Индукция производных сомита из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или iPSC, является критическим шагом для использования плюрипотентных стволовых клеток для регенеративной терапии или применения исследований заболеваний. Этот метод может быть использован для дифференцировать человеческие клетки iPS в производные сомита, такие как миотом, дерматом, склеротом и синдитомные клетки в химически определенных условиях. Используя iPSC установленный от пациента терпя от неразрешимого разлада опорно-двигательного мышцы, этот метод можно использовать для моделировать фенотип заболевания и для испытывать новые терапии снадобья.
Этот метод также может быть применен для дальнейшего нашего понимания биологии и механизмов, лежащих в основе развития параксиального мезодерма во время эмбрионогенеза человека. За четыре дня до начала предсомитической индукторской индукторной системы, пальто 10-сантиметровое блюдо с четырьмя миллилитров внеклеточного матричного раствора для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро замените внеклеточный матричный раствор восемью миллилитров среды культуры клеток, свободной от фидеров.
Чтобы начать культивирование без кормушки, вымойте культуру iPSC человека с помощью PBS и добавьте один миллилитр раствора CTK в культурное блюдо. Когда клетки начинают отделяться от дна блюда, мыть культуру два раза со свежими PBS, чтобы полностью удалить все клетки подачи SNL, прежде чем добавить один миллилитр фидер свободной клеточной культуры среды блюдо. Используйте клеточный скребок, чтобы вручную отделить стволовые клетки и перенести клетки в 15-миллилитровую коническую трубку.
Аккуратно пипетка клеточного раствора три раза с 1000-микролитровым наконечником пипетки, и передать клетки внеклеточной матрицы покрытием культуры блюдо. Затем верните клетки в инкубатор клеточной культуры на три дня. В конце инкубации замените среду культуры клеток, свободных от фидеров, восемью миллилитров пресомитической среды индукции мезодерма и инициируем предсомитическую мезодермическую дифференциацию в инкубаторе клеточной культуры в течение следующих четырех дней, изменив среду на третий день.
В конце инкубации изолируйте дельта-как белок 1 положительные клетки по цитометрии потока, и собирать отсортированные клетки центрифугации. Resuspend гранулы в один миллилитр somitic мезодерма индукционной среды для подсчета, и семена один раз от 10 до пятой клетки в каждый колодец внеклеточного матричного раствора покрытием 12-хорошо пластины, содержащей один миллилитр somitic мезодерм индукции среды дополняется 10 микромолярной родианазы, или ROCK, ингибитор Y-27632. Затем верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на четыре дня, изменив среду, не содержащую ингибитора в дни один и три культуры.
Для дифференциации синдетома от клеток склеротома, мыть клетки склеротома с PBS перед отсоединением клеток с 0,2 миллилитров реагента диссоциации клеток на колодец. После трех минут при комнатной температуре добавьте 0,8 миллилитров химически определенной базальной среды к каждой хорошо, и отсоедините клетки с скребком клетки. Перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку для центрифугации и повторно посовечите гранулы в один миллилитр синдетомной индукционной среды для подсчета.
Семя пять раз от 10 до четвертой клетки в каждый колодец внеклеточного матричного раствора покрытием 24-хорошо пластины, содержащей один миллилитр синдетом индукции среднего один, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток в течение трех дней. На третий день индукции синдетома замените среду синдетомной индукционной средой два и верните пластину в инкубатор на 18 дней, меняя среду каждые три дня. После пресомитической мезодермической дифференциации, более 85% клеток являются положительными для дельта-как белок 1, маркер пресомитного мезодерма, но отрицательный для PAX3, маркер сомитического мезодерма.
Эта популяция становится PAX3 положительные сомитические мезодермные клетки после четырех дней сомитического мезодерма индукции. Кроме того, окрашивание кадхерин-11, маркер эпителиализированных сомитических мезодермов, накапливается только на клеточном стыке, после добавления CHIR99021. Дифференциация в сторону дермомиотома, миотома, дерматома, склеротома и синдетома может быть оценена с помощью иммуноцитохимии и флуоресценции PAX3.
Как и человеческие кожные фибробласты, клетки дерматома, полученные iPSC, производят коллаген и гиалуроновую кислоту, по оценке ELISA. Чтобы продемонстрировать сопоставимую реактивность с синдетома, полученного человеком iPSC, и взрослых теноцитов человека, можно проработать анализ механической стимуляции растяжения. Перед тем, как iPSC пройдет, подтвердите, что слияние культуры составляет от 70 до 80%, а разделенные ячейки — от одного до двух к соотношению один к четырем соответственно.
Это пропуск имеет решающее значение для успешной дифференциации iPSCs. Для будущих клеточных методов лечения, использующих этот метод, необходимо создать новое состояние, свободное от микробов, которое не включает в себя какие-либо компоненты, полученные от не-человеческих животных.
