La inducción de derivados de somita a partir de células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, es un paso crítico para el uso de células madre pluripotentes para aplicaciones de terapia regenerativa o investigación de enfermedades. Esta técnica se puede utilizar para diferenciar las células iPS humanas en derivados de somita como miotomo, dermatoma, esclerotomo y células sindetomas en condiciones químicamente definidas. Utilizando iPSC establecido a partir de un paciente que sufre de un trastorno musculoesquelético intratable, este método se puede utilizar para modelar el fenotipo de la enfermedad y para probar las nuevas terapias farmacológicas.
Este método también se puede aplicar para promover nuestra comprensión de la biología y los mecanismos subyacentes al desarrollo del mesodermo paraxial durante la embrión humana. Cuatro días antes de iniciar la inducción del mesodermo pres omótico, cubra un plato de 10 centímetros con cuatro mililitros de solución de matriz extracelular para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, reemplace la solución de matriz extracelular por ocho mililitros de medio de cultivo celular libre de alimentadores.
Para comenzar el cultivo sin alimentación, lave el cultivo humano de iPSC con PBS y agregue un mililitro de solución CTK al plato de cultivo. Cuando las células comiencen a desprenderse del fondo del plato, lave el cultivo dos veces con PBS fresco para eliminar completamente todas las células alimentadoras de SNL antes de agregar un mililitro de medio de cultivo celular libre de alimentación al plato. Utilice un rascador de células para separar manualmente las células madre y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros.
Pipetee suavemente la solución celular tres veces con una punta de pipeta de 1.000 microlitrotro, y transfiera las células al plato de cultivo recubierto de matriz extracelular. Luego, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante tres días. Al final de la incubación, reemplace el medio de cultivo celular libre de alimentadores por ocho mililitros de medio de inducción de mesodermo presomético, e inicie la diferenciación del mesodermo presomimático en la incubadora de cultivo celular durante los siguientes cuatro días, cambiando el medio en el tercer día.
Al final de la incubación, aísle las células positivas de la proteína 1 similar al delta por citometría de flujo y recoja las células ordenadas por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro de medio de inducción de mesodermo somiático para el recuento, y sembrar una por 10 a la quinta célula en cada pozo de una placa de 12 pozos recubierta con solución de matriz extracelular que contenga un mililitro de medio de inducción de mesodermo somiático complementado con 10 micromolares de la rhosa, o ROCK, inhibidor Y-27632. Luego, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante cuatro días más, cambiando el medio que no contiene el inhibidor en los días uno y tres del cultivo.
Para la diferenciación del sindetomo de las células esclerotomosas, lave las células esclerotomas con PBS antes de separar las células con 0,2 mililitros de reactivo de disociación celular por pozo. Después de tres minutos a temperatura ambiente, agregue 0,8 mililitros de medio basal definido químicamente a cada pozo, y desasocie las células con un rascador celular. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación, y resuspendir el pellet en un mililitro de media de inducción sindetome para el recuento.
Semilla cinco veces 10 a la cuarta célula en cada pozo de una placa de 24 pozos recubierta con solución de matriz extracelular que contiene un mililitro de media de inducción de sindetomo uno, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular durante tres días. En el tercer día de inducción del sindetome, reemplace el medio por el medio de inducción del sindetome dos, y devuelva la placa a la incubadora durante 18 días, cambiando el medio cada tres días. Después de la diferenciación del mesodermo pres omótico, más del 85% de las células son positivas para la proteína 1 similar al delta, un marcador de mesodermo pres omótico, pero negativo para PAX3, un marcador de mesodermo somitico.
Esta población se convierte en células de mesodermo somiáticos positivas PAX3 después de cuatro días de inducción somitica del mesodermo. Además, la tinción de cadherina-11, un marcador de mesodermo somiático epitelializado, sólo se acumula en las uniones de célula a célula, después de la adición de CHIR99021. La diferenciación hacia dermomyotome, miotomo, dermatoma, esclerótomo y sindetome se puede evaluar mediante inmunocitoquímica y fluorescencia PAX3.
Al igual que los fibroblastos dérmicos humanos, las células dermatomas derivadas del iPSC producen colágeno y ácido hialurónico evaluado por ELISA. Para demostrar la reactividad comparable del sindetomo humano derivado de iPSC y los tenocitos adultos humanos, se puede realizar un ensayo mecánico de estimulación por estiramiento. Antes de la transmisión de iPSC, confirme que la confluencia del cultivo está entre el 70 y el 80% y las células divididas en la relación uno-a-dos a uno-cuatro en consecuencia.
Este passaging es fundamental para la diferenciación exitosa de iPSCs. Para futuras terapias basadas en células que utilizan este método, es necesario establecer una nueva condición libre de gérmenes que no incluya ningún componente derivado de animales no humanos.
