Name: an oncogenic hepatocyte-induced orthotopic mouse model of hepatocellular cancer arising in the setting of hepatic inflammation and fibrosis
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00
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Ce travail est soutenu par NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) et NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

REMARQUE: Toute la procédure, y compris les sujets animaux ont été approuvés par l'IACUC à l'Université du Missouri. Toutes les souris ont reçu des soins humains selon les critères décrits dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire». La procédure suivante pour l'isolement cellulaire et l'inoculation doit être effectuée dans une hotte. Tous les artistes interprètes ou exécutants doivent porter l'équipement de protection individuelle standard pour la manipulation des souris et ...

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Realizing the promise. 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(2015).</li><li>Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+checkpoint+inhibitors+in+challenging+populations.">Immune checkpoint inhibitors in challenging populations.</a> Cancer. 123, 1904-1911 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death-1+(PD-1)+checkpoint+blockade+in+combination+with+an+mTOR+inhibitor+restrains+hepatocellular+carcinoma+growth+induced+by+hepatoma+cell-intrinsic+PD-1.">Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1.</a> Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).</li><li>Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mouse+models+for+hepatocellular+carcinoma+research.">Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inCVAX,+in+situ+cancer+vaccine,+and+its+immune+response+in+mice+with+hepatocellular+cancer.">Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer.</a> Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+radiofrequency+ablation+platform+in+a+clinically+relevant+murine+model+of+hepatocellular+cancer.">Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer.</a> Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sunitinib+represses+regulatory+T+cells+to+overcome+immunotolerance+in+a+murine+model+of+hepatocellular+cancer.">Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer.</a> Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).</li><li>Staveley-O'Carroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+ligation+of+CD40+enhances+priming+against+the+endogenous+tumor+antigen+and+promotes+CD8++T+cell+effector+function+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice.">In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).</li><li>Avella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+established+hepatocellular+carcinoma+is+induced+by+chemoimmunotherapy+in+an+orthotopic+murine+model.">Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model.</a> Hepatology. 55, 141-152 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+chemoimmunotherapy+against+hepatocellular+cancer+in+a+novel+murine+model.">Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model.</a> Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice.">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li><li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein/SV40+T+antigen+hybrid+gene.">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li><li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li></ol>

Avec ce protocole, nous avons établi un modèle murine fiable et reproductible de HCC qui imite l'initiation et la progression humaines de HCC. Cliniquement, de nombreux facteurs de risque induisent successivement des lésions hépatiques, la fibrose hépatique, la cirrhose et l'étape finale de HCC. Dans notre protocole, l'injection IP de CCl4 est utilisée pour produire d'abord la fibrose hépatique chez les souris de type sauvage, ce qui permet aux hépatocytes oncogènes suivants de former les tumeurs dan...

Le cancer hépatocellulaire (HCC) est le type de cancer le plus rapidement croissant aux États-Unis (US)1,2,3. Chaque année, environ 850 000 nouveaux cas sont diagnostiqués4,5 et 700 000 patients meurent de cette maladie mortelle6,7,8,9,10 , ce qui en fait la deuxième cause de décès lié au cancer dans le monde. La gestion de HCC inclut la résection chirurgicale, la transplantation, l'ablation, la chimioembolization, ou les thérapies systémiques, telles que le sorafenib11. Le diagnostic et la gestion tôt avec la résection ou la transplantation chirurgicale ont l'avantage global de survie le plus élevé4. Malheureusement, la majorité des patients présents à un stade ultérieur et nécessitent une prise en charge avec ablation, chimioembolisation ou sorafenib12. Sorafenib, un inhibiteur de la tyrosine kinase récepteur (RTKI), a été approuvé par la Food and Drug Administration en 2008 comme la seule thérapie médicamenteuse systémique disponible pour le traitement de HCC non résécable. Bien que le médicament ne prévoit qu'une légère augmentation de la survie globale, de 7,9 à 10,7 mois13, il a fourni une nouvelle stratégie thérapeutique qui pourrait être utilisé pour gérer HCC.
Manipuler le système immunitaire pour éliminer les cancers établis est un domaine en croissance rapide dans la recherche sur le cancer14. Les études de point de contrôle immunitaire ont considérablement avancé le développement de médicaments immunothérapeutiques dans le traitement du cancer15,16. La FDA a approuvé l'utilisation d'anticorps (Abs) contre l'antigène cytotoxique T-lymphocyte 4 (CTLA-4), la protéine de mort cellulaire programmée 1 (PD-1), et son ligand PD-L1 pour le traitement du mélanome, du cancer du poumon, du cancer de la tête et du cou, et du cancer de la vessie17, 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20. Les essais cliniques de monothérapie ou de thérapie combinée utilisant un ou plusieurs anticorps contre PD-1, PD-L1, ou CTLA-4 pour le traitement du HCC avancé sont en cours21,22,23, et certains essais ont donné des résultats favorables. En 2017, la FDA a accordé l'approbation accélérée pour l'anticorps anti-PD-1 pour traiter les patients HCC, qui sont la résistance au sarafenib, mais le taux de réponse global de cette thérapie est seulement 14,3%. D'autres stratégies n'ont pas été traduites en pratique clinique pour le moment24,25. Surmonter la tolérance immunitaire profonde induite par la tumeur pour améliorer la thérapie de point de contrôle immunitaire26; prédire l'efficacité du traitement de contrôle immunitaire; prévenir les effets indésirables liés au système immunitaire; l'optimisation de l'itinéraire, de la posologie et de la fréquence de l'administration; et trouver des combinaisons efficaces de thérapies27,28,29 restent toutes des tâches extrêmement difficiles.
Il existe plusieurs approches conventionnelles utilisées pour induire HCC dans les modèles de souris actuellement et sont utilisés en fonction de la question de recherche particulière de l'enquêteur30. Les modèles chimiquement induits de souris de HCC avec des composés génotoxiques imitent la malignité injury-induite. Les modèles de xénogreffe par l'implantation ectopique ou orthotopic des lignées de cellules de HCC sont appropriés pour le criblage de drogue. Un certain nombre de souris génétiquement modifiées ont été conçues pour étudier la physiopathologie de HCC. Les souris transgéniques exprimant des gènes viraux, des oncogènes et/ou des facteurs de croissance permettent d'identifier les voies impliquées dans l'hépatocarcinogenèse. En raison des limitations inhérentes, ces modèles ne récapitulent pas les caractéristiques immunitaires typiques vues dans HCC humain, qui a considérablement empêché l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement des stratégies immunothérapeutiques innovatrices14 ,15. Nous avons récemment créé un modèle de murine cliniquement pertinent. Ce nouveau modèle imite non seulement l'initiation et la progression humaines de HCC mais reflète également les dispositifs les plus typiques de la maladie humaine comprenant le dysfonctionnement immunisé. Nous avons caractérisé ses caractéristiques biologiques et immunologiques. S'appuyant sur ce nouveau modèle, nous avons exploré diverses stratégies immunothérapeutiques pour traiter HCC31,32,33,34,35,36, 37. Cette plate-forme unique nous permet d'étudier les mécanismes de l'immunotolérance induite par la tumeur et de développer des stratégies thérapeutiques de preuve de concept pour HCC vers la traduction clinique éventuelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:848px;" width="847">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Anesthesia machine</td>
			<td style="width:123px;">VETEQUIP</td>
			<td style="width:344px;">IMPAC6</td>
			<td style="width:167px;">anesthesia machine for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>8122963</td>
			<td>Needle used for liver perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664&#160;</td>
			<td>mice used in prototol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carprofen</td>
			<td>CRESCENT CHEMICAL</td>
			<td>20402</td>
			<td>carprofen for pain release</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer&#160;</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>REF 431751</td>
			<td>Cell strainer, 70&#181;m, for hepatocytes isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td>centrifuge for cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clips&#160;</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>REF 523700</td>
			<td>Titanium Clips for spleen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Primovert&#160;</td>
			<td>microscope for cell observation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Mtd2 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305109</td>
			<td>BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J303H</td>
			<td>coated VICRYL suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SV40 T Ag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16879</td>
			<td>anti-SV40 T-antigen antibody for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309626</td>
			<td>1 mL TB syringe for cell injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T 8154</td>
			<td>Trypan blue solution for cell viability test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wound clips</td>
			<td>Reflex</td>
			<td>reflex9, Part. No. 201-1000</td>
			<td>stainless steel wound clips for wound close</td>
		</tr>
	</tbody>
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an oncogenic hepatocyte-induced orthotopic mouse model of hepatocellular cancer arising in the setting of hepatic inflammation and fibrosis

L'absence d'un modèle animal cliniquement pertinent traitant des caractéristiques immunitaires typiques du cancer hépatocellulaire (HCC) a considérablement entravé l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement de stratégies immunothérapeutiques novatrices. Pour développer un modèle animal idéal récapitulant le HCC humain, les souris mâles immunocompétentes C57BL/6J reçoivent d'abord une injection de tétrachlorure de carbone (CCl4) pour induire la fibrose hépatique, puis reçoivent des hépatocytes oncogènes histologiquement normaux de jeunes mâles Souris transgéniques d'antigène de T (TAg)-genos (MTD2) par inoculation intra-splénique (ISPL). Les androgènes produits chez les souris mâles destinataires à la puberté initient l'expression de TAg sous le contrôle d'un promoteur foie-spécifique. En conséquence, les hépatocytes transférés deviennent des cellules cancéreuses et forment des masses de tumeur dans le cadre de la fibrose/cirrhose de foie. Ce nouveau modèle imite l'initiation et la progression humaines de HCC dans le contexte de la fibrose/cirrhose de foie et reflète les dispositifs les plus typiques de HCC humain comprenant le dysfonctionnement immunisé.

Des hépatocytes oncogéniques isolés chez des souris transgéniques TAg (figure 2) ont été ensemencés dans le foie de souris de type sauvage par injection intra-splénique (figure 3). Les hépatocytes transplantés avec succès et fiable augmenté tumeurs orthotopiques HCC (Figure 4) avec la tumeur spécifique antigène SV40 TAg (Figure 5) dans le cadre de l'inflammation hépatique et la fibrose ( Figure1).
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An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

Ici, nous décrivons le développement d'un modèle de murine médicalement pertinent du cancer du foie récapitulant les dispositifs immunisés typiques du cancer hépatocellulaire (HCC).

Un modèle orthotopic de souris orthopique d'hépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de l'inflammation et de la fibrose hépatiques

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

L’utilisation juste d’un modèle pour développer un modèle hépatocellulaire de masse de cancer pourrait aider des personnes élucider leur immunotolerance tumeur-induite et traitement spécifique induit, n’importe quelle immunoresponses de tumeur. La tumeur orthotopique qui se développe avec la technique de fibrose hépatique imite les caractéristiques cliniques du cancer du foie humain. Cette méthode pourrait fournir un outil utile dans l’étude immunologique hépatocellulaire de cancer.La démonstration visuelle de cette méthode peut illustrer les étapes plus techniquement difficiles, telles que l’injection intrasplenique, qui sont essentielles pour une exécution réussie de ce protocole. Ensuite, retenez manuellement un mâle, de six à huit semaines C57 noir 6 souris dorsale côté vers le haut. Utilisez d’autres gommages à 70 % d’éthanol et de bétadine pour nettoyer le site d’injection à trois reprises.Livrez ensuite 160 microlitres de tétrachlorure de carbone à la souris par injection intraperitoneal et retournez l’animal dans sa cage d’origine. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, chez une souris transgénique simienne de cinq mois 40 T, placez la souris en position supine et fixez les membres avec du ruban adhésif. Faire une incision de laparotomie médiane le long de la longueur de l’alba linea, assez grand pour fournir une exposition adéquate du foie, et déplacer les intestins vers la gauche.Disséquer au-dessus du foie pour l’exposition au cava vena inférieur. Induire une pince d’artère pour ligate le navire. Utilisez une aiguille papillon pour obtenir un accès intraveineux à la veine du portail et fixez manuellement le cathéter.Changer soigneusement les seringues pour chaque solution, livrer avec succès 15 millilitres de solution un, 15 millilitres de 0,75%collagenase solution deux, et 15 millilitres de solution deux sans collagène via cathéter, à un taux d’écoulement d’environ 8,9 millilitres de solution par minute. À la fin de la perfusion, récolter la masse tumorale dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 à 15 millilitres de PBS. Exciser la tumeur de la prochaine souris MTD2 comme vient de le démontrer.Utilisez des ciseaux pour couper les foies en petits morceaux. Transférer les tissus dans un nouveau récipient de PBS frais pour enlever le reste du sang du tissu avant de transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieu rpmi complet. Hacher les échantillons de foie lavés jusqu’à ce que les morceaux puissent s’insérer facilement à travers la pointe d’une pipette de cinq millilitres.Ajouter suffisamment de milieu au tube pour atteindre un volume final de 30 millilitres. Utilisez une pipette de cinq millilitres pour triturer les fragments de tissu, avant de filtrer la solution à travers une passoire de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver la passoire plusieurs fois avec un milieu complet.Réglez le volume final à 50 millilitres avec un support complet supplémentaire. Faites tourner rapidement la suspension par centrifugation jusqu’à un maximum de 50 fois g avant d’arrêter la centrifugeuse et de décanter le supernatant. Puis resuspendez la pastille en 20 millilitres de PBS pour le comptage.Pour l’injection intrasplenique des hépatocytes MTD2, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 par animal receveur avec 220 microlitres d’hépatocytes par souris. Confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez un animal anesthésié traité au tétrachlorure de carbone. En commençant juste en dessous du muscle de la colonne vertébrale, ensuite, faire une incision d’un centimètre sur le flanc gauche parallèle à la treizième côte de l’extrême dorsale et utiliser des forceps émoussés pour extérioriser la rate.Couper la rate avec deux clips de titane de taille moyenne entre l’artère splénique et la veine, et livrer 200 microlitres de cellules dans le pôle inférieur de la rate. Coupez la branche inférieure du pédule avec un clip de taille moyenne et coupez la rate entre les deux clips initialement placés. Enlever le pôle inférieur de la rate qui a été directement injecté avec des cellules tumorales et utiliser 3-0 polyglactine 910 interrompu suturing pour fermer la couche musculaire interne.Utilisez ensuite des pinces à plaies en acier stérilisées pour fermer la couche externe de la peau et administrer sous-cutanéement cinq milligrammes par kilogramme de carprofène. Après isolement des souris transgéniques d’antigène de T comme démontré, les hépatocytes et les cellules d’infiltration de tumeur peuvent être observés. Les cellules démontrent généralement une viabilité de près de 100% après traitement.Après l’inoculation intrasplenique dans les animaux traités au tétrachlorure de carbone de type sauvage, les hépatocytes transplantés cultivent avec succès et fiabilité des tumeurs orthotopiques du carcinome hépatocellulaire qui expriment l’antigène 40 T du virus simien spécifique à la tumeur. La préparation de notre population viable et pure d’hépatocytes de la masse MTD2 et l’administration précise de l’injection intrasplenique sont importantes pour le succès de la procédure. Bien que notre équipe ait testé l’inoculation d’hépatocyte dans les souris destinataires par injection intravasculaire et intraperitoneal, ces autres méthodes n’ont pas pu induire le carcinome hépatocellulaire orthotopique.Ce modèle fournit une plate-forme unique permettant l’investigation pour la surveillance immunisée et la tolérance dans ses premiers et les derniers stades de la progression de tumeur. S’il vous plaît être prudent lors de l’utilisation du tétrachlorure de carbone, car il est toxique.

Research

JoVE Journal

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