Induksjonen av somite derivater fra induserte pluripotente stamceller, eller iPSC, er et kritisk skritt for bruk av pluripotente stamceller for regenerativ terapi eller sykdomsforskningsapplikasjoner. Denne teknikken kan brukes til å differensiere humane iPS-celler til somite derivater som myotome, dermatom, sclerotome og syndetomceller under kjemisk definerte forhold. Ved hjelp av iPSC etablert fra en pasient som lider av en intractable muskel-skjelettlidelse, kan denne metoden brukes til å modellere fenotypen av sykdommen og for å teste de nye legemiddelbehandlingene.
Denne metoden kan også brukes til å fremme vår forståelse av biologien og mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av paraksial mesoderm under menneskelig embryogenese. Fire dager før du starter presomitic mesoderm induksjon, belegge en 10-centimeter tallerken med fire milliliter ekstracellulær matrise løsning for en overnatting inkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen erstatter du den ekstracellulære matriseløsningen med åtte milliliter materfri cellekulturmedium.
For å begynne materfri dyrking, vask den menneskelige iPSC-kulturen med PBS, og legg til en milliliter CTK-løsning til kulturretten. Når cellene begynner å løsne fra parabolen bunnen, vaske kulturen to ganger med fersk PBS å fullt ut fjerne alle SNL mater celler før du legger til en milliliter mater-fri celle kultur medium til parabolen. Bruk en celleskraper til å koble stamcellene manuelt, og overfør cellene til et konisk rør på 15 milliliter.
Pipette celleløsningen forsiktig tre ganger med en 1000 mikroliter pipettespiss, og overfør cellene til den ekstracellulære matrisebelagte kulturfatet. Deretter returnerer du cellene til cellekulturinkubatoren i tre dager. På slutten av inkubasjonen erstatter du materfri cellekulturmedium med åtte milliliter presomitic mesoderm induksjonsmedium, og initier presomitic mesoderm differensiering i cellekulturinkubatoren for de neste fire dagene, endre mediet på dag tre.
På slutten av inkubasjonen isolerer du det deltalignende proteinet 1 positive celler ved strømningscytometri, og samler de sorterte cellene ved sentrifugering. Resuspend pellet i en milliliter av somitisk mesoderm induksjon medium for telling, og frø en ganger 10 til femte celler i hver brønn av en ekstracellulær matrise løsning-belagt 12-brønns plate som inneholder en milliliter somitisk mesoderm induksjon medium supplert med 10 mikromos av rho kinase, eller ROCK, hemmer Y-27632. Deretter returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i fire dager til, og endrer mediet som ikke inneholder hemmeren på dag en og tre av kulturen.
For syndetom differensiering fra skleotomiceller, vask skleotomicellene med PBS før du løsner cellene med 0,2 milliliter celledissosiasjonsreagens per brønn. Etter tre minutter ved romtemperatur, tilsett 0,8 milliliter kjemisk definert basal medium til hver brønn, og koble cellene med en celleskraper. Overfør cellene til et konisk rør på 15 milliliter for sentrifugering, og gjenoppuspend pelleten i ett milliliter syndetominduksjonsmedium for telling.
Seed fem ganger 10 til de fjerde cellene i hver brønn av en ekstracellulær matrise løsningsbelagt 24-brønns plate som inneholder en milliliter syndetom induksjon medium en, og returnere platen til cellekultur inkubator i tre dager. På dag tre av syndetom induksjon, erstatte mediet med syndetom induksjon medium to, og returnere platen til inkubatoren i 18 dager, endre mediet hver tredje dag. Etter presomitisk mesoderm differensiering er over 85% av cellene positive for deltalignende protein 1, en markør for presomitic mesoderm, men negativ for PAX3, en markør for somitisk mesoderm.
Denne populasjonen blir PAX3 positive somitiske mesodermceller etter fire dager med somitisk mesoderm induksjon. Videre, farging av kadherin-11, en markør for epitelialisert somitisk mesoderm, akkumuleres bare ved celle-til-celle-kryss, etter tillegg av CHIR99021. Differensiering mot dermomyotome, myotome, dermatom, sclerotome og syndetom kan vurderes ved immunocytochemistry og PAX3 fluorescens.
I likhet med humane dermale fibroblaster produserer iPSC-avledede dermatomceller kollagen og hyaluronsyre som vurdert av ELISA. For å demonstrere sammenlignbar reaktivitet av human iPSC-avledet syndetom og humane voksne tenocytter, kan en mekanisk strekkstimuleringsanalyse utføres. Før iPSC passaging, må du bekrefte at kulturkonfluensen er mellom 70 og 80%, og de delte cellene ved ett til to til ett-til-fire-forhold tilsvarende.
Denne passaging er avgjørende for vellykket iPSCs differensiering. For fremtidige cellebaserte terapier ved hjelp av denne metoden, er det nødvendig å etablere en ny bakteriefri tilstand som ikke inkluderer noen komponenter avledet fra ikke-menneskelige dyr.
