Induktion av somitderivat från inducerade pluripotenta stamceller, eller iPSC, är ett kritiskt steg för att använda pluripotenta stamceller för regenerativ terapi eller sjukdomsforskningsapplikationer. Denna teknik kan användas för att differentiera mänskliga iPS-celler till somitderivat som myotome, dermatome, sclerotome och syndetomeceller under kemiskt definierade förhållanden. Med hjälp av iPSC som fastställts från en patient som lider av en svårbehandlade muskuloskeletala sjukdom, denna metod kan användas för modellering av fenotyp av sjukdomen och för att testa de nya läkemedelsterapier.
Denna metod kan också tillämpas för att främja vår förståelse av biologi och de mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av paraxial mesoderm under mänskliga embryogenesis. Fyra dagar före start presomitic mesoderm induktion, päls en 10-centimeters maträtt med fyra milliliter extracellulärmatris lösning för en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, ersätta extracellulär matrislösning med åtta milliliter av feeder-fri cell odling medium.
För att börja matarfri odling, tvätta den mänskliga iPSC-kulturen med PBS, och tillsätt en milliliter CTK-lösning till kulturrätten. När cellerna börjar lossna från skålen botten, tvätta kulturen två gånger med färska PBS att helt ta bort alla SNL feeder celler innan du lägger till en milliliter av feeder-fri cell kultur medium till skålen. Använd en cellskrapa för att manuellt ta bort stamcellerna och överför cellerna till ett koniskt rör på 15 milliliter.
Försiktigt pipettera celllösningen tre gånger med en 1, 000-mikroliter pipett spets, och överföra cellerna till extracellulära matris-belagda kultur skålen. Sedan, tillbaka cellerna till cellkulturen inkubatorn i tre dagar. I slutet av inkubationen, ersätta matarfritt cellodlingsmedium med åtta milliliter presomitic mesoderm induktionsmedium, och initiera presomitisk mesoderm differentiering i cellkulturen inkubatorn för de kommande fyra dagarna, ändra mediet på dag tre.
I slutet av inkubationen, isolera delta-liknande protein 1 positiva celler genom flödescytometri, och samla de sorterade cellerna genom centrifugeringen. Resuspend pelleten i en milliliter av somitisk mesoderm induktionsmedium för räkning, och utsäde en gånger 10 till de femte cellerna i varje brunn av en extracellulär matris lösningsöverdragna 12-brunns platta som innehåller en milliliter somitic mesoderm induktionsmedium kompletteras med 10 mikromol av rho kinase, eller ROCK, hämmare Y-27632. Sedan, tillbaka cellerna till cellodlingen inkubatorn i fyra dagar, ändra mediet inte innehåller hämmaren på dag ett och tre av kultur.
För syndetomdifferentiering från sclerotomeceller, tvätta sclerotomecellerna med PBS innan du lossar cellerna med 0,2 milliliter cellavsöndringsreagens per brunn. Efter tre minuter i rumstemperatur, tillsätt 0,8 milliliter kemiskt definierade basalt medium till varje brunn, och lossa cellerna med en cellskrapa. Överför cellerna till ett koniskt rör på 15 milliliter för centrifuger, och återanvänd pelleten i en milliliter av syndetominduktionsmedium en för räkning.
Frö fem gånger 10 till de fjärde cellerna i varje brunn av en extracellulär matris lösning-belagda 24-brunnsplatta som innehåller en milliliter av syndetom induktion medium ett, och returnera plattan till cellodling inkubatorn i tre dagar. På dag tre av syndetom induktion, ersätta mediet med syndetom induktion medium två, och returnera plattan till inkubatorn i 18 dagar, ändra mediet var tredje dag. Efter presomitic mesoderm differentiering, över 85%av cellerna är positiva för delta-liknande protein 1, en markör för presomitic mesoderm, men negativt för PAX3, en markör för somitic mesoderm.
Denna population blir PAX3 positiva somitic mesoderm celler efter fyra dagar av somitic mesoderm induktion. Vidare, färgning av cadherin-11, en markör av epitelialiserad somitic mesoderm, ackumuleras bara vid cell-till-cell korsningar, efter tillsats av CHIR99021. Differentiering mot dermomyotome, myotome, dermatome, sclerotome och syndetome kan bedömas genom immunocytochemistry och PAX3 fluorescens.
Liknar humana dermal fibroblaster, iPSC-härledda dermatome celler producerar kollagen och hyaluronsyra som bedöms av ELISA. För att visa den jämförbara reaktiviteten hos human iPSC-härledda syndetom och mänskliga vuxna tenocyter, kan en mekanisk stretch stimulering analys utföras. Innan iPSC passaging, bekräfta att kulturen confluency är mellan 70 till 80%och de delade cellerna vid en-till-två till en-till-fyra förhållande därefter.
Denna passaging är avgörande för framgångsrik iPSCs differentiering. För framtida cellbaserade terapier med denna metod är det nödvändigt att fastställa ett nytt könsfritt tillstånd som inte omfattar några komponenter som härrör från icke-mänskliga djur.