Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NINDS intramural forsknings program.

1. NSC-kulturen
Anmärkning: manipulering av en mänsklig NSC-linje kommer att beskrivas nedan, men alla cellinjer kan användas för detta protokoll. Allt cellkultur arbete utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp.
<ol><li>Coat en 96-brunn tallrik med basalmembran/extracellulär matrix (ECM).<ol>
<li>Tina alikvot av ECM (tabell över material), som kommer att underlätta fastsättning av NSC, på is. Späd ut ECM till lämplig koncentration (vanligtvis 1:100) i 10 mL bas me...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Det primära målet med denna artikel var att beskriva en strategi som effektivt och billigt kan identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en låg till måttlig-genomflöde screening. Två ortogonala tekniker utnyttjades för att bedöma cell nummer för att öka förtroendet för slutsatserna och erbjuda ytterligare insikter som inte skulle vara tillgängliga om bara en enda analys användes. En av de analyser som används en fluorescerande cell Imager att direkt räkna tdTomato-positiva celler och den andra...

En av de viktigaste egenskaperna som måste bestämmas för en kemisk förening som har terapeutisk potential är dess toxicitet för djurceller. Denna egenskap kommer att avgöra om ett läkemedel är en bra kandidat för mer omfattande studie. I de flesta fall, föreningar med minimal toxicitet söks men det finns situationer där en förening med kapacitet att döda specifika celltyper är av intresse, e.g., anti-tumorigenic läkemedel. Även om hela djur är de bästa modellsystem för att bestämma systemisk toxicitet, är kostnaden och arbetskraft som är oöverkomliga när mer än ett fåtal föreningar måste testas. Som sådan däggdjurs-cellkultur används allmänt som det effektivaste alternativet1,2. Små till medelstora genomströmning drog skärmar är en viktig modalitet genom vilken toxicitet kan bedömas i cellkulturen. Dessa skärmar kan användas för att förhöra kommenterade bibliotek som riktar sig till enskilda signaleringsvägar. Det allmänna formatet på en sådan skärm är att initialt testa alla föreningar i biblioteket vid en engångsdos (vanligtvis 10 μM) i en undersökande primär toxicitet skärm, och sedan utföra en djupgående sekundär dos svar skärm för att fullt ut karakterisera toxiciteten profil för träffar från den primära skärmen. Metoderna för att genomföra denna strategi kommer att beskrivas här och ge ett snabbt, effektivt och billigt sätt att identifiera och karakterisera giftiga föreningar.
Flera metoder har utvecklats för att bedöma cytotoxicitet av små föreningar och nanomaterial i däggdjursceller3,4. Det bör noteras att vissa material kan interagera med analysen ger vilseledande resultat, och sådana interaktioner bör testas när karakterisera träffar från toxicitet skärmar4. Cytotoxicitetsanalyser inkluderar trypan Blue utslagning5, laktatdehydrogenas (LDH) Release assay6, Alamar Blue assay7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, och ATP-analysen9. Alla dessa analyser mäter olika aspekter av cellmetabolism som kan fungera som en proxy för cell nummer. Medan alla erbjuder fördelar, tetrazolium saltbaserade analyser såsom 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), 2, 3-bis (2-metoxi-4-Nitro-5-sulfofeny)-2H-tetrazolium-5-karboxyanilidinnersalt (XTT)-1, och 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-bensen disulfonat (WST-1)10,11 ger god noggrannhet och enkel användning till låg kostnad. MTT, som kommer att användas i denna demonstration, reduceras till en olöslig formazan av en mitokondriell reduktas och hastigheten av denna omvandling korrelerar starkt med cell nummer. Denna analys har rutinmässigt utnyttjas i både en liten skala och för screening bibliotek med upp till 2 000 föreningar12. Direkt räkning av celler med en märkt markör erbjuder en annan metod för att bedöma mobiltelefonnumret, och till skillnad från MTT-analysen kan det ge ytterligare information om dynamiken i cellulära tillväxt. Flera allmänt tillgängliga algoritmer finns tillgängliga för att utföra automatiserade cell räknings analyser och det finns även egenutvecklade algoritmer som ingår i mjukvarupaket för bildläsare13,14. I denna metodbeskrivning, en mänsklig neurala stamcells (NSC) linje som har genetiskt redigerats till konstitutivt uttrycka tdTomato15 kommer att fungera som en test linje för att jämföra cellulära lönsamhet resultat mellan en MTT-analys och en automatiserad cellräkning analys på en skärm som bedömer toxiciteten hos 57 testsubstanser. Även om det primära målet med denna strategi var att identifiera och karakterisera giftiga föreningar, det har den ytterligare fördelen att potentiellt identifiera tillväxthämmande och tillväxtförbättrande föreningar och därmed ger en effektiv metod för att identifiera läkemedel som kan modulera cellulära tillväxt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Cytotoxicitet är en kritisk parameter som måste kvantifieras när man studerar läkemedel som kan ha terapeutiska fördelar. På grund av detta, många Drug screening analyser utnyttja cytotoxicitet som en av de kritiska egenskaper som ska profileras för enskilda föreningar. Celler i kulturen är en användbar modell för att bedöma cytotoxicitet innan du fortsätter att följa upp lovande blyföreningar i mer kostsamma och arbetsintensiva djurmodeller. Vi beskriver en strategi för att identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en tdTomato uttrycker mänskliga neurala stamceller (NSC) linje. Strategin använder två kompletterande analyser för att bedöma cell nummer. En analys fungerar via minskningen av 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) till formazan som en proxy för cell nummer och den andra direkt räknar tdTomato uttrycker NSCs. De två analyserna kan utföras samtidigt i ett enda experiment och är inte arbetsintensiva, snabba och billiga. Den strategi som beskrivs i denna demonstration testade 57 föreningar i en förberedande primär skärm för toxicitet i en 96-bra plåtformat. Tre av träffarna karakteriserades ytterligare i en sex-punkts dos svar med samma assay set-up som den primära skärmen. Förutom att ge utmärkt bekräftelse för toxicitet, jämförelse av resultaten från de två analyserna kan vara effektiva i att identifiera föreningar som påverkar andra aspekter av celltillväxt.

Den automatiserade cell räknings data identifierade elva föreningar med mindre än 25% lönsamhet när normaliserade till DMSO kontroll medan MTT data identifierade dessa samma föreningar plus två ytterligare sådana (tabell 1 och tabell 2, skuggad röd). De två föreningar som befunnits vara giftiga endast i MTT-analysen (Wells F3 och G10) hade 31% och 39%, respektive, antalet tdTomato-positiva celler som kontroll och rangordning var de följande två giftigaste föreningarna i det...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Det är ofta nödvändigt att bedöma den potentiella cytotoxiciteten hos en uppsättning av föreningar på odlade celler. Här beskriver vi en strategi för att tillförlitligt skärm för giftiga föreningar i en 96-väl format.

En strategi för att identifiera substanser som påverkar cell tillväxt och överlevnad i odlade däggdjursceller vid låg till måttlig genomströmning

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Detta protokoll erbjuder en snabb och effektiv strategi för att samtidigt använda två analyser för att skärmen flera hundra föreningar för deras effekter på celltillväxt. De analyser kan ge oss information om huruvida specifika föreningar är cytotoxiska, hämmar celltillväxt, eller förstärka celltillväxt. Genom att utnyttja de två analyserna tillsammans, vi har möjlighet att öka noggrannheten och identifiera cytotoxiska föreningar.I fall där resultaten av de två analyserna avviker, denna strategi kan tillåta oss att identifiera förening med unika effekter på cellulär funktion som kan undersökas ytterligare på andra sätt. Den största fördelen med denna strategi är att det är snabbt, billigt, och icke-arbetsintensiva. När behärskar, Det gör det möjligt för forskare att enkelt utföra en primär skärm på upp till 200 föreningar i en vecka, och sedan utföra en uttömmande dos responskurva på 10 till 15 föreningar i en annan vecka.Demonstrera förfarandet kommer att vara jag och Rohini Manickam, en personal forskare och post-studentexamen karl från laboratoriet. Först, i ett biologiskt säkerhetsskåp, odlar celler i en T75 kolv med NSC-medium så att de kommer att vara minst 80%konfluenta när analysen påbörjas. Och placera kolven i en cellkultur inkubator inställd på 37 grader Celsius och fem procent koldioxid.När cellerna når 80%sammanflödet, ta bort kolven från inkubatorn och aspirera av NSC-medium. Tillsätt tre milliliter cell dissociationsreagens och inkubera i fem minuter i inkubatorn. Tillsätt sju milliliter NSC-medium i kolven efter inkubationen och pipetteras kraftigt för att säkerställa att alla celler lossnar.Överför den dissocierade celllösningen till ett 15 milliliterrör och centrifugera vid 200 gånger G i fem minuter. Ta bort supernatanten från röret och dra upp cellerna på 10 milliliter på 10 milliliter av NSC-medium. Använd en automatiserad cellräknare eller hemocytometer för att räkna cellerna, och lägg till NSC-medium i röret för att justera koncentrationen av celler till 200, 000 celler per milliliter.Sedan, med hjälp av sex av de åtta slitsar av en åtta kanals flerkanalspipeledare till platta 100 mikroliter av cellblandningen kolumn genom kolumn i 60 inre brunnar av tre 96 brunnsplattor som har belagts med extracellulär matris. Tillsätt 100 mikroliter av basmedium eller NSC-medium till alla brunnar utan celler för att minimera potentiell avdunstning från yttersta brunnar som innehåller celler. Under ett cellodlingsmikroskop inspekterar du visuellt minst 10 brunnar på var och en av de tre 96 brunnsplattorna för att bekräfta att cellerna sitter vid den förväntade densiteten.Inkubera vid 37 grader Celsius och fem procent koldioxid. Ta bort cellodlingsplattorna från inkubatorn 16 till 24 timmar efter delning, och aspirera av NSC-medelkolumn för kolonn med en åtta kanals flervalspipare, med endast sex av de åtta flervalsplatserna. Tillsätt 95 mikroliter av färskt NSC-medium till varje brunn av de tre replikerande plattorna, och placera plattorna tillbaka i inkubatorn.Med en åtta kanals flervalspipare, tillsätt 49 mikroliter av NSC-medium i var och en av de 60 lyckoavräckningar av en tom U-botten, V-botten, eller rundbottnad 96 brunnsplatta. Unseal den förberedda befälhavaren sammansatta plattan. Pipett en mikroliter av föreningen från masterplattan i var och en av de 60 brunnar som innehåller NSC medium, och blanda den utspädda föreningen tre gånger med en bänk topp pipettor.Därefter tar du bort de tre 96 brunnsplattorna av NSCs från inkubatorn och doserar ut fem mikroliter av den utspädda föreningen i varje brunn av de tre plattorna som innehåller celler för att ge en en till 1000 utspädning för den slutliga sammansatta koncentrationen av 10 mikromolar med en DMSO-koncentration på 0,1%Inkuba celler med förening i 72 timmar, och fortsätt med cytotoxicitetsanalyser. För att utföra dos respons assay, inrätta en 96 väl. Använd kolumn två för sex DMSO-kontrollreplikater, och testa tre exemplar på upp till tre olika föreningar vid tvåfaldiga serieutspädningar, vid sex doser, med början i en hög dos på 10 mikromolar.Späd fyra mikroliter på 100%DMSO eller testförening i DMSO till 196 mikroliter av NSC-medium i ett 0,5 eller 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt 25 mikroliter av den utspädda DMSO för att kontrollera brunnar, och 50 mikroliter av de utspädda testföreningarna till deras motsvarande brunnar. Pipett 25 mikroliter av NSC-medium till de återstående tomma brunnarna i den inre delen av 96 brunnsplattan.Med en flerkanal pipettor, överför 25 mikroliter av föreningen från de 10 mikromolar brunnarna till de fem mikromolar brunnarna, och blanda minst fem gånger. Byt ut pipettspetsarna och upprepa processen genom att blanda de återstående raderna för att generera tre exemplar vid tvåfaldiga utspädningar för totalt sex doser för var och en av föreningarna. Överför fem mikroliter av varje utspädning till en ny platta med odlingsceller som testas.Placera plattan i inkubatorn på 37 grader Celsius och fem procent koldioxid. Efter att celler har inkuberas i 72 timmar, ta bort plattan från inkubatorn och placera den inuti tallriksläsaren. Öppna imager programvara för att ställa in protokoll och experiment filer för studien.Gå till Imager Manuellt läge på Aktivitetshanteraren och klicka på Fånga nu. Välj 96 väl skylt som kärltyp. Välj 10 gånger för förstoringen, och rött fluorescerande protein 531 och 593 för avbildning tdTomato.Klicka på en brunn. Klicka sedan på Autofokus för att fokusera bild, och Auto Expose för korrekt exponeringstid. Justera fokus och exponering manuellt om det behövs.Klicka på kameraikonen för att fånga bilden. Klicka sedan på Process Analysera ovan bild för att fortsätta bygga protokollet. Och välj fliken Analys.Till höger om bilden klickar du på Cellulär analys i Lägg till analyssteg och klickar på Start. Bilden visar markerade celler för att indikera varje enskild cell. Klicka på valet Alternativ för att ändra parametrar för att bättre välja celler baserat på fluorescenströskeln eller cellstorleken.Om imagern är korrekt räknar cellerna, klicka sedan på Lägg till steg längst ned på skärmen. Klicka på ikonen högst upp på skärmen för att skapa experiment från bilduppsättningen. Och på det öppnade fönstret klickar du på Procedur under fliken Protokoll.Välj Sedan Läsa i det nya fönstret som öppnas. Klicka på Fullständig platta om du bara vill markera de 60 brunnar som innehåller cellerna. Klicka på OK om du vill spara ändringar.Klicka sedan på OK i fönstret Procedur. Klicka på ikonen Spela upp om du vill köra plattan. I prompten sparar du filen och klickar sedan på OK i prompten För load plate. Efter avslutad bildbehandling, ladda ner data cellen räkna från imager programvara till ett kalkylblad för analys.Inom två timmar efter att ha slutfört tdTomato imaging, börja MTT analysen. Väg ut 25 milligram MTT och åter avbryta den i fem milliliter NSC medium för att göra fem milligram per milliliter MTT stamlösning. Vortexa lösningen i flera minuter, tills det inte finns några synliga fällningar av MTT.Ta bort cellodlingsplattor från inkubatorn och aspirera av cellodlingsmedium. Späd MTT en till 10 i färskt NSC medium, och tillsätt 100 mikroliter av den utspädda MTT till varje brunn av celler. Inkubera celler vid 37 grader Celsius i två timmar.En purpuraktig fällning syns ungefär i proportion till antalet celler i brunnen. Aspirera MTT-lösningen av plattorna, och tillsätt 50 mikroliter på 100%DMSO till varje brunn. Placera plattorna på en skakmaskin i rumstemperatur i 10 minuter vid 400 RPM.Därefter överför du plattan till en tallriksläsare. Läs av absorbansen för varje brunn vid den förinställda våglängden på 595 nanometer, och exportera data till kalkylblad för analys, exakt som för cellräkningsdata. Undersökning av tdTomato fluorescens bilder visade två brunnar disharmoniska för toxicitet mellan MTT och cellen räkna analysen.För en brunn, cell räkna data föreslog ingen toxicitet. Men MTT data gjorde. En annan brunn hade överskattat cellantal av MTT i förhållande till tdTomato räkna, och verkade ha större celler, medan i brunnar där MTT underskattade cellantal i förhållande till tdTomato, cellerna verkade vara mindre.Sammanfattningsvis klassificerade tdTomato-analysen 11 föreningar som toxiska, 11 som tillväxthämmande, och en som tillväxthöjande, med 34 som inte har någon synbar effekt på celltillväxt. MTT-analysen klassificerade 13 föreningar som giftiga, två som tillväxthämmande, och en som tillväxthöjande, med 41 som inte har någon synbar effekt på celltillväxt. Grafen av livskraftiga celler för föreningen WP1066 visar en relativt platt kurva utan toxicitet för de fyra lägsta koncentrationerna.Kurvan faller snabbt vid fem mikromolar dos, och sjunker till nästan full toxicitet vid 10 mikromolar, vilket leder till den dödliga dosen 50 som 4,4 och 6,0 mikromolar för tdTomato analysen och MTT analys. Det är kritiskt att föreningar späds ut på rätt sätt i dosresponss skärmen så att rätt dosresponskurva genereras. Föreningar som identifieras genom detta förfarande för att påverka celltillväxt kan ytterligare karakteriseras av funktionella analyser för att identifiera potentiellt nya signalering vägar som styr celltillväxt.Föreningar som är giftiga för neurala stamceller har testats som potentiella terapeutiska medel för hjärncancer, såsom glioblastom och neuroblastom. Använd alltid handskar och en labbrock vid hantering av däggdjursceller, DMSO, och MTT. Kassera DMSO och MTT enligt riktlinjerna för kemiskt avfall från din institution.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

En masspektrometribaserad metod för att identifiera fosfoproteinfosfataser och deras interagerare

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Rekonstituering av septinmontering vid membran för att studera biofysiska egenskaper och funktioner

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening för att erhålla kristallträffar för proteinkristallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbaserad kvantifiering av mitokondriell DNA-syntes och distribution med hög kapacitet

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...