L'induzione di derivati del somite da cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSC, è un passo fondamentale per l'utilizzo di cellule staminali pluripotenti per la terapia rigenerativa o applicazioni di ricerca sulle malattie. Questa tecnica può essere utilizzata per differenziare le cellule iPS umane in derivate somite come miotoma, dermatoma, sclerotoma e cellule sinaptome in condizioni chimicamente definite. Utilizzando l'iPSC stabilito da un paziente affetto da un disturbo muscoloscheletricho intrattabile, questo metodo può essere utilizzato per modellare il fenotipo della malattia e per testare le nuove terapie farmacologiche.
Questo metodo può anche essere applicato per promuovere la nostra comprensione della biologia e dei meccanismi alla base dello sviluppo del mesoderma parassiale durante l'embriogenesi umana. Quattro giorni prima di iniziare l'induzione del mesoderma presomitico, rivestire un piatto di 10 centimetri con quattro millilitri di soluzione di matrice extracellulare per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina dopo, sostituire la soluzione a matrice extracellulare con otto millilitri di mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori.
Per iniziare la coltivazione senza alimentatori, lavare la coltura iPSC umana con PBS e aggiungere un millilitro di soluzione CTK al piatto di coltura. Quando le cellule iniziano a staccarsi dal fondo del piatto, lavare la coltura due volte con PBS fresco per rimuovere completamente tutte le cellule di alimentazione SNL prima di aggiungere un millilitro di mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori al piatto. Utilizzare un raschietto cellulare per staccare manualmente le cellule staminali e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.
Pipettare delicatamente la soluzione cellulare tre volte con una punta di pipetta da 1.000 microliter e trasferire le cellule nel piatto di coltura extracellulare rivestito con matrice. Quindi, riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori con otto millilitri di mezzo di induzione del mesoderma presomitico e iniziare la differenziazione del mesoderma presomitico nell'incubatore di coltura cellulare per i prossimi quattro giorni, cambiando il mezzo il terzo giorno.
Alla fine dell'incubazione, isolare le cellule positive della proteina delta 1 per citometria a flusso e raccogliere le cellule ordinate per centrifugazione. Rimescolare il pellet in un millilitro di mezzo di induzione del mesoderma somitico per il conteggio e seminare una volta 10 alla quinta cella in ogni pozzo di una piastra a 12 elementi rivestita in soluzione di matrice extracellulare contenente un millilitro di mezzo di induzione del mesoderma somitico integrato con 10 micromolare della rho chinasi, o ROCK, inibitore Y-27632. Quindi, riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri quattro giorni, cambiando il mezzo che non contiene l'inibitore nei giorni uno e tre della coltura.
Per la differenziazione del sinetoma dalle cellule dello sclerotoma, lavare le cellule dello sclerotoma con PBS prima di staccare le cellule con 0,2 millilitri di reagente di dissociazione cellulare per pozzo. Dopo tre minuti a temperatura ambiente, aggiungere 0,8 millilitri di mezzo basale definito chimicamente ad ogni pozzo e staccare le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione e rimorsi il pellet in un millilitro di mezzo di induzione syndetome per il conteggio.
Seme cinque volte 10 alla quarta cella in ogni pozzo di una piastra a 24 elementi rivestita in soluzione a matrice extracellulare contenente un millilitro di mezzo di induzione syndetome e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Il terzo giorno di induzione del sintetomo, sostituire il mezzo con il mezzo di induzione syndetome due e riportare la piastra all'incubatore per 18 giorni, cambiando il mezzo ogni tre giorni. Dopo la differenziazione del mesoderma presomitico, oltre l'85% delle cellule sono positive per la proteina delta-like 1, un marcatore del mesoderma presomitico, ma negativo per PAX3, un marcatore del mesoderma somitico.
Questa popolazione diventa cellule mesodermiche somitiche positive PAX3 dopo quattro giorni di induzione del mesoderma somitico. Inoltre, la colorazione della cadherina-11, un marcatore del mesoderma somitico epitelializzato, si accumula solo alle giunzioni da cellula a cellula, in seguito all'aggiunta di CHIR99021. La differenziazione verso dermomiotoma, miotoma, dermatoma, sclerotoma e sintetoma può essere valutata mediante immunocitochimica e fluorescenza PAX3.
Analogamente ai fibroblasti dermici umani, le cellule dermatome derivate dall'iPSC producono collagene e acido ialuronico come valutato da ELISA. Per dimostrare la reattività comparabile del sintetoma derivato dall'iPSC umano e dei tenociti adulti umani, è possibile eseguire un saggio di stimolazione meccanica dell'allungamento. Prima della passaging iPSC, verificare che la confluenza delle impostazioni cultura sia compresa tra il 70 e l'80% e che le celle divise con un rapporto uno-due-uno-uno-quattro di conseguenza.
Questo passaging è fondamentale per una differenziazione efficace degli IPSC. Per le future terapie a base cellulare utilizzando questo metodo, è necessario stabilire una nuova condizione priva di germi che non includa componenti derivati da animali non umani.
