Induktion af somitderivater fra inducerede pluripotente stamceller eller iPSC er et afgørende skridt i brugen af pluripotente stamceller til regenerativ behandling eller sygdomsforskning. Denne teknik kan bruges til at differentiere menneskelige iPS-celler i somite derivater såsom myotomer, dermatome, sclerotome og syndetome celler under kemisk definerede betingelser. Ved hjælp af iPSC etableret fra en patient, der lider af en uhåndterlig muskel-og skeletbesvær, denne metode kan bruges til modellering af fænotype af sygdommen og til at teste de nye lægemidler behandlinger.
Denne metode kan også anvendes til at fremme vores forståelse af biologi og de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af paraxial mesoderm under human embryogenese. Fire dage før start presomitic mesoderm induktion, pels en 10-centimeter skål med fire milliliter ekstracellulære matrix løsning til en overnatning inkubation ved fire grader Celsius. Næste morgen skal du udskifte den ekstracellulære matrixopløsning med otte milliliter feeder-fri cellekulturmedium.
For at begynde feeder-fri dyrkning, vaske den menneskelige iPSC kultur med PBS, og tilsæt en milliliter CTK løsning til kultur parabol. Når cellerne begynder at løsne sig fra skålbunden, vaskes kulturen to gange med frisk PBS for helt at fjerne alle SNL-fødecellerne, før du tilføjer en milliliter feeder-fri cellekulturmedium til skålen. Brug en celleskraber til manuelt at løsne stamcellerne og overføre cellerne til et konisk rør med 15 milliliter.
Pipetter forsigtigt celleopløsningen tre gange med en 1.000 mikroliters pipettespids, og overfør cellerne til den ekstracellulære matrixbelagte kulturskål. Derefter returnere cellerne til cellekulturskuvøsen i tre dage. Ved slutningen af inkubationen erstattes feeder-fri cellekulturmediet med otte milliliter presomitisk mesoderminduktionsmedium, og initier præomitisk mesodermdifferentiering i cellekulturskuvøsen i de næste fire dage, hvilket ændrer mediet på dag tre.
Ved inkubationens afslutning isoleres de deltalignende protein 1-positive celler ved flowcytometri, og de sorterede celler indsamles ved centrifugering. Resuspend pellet i en milliliter somitisk mesoderm induktion medium til optælling, og frø en gange 10 til den femte celler i hver brønd af en ekstracellulær matrix løsning-belagt 12-brønd plade, der indeholder en milliliter somitisk mesoderm induktion medium suppleret med 10 mikromolar af rho kinase, eller ROCK, inhibitor Y-27632. Derefter returneres cellerne til cellekulturskuvøsen i yderligere fire dage, hvilket ændrer mediet, der ikke indeholder inhibitoren på kulturens dag et og tre.
For syndetom differentiering fra sclerotome celler, vaskes sclerotome cellerne med PBS, før cellerne tages af med 0,2 milliliter resociationsgengøring pr. brønd. Efter tre minutter ved stuetemperatur tilsættes 0,8 milliliter kemisk defineret basalt medium til hver brønd, og afmontere cellerne med en celleskraber. Cellerne overføres til et konisk rør med 15 milliliter til centrifugering, og pelletsuspendres i en milliliter syndetome induktionsmedium til optælling.
Frø fem gange 10 til de fjerde celler i hver brønd af en ekstracellulær matrix opløsning-belagt 24-brønd plade, der indeholder en milliliter syndetome induktion medium en, og returnere pladen til cellekultur inkubator i tre dage. På dag tre af syndetome induktion, erstatte mediet med syndetome induktion medium to, og returnere pladen til inkubatoren i 18 dage, ændre mediet hver tredje dag. Efter presomitisk mesoderm differentiering, over 85% af cellerne er positive for delta-lignende protein 1, en markør for presomitic mesoderm, men negativ for PAX3, en markør for somitic mesoderm.
Denne population bliver PAX3 positive somitiske mesoderm celler efter fire dage med somitisk mesoderm induktion. Yderligere, farvning af cadherin-11, en markør for epiteliseret somitisk mesoderm, kun ophobes ved celle-til-celle kryds, efter tilsætning af CHIR99021. Differentiering mod dermomyotom, myotome, dermatome, sclerotome og syndetome kan vurderes ved immunocytokemi og PAX3 fluorescens.
Svarende til humane dermal fibroblaster, iPSC-afledte dermatomeceller producerer kollagen og hyaluronsyre som vurderet af ELISA. For at påvise den sammenlignelige reaktivitet af humane iPSC-afledte syndetome og humane voksne tenocytter, kan der udføres en mekanisk strækstimuleringsanalyse. Før iPSC-aflevering bekræftes det, at kulturens sammenløb er mellem 70 og 80 %, og de opdelte celler ved et-til-to-forholdet i overensstemmelse hermed.
Denne passaging er afgørende for en vellykket iPSCs differentiering. For fremtidige cellebaserede behandlinger ved hjælp af denne metode er det nødvendigt at etablere en ny germfri tilstand, der ikke omfatter komponenter, der stammer fra ikke-menneskelige dyr.
