La culture organoïde intestinale 3D limite l’étude de l’interaction épithéliale-pathogène de l’hôte parce que le lumen n’est pas directement accessible aux bactéries ou aux facteurs de virulence. En outre, les matériaux sécrétés tels que les petites molécules, les protéines ou le mucus ne peuvent pas être facilement échantillonnés à partir de la culture 3D pour l’analyse en aval. Pour remédier à ces limitations, nous présentons un protocole modifié pour convertir les entéroïdes humains 3D ou les colonoïdes en monocouche.
Les monomères colonoïdes sécrètent une couche épaisse et apical de mucus, permettant des études ex vivo de l’interaction agent pathogène-mucus. Cette méthode vise à fournir un modèle tractable pour étudier les premières interactions intestinaux hôte-pathogène sur l’infection. Les monomères colonoïdes permettront une nouvelle façon d’étudier la biologie du mucus, ce qui est important dans l’interaction hôte-pathogène, les études sur le microbiome et les maladies inflammatoires de l’intestin.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres organes sécrétant du mucus tels que le tractus gastro-intestinal supérieur, le système respiratoire et le système reproducteur féminin. La démonstration visuelle aidera l’utilisateur avec la conservation de mucus pendant la croissance de monocouche et pendant la fixation pour l’immunostaining. Karol Dokladny, un scientifique de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir incubé la culture cellulaire enduite, aspirez le milieu de culture de la plaque de 24 puits et remplacez-la par une solution millilitres de récolte du froid glacé par puits. Utilisez un mini grattoir cellulaire pour déloger et briser la pastille matricielle membranaire du sous-sol. Portez une attention particulière à tout matériau près des bords du puits.
Puis, agiter la plaque sur un shaker orbital à environ 200 révolutions par minute à quatre degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Utilisez une pipette à canal unique P200 munie de pointes de filtre stériles pour triturer la suspension cellulaire. Livrer la suspension cellulaire dans un flacon conique de 15 millilitres.
Utilisez plusieurs flacons si le volume total de suspension est supérieur à six millilitres. Après cela, ajouter dans le flacon un volume égal de milieu avancé DMEM/F12 contenant 10 millimolar HEPES, L-alanyl-L-glutamine dipeptide, et pénicilline-streptomycine. C’est le milieu de lavage.
Inverser le flacon trois à quatre fois pour mélanger. Centrifugeuse à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Avant le placage cellulaire, équilibrez les inserts enduits dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes.
Pour que chaque insert soit plaqué, réchauffer un millilitre de milieu d’expansion dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et ajouter deux inhibiteurs. Ensuite, ajouter le mélange aux puits. Aspirer le milieu de lavage du tube contenant la pastille cellulaire et remplacer par un milieu d’expansion par un volume suffisant pour produire au moins 100 microlitres par insert et résuspendre.
Ensuite, aspirer la solution collagène IV de chaque insert et laver deux fois avec 150 microlitres du milieu de lavage par insert. Pipette 600 microlitres de milieu d’expansion dans l’espace sous chaque insert. Pipette 100 microlitres de suspension cellulaire du flacon dans chaque insert.
Remettre la plaque à l’incubateur de culture tissulaire et laisser intacte pendant au moins 12 heures. Évitez de secouer ou d’incliner brusquement la plaque. Après l’incubation, placez la plaque sur un microscope à contraste de phase avec une lentille objective de 2,5 à 10 fois.
Rafraîchissez-vous avec un milieu de culture sans inhibiteurs pour interrompre le traitement d’inhibition. Continuer à rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours jusqu’à ce qu’il soit confluent. Soulevez les inserts de culture cellulaire de la plaque de 24 puits avec des pinces à pointe fine ou des pinces à épiler.
Invertissez soigneusement sur un papier de laboratoire pour enlever le milieu apical et essuyez le liquide externe s’accroissant à l’insert. Dans une nouvelle plaque de 24 puits, plonger les inserts dans une solution un à trois d’acide acétique glaciaire et d’éthanol absolu pendant 10 minutes à température ambiante. Puis, sur le banc, inverser l’insert sur du papier de soie pour enlever le fixatif.
Placez les inserts dans un contenant en plastique rempli de 1X PBS pendant 10 minutes pour réhydrater les cellules avant de procéder à des protocoles d’immunostaining standard. Pour préserver, utilisez une lame de rasoir pour couper autour du périmètre de la membrane d’insertion. À l’aide de forceps, transférer la membrane sur une lame de microscope en verre.
Ajouter ensuite le milieu de montage et apposer un verre de couverture. Dans cette expérience, les cultures enteroid et colonoid humaines sont cultivées en tant que structures 3D, puis dissociées et fragmentées pour le placage sur des inserts humains-collagène-IV-enduits de culture cellulaire. La progression de la formation de monocouches est surveillée quotidiennement par microscopie de champ lumineux et coloration d’immunofluorescence.
Des fragments colonoïdes ensemencés sur des filtres recouverts de collagène-IV forment de multiples îles monocouches deux à quatre jours après l’ensemencement. La projection d’intensité maximale et la section optique confocale Z avec les projections orthogonales correspondantes montrent que les zones exemptes de cellules sont identifiables par l’absence de coloration nucléaire et apical de F-actine. Un monocouche colonoïde confluent avec surface apical continue a été détecté par immunostaining de F-actin approximativement une semaine après ensemencement.
Le grossissement élevé d’une projection représentative d’intensité maximale et d’une section optique confocale avec les projections orthogonales correspondantes montre que les cellules dans les monolayers colonoïdes confluents forment les anneaux périjonctionnels F-actin et une bordure apical immature de brosse. L’incorporation d’EdU démontre une perte progressive de prolifération pendant la différenciation jejunal de monlayer. Les monocouches jejunal indifférenciées ont des cellules plus larges et plus courtes, et une bordure apicale moins mûre de brosse d’actine comparée aux monolayers jejunal après cinq jours de différenciation.
Fragmenter les colonoïdes est essentiel. Si les fragments sont trop gros, ils ne s’attacheront pas au filtre enduit, mais se reforment plutôt en un colonoïde 3D. Nous avons présenté une méthode modifiée pour étudier la biologie de mucus sur des monolayers colonoïdes.
D’autres études sur les pathogènes de l’hôte peuvent être réalisées pour examiner l’interaction entre l’agent pathogène et la surface apical intestinale.
