que se están probando.Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de que las células hayan sido incubadas durante 72 horas, retire la placa de la incubadora y colóquela dentro del lector de placas. Abra el software imager para configurar archivos de protocolo y experimento para el estudio.Vaya al modo manual de Imager en el Administrador de tareas y haga clic en Capturar ahora. Elija la placa de 96 pozos como el tipo de recipiente. Seleccione 10 veces para el aumento y la proteína fluorescente roja 531 y 593 para la toma de imágenes de tdTomato.Haga clic en un pozo. A continuación, haga clic en Enfoque automático para enfocar la imagen y Exponer automáticamente para obtener el tiempo de exposición adecuado. Ajuste manualmente el enfoque y la exposición si es necesario.Haga clic en el icono de la cámara para capturar la imagen. A continuación, haga clic en Procesar analizar la imagen anterior para continuar creando el protocolo. Y seleccione la pestaña Análisis.A la derecha de la imagen, haga clic en Análisis celular en Agregar paso de análisis y haga clic en Iniciar. La imagen muestra celdas resaltadas para indicar cada celda individual. Haga clic en la selección Opciones para modificar los parámetros para seleccionar mejor las celdas en función del umbral de fluorescencia o el tamaño de celda.Si el imager está contando correctamente las celdas, haga clic en Agregar paso en la parte inferior de la pantalla. Haga clic en el icono en la parte superior de la pantalla para crear un experimento a partir del conjunto de imágenes. Y en la ventana abierta, haga clic en Procedimiento en la pestaña Protocolo.A continuación, en la nueva ventana que se abre, seleccione Leer. Haga clic en Placa completa para seleccionar solo los 60 pozos que contienen las celdas. Haga clic en Aceptar para guardar los cambios.A continuación, haga clic en Aceptar en la ventana Procedimiento. Haga clic en el icono Reproducir para ejecutar la placa. En el símbolo del sistema, guarde el archivo y, a continuación, en la solicitud Cargar placa, haga clic en Aceptar. Al finalizar la imagen, descargue los datos del recuento de celdas del programa de software del imager a una hoja de cálculo para su análisis.Dentro de las dos horas siguientes a la finalización de la toma de imágenes tdTomato, comience el ensayo de MTT. Pesar 25 miligramos de MTT y volver a suspenderlo en cinco mililitros de medio NSC para hacer cinco miligramos por mililitro solución de stock MTT. Vórtice la solución durante varios minutos, hasta que no haya precipitados visibles de MTT.Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire fuera del medio de cultivo celular. Diluir MTT de uno a 10 en medio NSC fresco, y añadir 100 microlitros del MTT diluido a cada pozo de células. Incubar células a 37 grados centígrados durante dos horas.Un precipitado púrpura es visible aproximadamente en proporción al número de células en el pozo. Aspirar la solución MTT de las placas y añadir 50 microlitros de 100%DMSO a cada pozo. Coloque las placas en una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 RPM.Después de eso, transfiera la placa a un lector de placas. Lea la absorbancia de cada pozo en la longitud de onda preestablecida de 595 nanómetros y exporte datos a hoja de cálculo para su análisis, exactamente como para los datos de recuento de celdas. El examen de las imágenes de fluorescencia tdTomato reveló dos pozos discordantes para la toxicidad entre el MTT y el ensayo de recuento de células.Para un pozo, los datos del recuento celular sugirieron que no había toxicidad. Pero los datos de MTT sí. Otro bien había sobreestimado el recuento de células por MTT en relación con el recuento de tdTomato, y parecía tener células más grandes, mientras que en pozos donde MTT subestimó el recuento de células en relación con tdTomato, las células parecían ser más pequeñas.En resumen, el ensayo tdTomato clasificó 11 compuestos como tóxicos, 11 como inhibidores del crecimiento, y uno como mejora del crecimiento, con 34 sin efecto aparente sobre el crecimiento celular. El ensayo MTT clasificó 13 compuestos como tóxicos, dos como inhibidores del crecimiento, y uno como mejora del crecimiento, con 41 sin efecto aparente sobre el crecimiento celular. El gráfico de células viables para el compuesto WP1066 muestra una curva relativamente plana sin toxicidad para las cuatro concentraciones más bajas.La curva cae rápidamente en la dosis de cinco micromolares, y cae a toxicidad casi total a 10 micromolares, lo que conduce a la dosis letal 50 como 4,4 y 6,0 micromolar para el ensayo tdTomato y el ensayo MTT. Es fundamental que los compuestos se diluyen correctamente en la pantalla de respuesta a la dosis para que se genere la curva de respuesta de dosis correcta. Los compuestos identificados por este procedimiento para afectar el crecimiento celular se pueden caracterizar aún más por ensayos funcionales para identificar vías de señalización potencialmente novedosas que controlan el crecimiento celular.Los compuestos que son tóxicos para las células madre neurales se han probado como agentes terapéuticos potenciales para los cánceres cerebrales, como el glioblastoma y el neuroblastoma. Use siempre guantes y una capa de laboratorio cuando manipule células de mamíferos, DMSO y MTT. Deseche DMSO y MTT de acuerdo con las Directrices de Residuos Químicos de su institución.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Investigación

Bioquímica

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...