El cultivo organoide intestinal 3D limita el estudio de la interacción epitelial-patógeno del huésped porque el lumen no es directamente accesible a las bacterias o factores de virulencia. Además, los materiales secretados como moléculas pequeñas, proteínas o moco no se pueden muestrear fácilmente del cultivo 3D para el análisis posterior. Para abordar estas limitaciones, presentamos un protocolo modificado para convertir enteroides o colonoides humanos 3D en monocapa.
Las monocapas colonoides secretan una capa de moco espesa y apical, lo que permite estudios ex vivos de la interacción patógeno-moco. Este método tiene como objetivo proporcionar un modelo manejable para estudiar las primeras interacciones huésped-patógeno intestinal tras la infección. Las monocapas colonoides permitirán una nueva forma de estudiar la biología del moco, que es importante en la interacción huésped-patógeno, estudios de microbioma y enfermedad inflamatoria intestinal.
Este método se puede aplicar a otros órganos secretores de moco como el tracto gastrointestinal superior, el sistema respiratorio y el sistema reproductivo femenino. La demostración visual ayudará al usuario con la preservación de la mucosidad durante el crecimiento monocapa y durante la fijación para inmunosu manchado. Demostrando el procedimiento estará Karol Dokladny, un científico del personal de nuestro laboratorio.
Después de incubar el cultivo celular recubierto, aspirar el medio de cultivo de la placa de 24 pozos y reemplazar con una solución de cosecha helada de un mililitro por pozo. Utilice un rascador de mini células para desalojar y romper el pellet de matriz de membrana del sótano. Preste especial atención a cualquier material cerca de los bordes del pozo.
Luego, agitar la placa en un agitador orbital a aproximadamente 200 revoluciones por minuto a cuatro grados Celsius durante 30 a 45 minutos. Utilice una pipeta de canal único P200 equipada con puntas de filtro estériles para triturar la suspensión celular. Entregue la suspensión celular en un vial cónico de 15 mililitros.
Utilice varios viales si el volumen total de la suspensión es superior a seis mililitros. Después de eso, añadir en el vial un volumen igual de advanced DMEM/F12 medio que contiene 10 HEPES milimétricos, dipéptido de L-alanil-L-glutamina, y penicilina-estreptomicina. Este es el medio de lavado.
Invierta el vial de tres a cuatro veces para mezclar. Centrifugar a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Antes de la enrojección celular, equilibre las inserciones recubiertas en una incubadora de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos.
Para cada plaquita a planchar, caliente un mililitro de medio de expansión en un baño de agua de 37 grados Celsius y agregue dos inhibidores. A continuación, agregue la mezcla a los pozos. Aspirar el medio de lavado del tubo que contiene el pellet celular y reemplazarlo por medio de expansión con un volumen suficiente para producir al menos 100 microlitros por plaquita y resuspend.
A continuación, aspirar la solución de colágeno IV de cada plaquita y lavar dos veces con 150 microlitros del medio de lavado por plaquita. Pipetear 600 microlitros de medio de expansión en el espacio debajo de cada plaquita. Pipetear 100 microlitros de suspensión celular del vial en cada plaquita.
Devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y deje sin perturbaciones durante al menos 12 horas. Evite agitar o inclinar bruscamente la placa. Después de la incubación, coloque la placa sobre un microscopio de luz de contraste de fase con una lente objetivo de 2,5 a 10 veces.
Refrescar con medio de cultivo sin inhibidores para interrumpir el tratamiento de inhibición. Continúe actualizando el medio cada dos o tres días hasta que sea confluente. Levante los insertos de cultivo celular de la placa de 24 pocillos con fórceps o pinzas de punta fina.
Invierta cuidadosamente en un papel tisú de laboratorio para extraer el medio apical y limpie el líquido externo que se adhiere al inserto. En una nueva placa de 24 pozos, sumerja las plaquitas en una solución de uno a tres de ácido acético glacial y etanol absoluto durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en el banco, invierta la plaquita en papel tisú para extraer el fijador.
Coloque las plaquitas en un recipiente de plástico lleno de 1X PBS durante 10 minutos para rehidratar las células antes de proceder con los protocolos de inmunosutención estándar. Para conservarlo, utilice una cuchilla de afeitar para cortar alrededor del perímetro de la membrana de inserción. Usando fórceps, transfiera la membrana a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
A continuación, agregue el medio de montaje y coloque un cristal de cubierta. En este experimento, los cultivos enteroides y colonoides humanos se cultivan como estructuras 3D, luego se disoccian y se fragmentan para enchapar en inserciones de cultivo celular recubiertas de colágeno-IV. El progreso de la formación de monocapas se controla diariamente mediante microscopía de campo brillante y tinción de inmunofluorescencia.
Fragmentos colonoides sembrados en filtros recubiertos de humano-colágeno-IV forman múltiples islas monocapa de dos a cuatro días después de la siembra. Tanto la proyección de intensidad máxima como la sección Z óptica confocal con las proyecciones ortogonales correspondientes muestran que las áreas libres de células son identificables por la ausencia de tinción nuclear y apical de F-actina. Una monocapa colonoide confluente con superficie apical continua fue detectada por inmunostaining F-actin aproximadamente una semana después de la siembra.
El aumento elevado de una proyección de intensidad máxima representativa y una sección óptica confocal con las proyecciones ortogonales correspondientes muestran que las células en monocapas colonoides confluentes forman los anillos perijuncionales F-actin y un borde de pincel apical inmaduro. La incorporación de EdU demuestra una pérdida progresiva de proliferación durante la diferenciación monocapa de jejunal. Las monocapas jejunales indiferenciadas tienen células más anchas y más cortas, y un borde de maleza apical menos maduro en comparación con las monocapas de jejunal después de cinco días de diferenciación.
Fragmentar los colonoides es fundamental. Si los fragmentos son demasiado grandes, no se unirán al filtro recubierto, sino que se reformarán en un colonoide 3D. Presentamos un método modificado para estudiar la biología mucosa en monocapas colonoides.
Se pueden realizar otros estudios patógenos del huésped para examinar la interacción entre el patógeno y la superficie apical intestinal.
