3D 장 가구 배양은 루멘이 박테리아 또는 독성 요인에 직접 접근할 수 없기 때문에 숙주 상피 병원체 상호 작용의 연구를 제한합니다. 추가적으로, 소분자, 단백질 또는 점액과 같은 분비된 물질은 다운스트림 분석을 위한 3D 배양에서 쉽게 샘플링될 수 없습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 3D 인간 엔테로이드 또는 콜로노이드를 단층으로 변환하기 위한 수정된 프로토콜을 제시합니다.
콜로노이드 단층은 두꺼운, apical 점액 층을 분비, 병원체 점액 상호 작용의 전 생체 연구를 허용. 이 방법은 감염시 초기 장 숙주 병원균 상호 작용을 연구하는 기관 모델을 제공하는 것을 목표로합니다. 콜로노이드 단층은 숙주 병원체 상호 작용, 미생물군유전체 연구 및 염증성 장 질환에서 중요한 점액 생물학을 연구하는 새로운 방법을 허용할 것입니다.
이 방법은 상부 기관, 호흡기 및 여성 생식 시스템과 같은 다른 점액 분비 기관에 적용 될 수있다. 시각 데모는 단층 성장 중 및 면역 염색을 위한 고정 도중 점액 보존을 가진 사용자를 도울 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 직원 과학자 인 카롤 도클라디 (Karol Dokladny)가 될 것입니다.
코팅된 세포 배양을 배양한 후, 배양 배지를 24웰 플레이트로부터 흡인시키고 웰당 1밀리리터 얼음냉수확용액으로 대체한다. 미니 셀 스크레이퍼를 사용하여 지하 막 매트릭스 펠릿을 빼고 분해하십시오. 우물 가장자리 근처의 모든 재료에 특별한주의를 기울이는 다.
그런 다음, 30 ~45 분 동안 섭씨 4도에서 분당 약 200 회전에서 궤도 셰이커에 플레이트를 교반합니다. 멸균 필터 팁이 장착된 P200 단일 채널 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 세트리트합니다. 15 밀리리터 원내 유리병에 세포 현탁액을 전달합니다.
총 서스펜션 볼륨이 6밀리리터보다 큰 경우 여러 바이알을 사용합니다. 그 후, 바이알에 10 밀리머 HEPES, L-alanyl-L-글루타민 디펩티드 및 페니실린-연쇄 절제술을 함유한 고급 DMEM/F12 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다. 이것은 세척 매체입니다.
유리병을 3~4회 반전하여 섞어보냅니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 g의 원심분리기. 세포 도금 전에, 적어도 30 분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 코팅 된 인서트를 평형.
각 인서트가 도금될 때마다 섭씨 37도의 수조에서 팽창 매체 1밀리리터를 따뜻하게 하고 2개의 억제제가 추가됩니다. 그런 다음, 우물에 혼합물을 추가합니다. 세포 펠릿을 함유하는 튜브로부터 세척 매체를 흡인하고 삽입당 최소 100 마이크로리터를 산출하고 재중단하기에 충분한 부피로 팽창 매체로 대체한다.
이어서, 각 인서드로부터 콜라겐 IV 용액을 흡인시키고 삽입당 세척 매체 150마이크로리터로 두 번 세척한다. 각 인서트 아래 공간으로 확장 매체의 파이펫 600 마이크로리터. 각 삽입에 유리병에서 세포 현탁액의 파이펫 100 마이크로 리터.
접시를 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 적어도 12 시간 동안 방해받지 않고 둡니다. 접시가 흔들리거나 급격하게 기울어지 않도록 하십시오. 인큐베이팅 후, 플레이트를 2.5배에서 10배의 객관적렌즈로 위상 대비광 현미경에 놓습니다.
억제제 없이 배양 배지로 리프레시하여 억제 처리를 중단합니다. 혼잡할 때까지 2~3일마다 미디어를 새로 고칩니다. 미세 한 팁 집게 또는 핀셋으로 24 웰 플레이트에서 세포 배양 삽입을 들어 올립니다.
실험실 티슈 페이퍼를 조심스럽게 뒤집어 정압 매체를 제거하고 삽입물에 달라붙는 외부 액체를 닦아냅니다. 새로운 24웰 플레이트에서 빙하 아세트산과 절대 에탄올의 1~3가지 용액에 실온에서 10분 간 삽입을 담급합니다. 그런 다음, 벤치에, 고정을 제거하기 위해 티슈 페이퍼에 삽입을 반전.
표준 면역 스테인닝 프로토콜을 진행하기 전에 세포를 재수화하기 위해 1X PBS로 채워진 플라스틱 용기에 인서트를 10 분 동안 배치합니다. 보존하려면 면도날을 사용하여 삽입 멤브레인의 둘레를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 멤브레인을 유리 현미경 슬라이드로 옮킵니다.
그런 다음 마운팅 매체를 추가하고 커버 글래스를 부착합니다. 이 실험에서 인간 장용 및 대장균 배양은 3D 구조로 재배된 다음 인간-콜라겐-IV 코팅 된 세포 배양 삽입에 도금하기 위해 해리되고 단편화됩니다. 단층 형성의 진행은 밝은 필드 현미경 검사법과 면역 형광 염색을 통해 매일 모니터링됩니다.
인간 콜라겐-IV 코팅 필터에 시드된 콜로노이드 파편은 파종 후 2~4일 동안 여러 단층 섬을 형성합니다. 상응하는 직교 투영을 가진 최대 강도 투영 및 공초점 광학 Z 단면도 둘 다 핵및 apical F 액틴 얼룩의 부재에 의해 세포 없는 지역이 식별된다는 것을 보여줍니다. 연속 적색 표면을 가진 컨물류 콜로노이드 모노레이어는 F-actin 면역 스테인링에 의해 약 1주일 후 시드를 검출하였다.
상응하는 직교 투영을 가진 대표적인 최대 강도 투영 및 공초점 광학 섹션의 높은 배율은 Confluent colonoid 단층의 세포가 F 액틴 perijunctional 링과 미성숙 한 정량 브러시 테두리를 형성한다는 것을 보여줍니다. EdU 법인은 제주 단일층 분화 시 확산의 점진적 손실을 보여줍니다. 미분화 된 제주 단층은 분화 5 일 후에 제주 단층과 비교하여 더 넓고, 짧은 세포 및 덜 성숙한 apical actin 기지를 둔 브러시 테두리를 갖는다.
콜로노이드를 조각화하는 것은 매우 중요합니다. 조각이 너무 크면 코팅된 필터에 부착되지 않고 대신 3D 콜로노이드로 개혁합니다. 우리는 대장형 모노레이어에 점액 생물학을 공부하는 수정된 방법을 제시했습니다.
그밖 숙주 병원체 연구 결과는 병원체와 장 정액 표면 사이 상호 작용을 보기 위하여 수행될 수 있습니다.
