Name: a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

Bu çalışma NINDS Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

1. NSC kültürü
NOT: Bir insan NSC satırının manipülasyonu aşağıda açıklanacaktır, ancak bu protokol için herhangi bir hücre satırı kullanılabilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.
<ol><li>Kat 96-iyi plaka ile bodrum membran / ekstrasellüler matris (ECM).<ol>
<li>NSC'nin buz üzerinde bağlanmasını kolaylaştıracak Olan ECM(Malzeme Tablosu)ve eritme aliquot'u. Uygun konsantrasyona seyreltin ECM ...

<ol>
	<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity:+to+Test,+to+predict,+and+how+to+do+it.">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li><li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li><li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes:+interference+with+the+MTT+assay.">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability.">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li><li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay:+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants.">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li><li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity.">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons.">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activator-like+effector+nuclease+(TALEN)-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+(iPSC)+and+neural+stem+cell+(NSC)+lines.">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming.">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).</li><li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay:+assessment+of+chemosensitivity+testing.">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li><li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro:+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects.">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li><li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells.">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li><li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins:+photography,+and+scanning+for+high-throughput+assay.">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li></ol>

Bu makalenin temel amacı, düşük ila orta verimli taramada hücre büyümesini etkileyen bileşikleri verimli ve ucuz bir şekilde tanımlayabilecek bir stratejiyi tanımlamaktı. Sonuçlara olan güveni artırmak ve sadece tek bir töz kullanılmışsa mevcut olmayacak ek bilgiler sunmak için hücre sayısını değerlendirmek için iki ortogonal teknik kullanılmıştır. Tahlillerden biri doğrudan tdTomato-pozitif hücreleri saymak için bir floresan hücre görüntüleyici kullanılan ve ikinci böylece hücre n...

Terapötik potansiyeli olan bir kimyasal bileşik için belirlenmesi gereken en önemli özelliklerinden biri hayvan hücrelerine toksisitesidir. Bu özellik bir ilaç daha kapsamlı bir çalışma için iyi bir aday olup olmadığını belirleyecektir. Çoğu durumda, minimal toksisite ile bileşikler aranır ama belirli hücre türlerini öldürmek için kapasiteye sahip bir bileşik ilgi olduğu durumlar vardır, örneğin, anti-tümörijenik ilaçlar. Tüm hayvanlar sistemik toksisiteyi belirlemek için en iyi model sistemler olmasına rağmen, maliyet ve işçilik dahil birkaç bileşikler den fazla test edilmesi gerektiğinde engelleyicidir. Bu tür memeli hücre kültürü genellikle en verimli alternatif olarak kullanılır1,2. Küçük ve orta ölçekli ilaç ekranları, hücre kültüründe toksisitenin değerlendirilebileceği önemli bir yöntemdir. Bu ekranlar, tek tek sinyal yollarını hedefleyen açıklamalı kitaplıkları sorgulamak için kullanılabilir. Böyle bir ekranın genel biçimi başlangıçta tek bir dozda kütüphanedeki tüm bileşikleri test etmektir (genellikle 10 μM) bir keşif birincil toksisite ekranında, ve sonra tam toksisite karakterize etmek için derinlemesine bir ikincil doz yanıt ekranı gerçekleştirmek birincil ekrandan isabet profili. Bu stratejiyi uygulamak için yöntemler burada açıklanacaktır ve toksik bileşikleri tanımlamak ve karakterize etmek için hızlı, verimli ve ucuz bir yol sağlar.
Memeli hücrelerinde küçük bileşiklerin ve nanomateryalin sitotoksisitesini değerlendirmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir3,4. Bazı malzemelerin yanıltıcı sonuçlar sağlayan tahkikat ile etkileşime girebileceği unutulmamalıdır ve bu tür etkileşimler toksisite ekranlarından isabet karakterize ederken test edilmelidir4. Sitotoksisite tahlilleri trypan mavi dışlamaiçerir 5, laktat dehidrogenaz (LDH) serbest tahlil6, Alamar mavi tahlil7, kalsin asetoksimtil ester (AM)8, ve ATP tahlil9. Tüm bu tahliller hücre numarası için bir proxy olarak hizmet verebilir hücre metabolizmasının çeşitli yönlerini ölçmek. Tüm faydalar sunarken, tetrazolium tuz bazlı tahliller 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-karboksiyanilid iç tuz (XTT)-1, ve 4-4-4-4-4-4-[ İyodofenil]-2-[4-nitrofenil]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen disülfür (WST-1)10,11 düşük maliyetle iyi doğruluk ve kullanım kolaylığı sağlar. Bu gösteride kullanılacak olan MTT, mitokondriyal redüktaz ile çözünmez formazan'a indirgenir ve bu dönüşüm oranı hücre sayısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu titrek rutin olarak hem küçük ölçekte hem de 2.000 bileşiğin12'yekadar olduğu tarama kütüphanelerinde kullanılmaktadır. Hücrelerin etiketli bir işaretçi tarafından doğrudan sayma hücresel sayıyı değerlendirmek için başka bir yöntem sunar ve MTT tsay aksine hücresel büyüme dinamikleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. Birkaç kamuya açık algoritmalar otomatik hücre sayısı analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir ve görüntüleme okuyucuları için yazılım paketlerinin bir parçası olan özel algoritmalar da vardır13,14. Bu yöntem açıklamasında, genetik olarak tdTomato15'i ifade etmek için düzenlenmiş bir insan nöral kök hücresi (NSC) hattı, MTT tahlilleri ile otomatik hücre sayımı arasındaki hücresel canlılık sonuçlarını karşılaştırmak için bir test hattı görevi göreceksiniz. 57 test bileşiğinin toksisitesini değerlendiren bir ekranda test edin. Bu stratejinin birincil amacı toksik bileşikleri belirlemek ve karakterize etmek olmasına rağmen, potansiyel olarak büyüme inhibitörü ve büyüme arttırıcı bileşikleri belirleme nin ek yararına sahiptir ve böylece ilaçların tanımlanması için etkili bir yöntem sağlar hücresel büyümeyi modüle edebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1292px;" width="1292">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B-27 (50X)</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17504001</td>
			<td style="width:720px;">Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BenchTop pipettor</td>
			<td style="width:237px;">Sorenson Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">73990</td>
			<td>Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioLite 96 well multidish</td>
			<td style="width:237px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">130188</td>
			<td>Any 96 well cell culture plate will work.&#160; We use these in our work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture microscope</td>
			<td style="width:237px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse TS100</td>
			<td>Visual inspection of cells to ensure proper density.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytation 5/ Imaging reader</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">CYT3MFV</td>
			<td>Used for cell imaging and absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610420010</td>
			<td>Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FGF-basic</td>
			<td style="width:237px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelTrex</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td>Neural stem cell basement membrane matrix.&#160; Allows cells to attach to cell culture plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 3.04</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Neural stem cell medium component.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtest U-Bottom</td>
			<td style="width:237px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3077</td>
			<td>Storage of compound libraries.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MTT</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M6494</td>
			<td>Active assay reagent to determine cellular viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multichannel pippette</td>
			<td style="width:237px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">E8-1200</td>
			<td>Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21103049</td>
			<td>Neural stem cell base medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFP filter cube</td>
			<td style="width:237px;">BioTek</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1225103</td>
			<td>Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12605036</td>
			<td>Cell dissociation reagent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy to identify compounds that affect cell growth and survival in cultured mammalian cells at low-to-moderate throughput

Sitotoksisite terapötik yararları olabilir ilaçlar çalışırken ölçülmesi gereken kritik bir parametredir. Bu nedenle, birçok ilaç tarama tahlilleri tek tek bileşikler için profilli kritik özelliklerinden biri olarak sitotoksisite kullanmak. Kültür hücreleri daha pahalı ve emek yoğun hayvan modellerinde umut verici kurşun bileşikleri takip geçmeden önce sitotoksisite değerlendirmek için yararlı bir modeldir. İnsan nöral kök hücreleri (NSC) hattında hücre büyümesini etkileyen bileşikleri belirlemek için bir strateji tanımlıyoruz. Strateji, hücre numarasını değerlendirmek için iki tamamlayıcı tahlil kullanır. Bir tsay 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) hücre numarası için bir proxy olarak formazan azaltılması ile çalışır ve diğer doğrudan tdTomato ifade NSCs sayar. İki tahlil tek bir deneyde aynı anda yapılabilir ve emek yoğun, hızlı ve ucuz değildir. Bu gösteride açıklanan strateji 96-iyi plaka formatında toksisite için bir keşif birincil ekranda 57 bileşikler test etti. Üç isabet birincil ekran olarak aynı testi set-up kullanarak altı noktalı doz yanıtı daha karakterize edildi. Toksisite için mükemmel doğrulama sağlamanın yanı sıra, iki tahlil sonuçlarının karşılaştırılması hücre büyümesinin diğer yönlerini etkileyen bileşiklerin belirlenmesinde etkili olabilir.

Otomatik hücre sayısı verileri DMSO kontrolüne normalleştirildiğinde %25'ten daha az canlılığa sahip on bir bileşik tespit ederken, MTT verileri bu bileşikleri artı iki ek bileşikleri tanımlamıştır(Tablo 1 ve Tablo 2, gölgeli kırmızı). Sadece MTT testinde toksik olduğu tespit edilen iki bileşik (F3 ve G10 kuyuları) sırasıyla %31 ve %39'a sahipti, kontrol olarak tdTomato pozitif hücrelerin sayısı ve sıra sırasına göre bu kütüphanede toksik olduğu düş?...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput at JoVE.com

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Bu protokol aynı anda hücre büyümesi üzerindeki etkileri için birkaç yüz bileşikleri taramak için iki tahlil kullanmak için hızlı ve etkili bir strateji sunar. Tahliller belirli bileşiklersi sitotoksik olup olmadığı hakkında bize bilgi sağlayabilir, hücre büyümesini inhibe, ya da hücre büyümesini artırmak. Birlikte iki tahliller kullanarak, doğruluğu artırmak ve sitotoksik bileşikleri belirlemek edebiliyoruz.İki tahlil sonuçlarının farklı olduğu durumlarda, bu strateji bize daha fazla başka yollarla incelenebilir hücresel fonksiyon üzerinde benzersiz etkileri ile bileşik belirlemek için izin verebilir. Bu stratejinin en büyük avantajı, hızlı, ucuz ve işgücü olmayan yoğun olmasıdır. Bir kez hakim, bu araştırmacılar kolayca bir hafta içinde 200 bileşiklerkadar bir birincil ekran gerçekleştirmek için izin verir, ve daha sonra başka bir hafta içinde 10 ila 15 bileşikler üzerinde ayrıntılı bir doz yanıt eğrisi gerçekleştirmek.Prosedürü gösteren ben ve Rohini Manickam, bir personel bilim adamı ve laboratuvardan post-bakalorya adam olacaktır. İlk olarak, biyolojik bir güvenlik kabininde, NSC ortamına sahip bir T75 şişesindeki kültür hücreleri, teşbe başlarken en az %80'inin en fazla konca olacağını söyler. Ve şişeyi 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit olarak ayarlanmış bir hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Hücreler %80 birleştiğinde, şişeyi kuvözden çıkarın ve NSC ortamını aspire edin. Üç mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve kuvözde beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, şişeye yedi mililitre NSC ortamı ekleyin ve tüm hücrelerin kopmasını sağlamak için pipeti şiddetle ekleyin.Ayrıştırılmış hücre çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 200 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı tüpten çıkarın ve 10 mililitre NSC orta daki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 200.000 hücreye yeniden ayarlamak için tüpe NSC ortamı ekleyin.Daha sonra, hücre dışı matris ile kaplanmış üç 96 kuyunun 60 iç kuyusunda sütun alabilen hücre karışımı sütununun 100 mikrolitresini tablalamak için sekiz kanallı çok kanallı pipettorun sekiz yuvasından altısını kullanarak. Hücreleri içeren en dış kuyulardan potansiyel buharlaşmayı en aza indirmek için hücresiz tüm kuyulara 100 mikrolitre baz orta veya NSC ortamı ekleyin. Hücre kültürü mikroskobu altında, hücrelerin beklenen yoğunlukta oturduğunu doğrulamak için üç 96 kuyu plakasının her birinde en az 10 kuyuyu görsel olarak inceleyin.37 santigrat derecede kuluçka ya da %5 karbondioksit. Hücre kültür plakalarını bölmeden 16 ila 24 saat sonra kuvözden çıkarın ve sekiz çok kuyulu yuvadan sadece altısını kullanarak NSC orta sütununu sekiz kanallı çok kuyulu pipettorla kolona aspire edin. Üç çoğaltma plakasının her kuyuya 95 mikrolitre taze NSC ortamı ekleyin ve plakaları kuvöze geri yerleştirin.Sekiz kanallı çok kuyulu pipettor ile, boş bir U dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96 kuyu plaka iç 60 kuyuher birine NSC orta 49 mikrolitre ekleyin. Hazırlanan ana bileşik plakayı kapatın. Pipet, nsc orta içeren iç 60 kuyuların her içine ana plaka bileşik bir mikrolitre, ve bir tezgah üst pipettor ile seyreltilmiş bileşik üç kez karıştırın.Daha sonra, kuvözden nsc üç 96 kuyu plakaları çıkarın ve 72 saat boyunca bileşik ile% 0.1 inküttü hücrelerinin 10 mikromolar son bileşik konsantrasyonu için 10 mikromolar nihai bileşik konsantrasyonu için bir 1000 seyreltme verim hücreleri içeren üç plaka her kuyuiçine seyreltilmiş bileşik beş mikrolitre dağıtmak ve sitotoksisite tahlilleri ile devam edin. Doz yanıt tayini yapmak için, bir 96 iyi kurmak. Altı DMSO kontrol çoğaltmaları için Sütun İki'yi kullanın ve 10 mikromolar yüksek dozile başlayan, altı dozda, iki kat seri seyreltmelerde üç farklı bileşiğin triplicates test.DMSO'daki dört mikrolitreyi %100 DMSO veya test bileşimi 0,5 veya 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 196 mikrolitre NSC ortamına seyreltin. Kuyuları kontrol etmek için seyreltilmiş DMSO'nun 25 mikrolitresini ve seyreltilmiş test bileşiklerinin 50 mikrolitresini ilgili kuyularına ekleyin. Pipet 25 mikrolitre NSC orta kalan boş kuyular için 96 kuyu plaka iç kısmında.Çok kanallı pipettor ile, 10 mikromolar kuyulardan beş mikromolar kuyuya bileşiğin 25 mikrolitresini aktarın ve en az beş kez karıştırın. Pipet uçlarını değiştirin ve bileşiklerin her biri için altı doz toplam iki kat seyreltme ler triplicates oluşturmak için kalan satırları karıştırarak işlemi tekrarlayın. Her seyreltmenin beş mikrolitresini test edilmekte olan kültür hücreleriyle yeni bir tabağa aktarın.Tabağı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvöze yerleştirin. Hücreler 72 saat kuluçkaya yattıktan sonra, tabağı kuvözden çıkarın ve plaka okuyucunun içine yerleştirin. Çalışma için protokol ve deneme dosyaları ayarlamak için görüntüleyici yazılımını açın.Görev Yöneticisi'nde Imager Manuel Modu'na gidin ve Şimdi Yakala'yı tıklatın. Gemi tipi olarak 96 iyi plaka seçin. Büyütme için 10 kez, kırmızı floresan protein 531 ve 593 görüntüleme tdTomato için seçin.Bir kuyuya tıklayın. Ardından görüntüyü odaklamak için Otomatik Netleme'ye ve uygun pozlama süresi için Otomatik Pozlama'ya tıklayın. Gerekirse odağı ve pozlamayı manuel olarak ayarlayın.Resmi yakalamak için kamera simgesini tıklatın. Ardından, protokolü oluşturmaya devam etmek için görüntünün üstündeki İşlem Çözümle'yi tıklatın. Ve Analiz sekmesini seçin.Resmin sağında, Analiz Ekle Adımı'nda Hücresel Çözümleme'yi tıklatın ve Başlat'ı tıklatın. Görüntü, her bir hücreyi göstermek için vurgulanan hücreleri gösterir. Floresan eşiğine veya hücre boyutuna göre hücreleri daha iyi seçmek için parametreleri değiştirmek için Seçenekler seçimini tıklatın.Görüntüleyici hücreleri düzgün bir şekilde sayıyorsa, ekranın alt kısmında Adım Ekle'yi tıklatın. Görüntü kümesinden deneme oluşturmak için ekranın üst kısmındaki simgeyi tıklatın. Açılan pencerede, Protokol sekmesinin altındaki Yordam'ı tıklatın.Ardından, açılan yeni pencerede Oku'yu seçin. Hücreleri içeren yalnızca 60 kuyuyu seçmek için Tam Plaka'yı tıklatın. Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.Ardından Yordam penceresinde Tamam'ı tıklatın. Plakayı çalıştırmak için Oynat simgesini tıklatın. İstemde, dosyayı kaydedin ve ardından Yük Plakası isteminde Tamam'ı tıklatın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, görüntüleyici yazılım programındaki hücre sayısı verilerini analiz için bir elektronik tabloya indirin.TdTomato görüntülemeişlemini tamamladıktan sonra iki saat içinde MTT tsay'ına başlayın. 25 miligram MTT tartın ve mililitre MTT stok çözeltisi başına beş miligram yapmak için beş mililitre NSC orta ile yeniden askıya alın. MTT görünür çökeltiler kadar, birkaç dakika için çözelti girdap.Hücre kültür plakalarını kuvözden çıkarın ve hücre kültürü ortamını aspire edin. MTT'yi taze NSC ortamında 1 ila 10 arasında seyreltin ve seyreltilmiş MTT'nin her bir kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri 37 derecede iki saat boyunca kuluçkaya yatırın.Morumsu bir çökelti kuyudaki hücre sayısı ile orantılı olarak kabaca görülebilir. MTT çözeltisini plakalardan aspire edin ve her kuyuya %100 DMSO'luk 50 mikrolitre ekleyin. 400 RPM'de 10 dakika oda sıcaklığında bir shaker üzerine plakayerleştirin.Bundan sonra, bir plaka okuyucu ya da plaka aktarın. Her kuyunun emiciliğini 595 nanometre önceden ayarlanmış dalga boyunda okuyun ve verileri tam olarak hücre sayısı verileri gibi analiz için elektronik tabloya aktarın. TdTomato floresan görüntülerinin incelenmesi, MTT ve hücre sayımı tsay arasında toksisite için iki kuyu uyumsuz ortaya koymuştur.Bir kuyu için, hücre sayımı verileri toksisite olmadığını gösteriyordu. Ama MTT verileri yaptı. Başka bir kuyu tdTomato sayısına göre MTT tarafından hücre sayısı overestimated vardı, ve daha büyük hücrelere sahip olduğu ortaya çıktı, MTT tdTomato göre hücre sayısını hafife kuyularda ise, hücreler daha küçük olduğu ortaya çıktı.Özetle, tdTomato tsay toksik olarak 11 bileşikler, büyüme inhibitörü olarak 11, ve büyüme arttırıcı olarak bir, 34 hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip. MTT tsay toksik olarak 13 bileşikler sınıflandırılır 13, büyüme inhibitörü olarak iki, ve büyüme arttırıcı olarak bir, 41 hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip. Bileşik WP1066 için canlı hücrelerin grafiği dört en düşük konsantrasyonları için hiçbir toksisite ile nispeten düz eğri gösterir.Eğri hızla beş mikromolar dozdüşer, ve neredeyse tam toksisiteye düşer 10 mikromolar, hangi ölümcül doz yol açar 50 olarak 4.4 ve 6.0 tdTomato testi ve MTT testi için mikromolar. Bileşiklerin doz yanıt ekranında doğru seyreltilmiş olması önemlidir, böylece doğru doz yanıt eğrisi oluşturulur. Hücre büyümesini etkilemek için bu prosedür tarafından tanımlanan bileşikler daha fazla hücre büyümesini kontrol potansiyel olarak yeni sinyal yollarını belirlemek için fonksiyonel tahliller ile karakterize edilebilir.Nöral kök hücreler için toksik bileşikler beyin kanserleri için potansiyel terapötik ajanlar olarak test edilmiştir, glioblastoma ve nöroblastom gibi. Memeli hücreleri, DMSO ve MTT ile işlerken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. DMSO ve MTT'yi kurumunuzun Kimyasal Atık Yönergelerine uygun olarak atın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...